Abstract

Purpose

O tetraspanina CD151 atua como um promotor de metástase e invasão em vários tumores. No entanto, o papel de CD151 no câncer gástrico humano (HGC) permanece obscuro.

Métodos

espécimes Vinte HGC e não tumorais amostras, células gástricas humanas combinados epiteliais (HGeC), e quatro células de câncer gástrico linhas foram usadas para analisar a expressão de CD151. downregulation curto hairpin RNA mediada de expressão CD151 em células HGC foi realizada para examinar o papel do CD151 na proliferação e metástase /invasão de células HGC

in vivo

e

in vitro

. A relação de CD151 com integrina α3 em células HGC foi investigada pelo silenciamento α3 integrina seguida por co-imunoprecipitação e imunofluorescência. Finalmente, o valor prognóstico do CD151 e α3 integrina foi avaliada por imuno-histoquímica em microarrays de tecido de 76 pacientes HGC.

Resultados

CD151 foi expresso em níveis mais elevados em tecidos e células HGC HGC do que em não tumorais tecidos e células HGeC. A sub-regulação de CD151 por vshRNA-CD151 metástase prejudicada e invasão de células HGC-27, mas não afecta a proliferação celular. CD151 formado um complexo com a integrina nas células α3 HGC. CD151-cDNA transfecção resgatou o metastático invasão potencial e de células HGC-27-vshCD151, mas não aqueles de células a3 HGC-27-vshintegrin

in vitro

. Clinicamente, CD151 superexpressão foi significativamente correlacionada com estágio de alta TNM, profundidade de invasão e comprometimento de linfonodos positivos (

p Art 0,05), e altos níveis de α3 integrina foram associados com o tamanho do tumor grande, estágio de alta TNM, profundidade do envolvimento invasão e linfonodo (

p Art 0,05). Importante, o pós-operatório de 5 anos a sobrevida global de pacientes com CD151

baixa e /ou integrina α3

baixa foi maior do que a de pacientes com CD151

alta e /ou integrina α3

alta.

Conclusão

CD151 está positivamente associada com a invasão de HGC, e CD151 ou a combinação de CD151 e integrina α3 é um novo marcador para prever o prognóstico de pacientes HGC e podem ser potenciais alvos terapêuticos.

Citation: Yang YM, Zhang ZW, Liu QM, Sun YF, Yu JR, Xu WX (2013) sobre-expressão de CD151 prediz prognóstico em pacientes com recessionada câncer gástrico. PLoS ONE 8 (3): e58990. doi: 10.1371 /journal.pone.0058990

editor: Yves St-Pierre, INRS, Canadá |

Recebido: 07 de outubro de 2012; Aceito: 08 de fevereiro de 2013; Publicação: 22 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Fundo Workstation acadêmico do Hospital das Shaoxing Segundo Popular. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer gástrico humano (HGC) é a causa mais frequente de morte relacionada ao câncer [1]. A incidência de HGC foi estimada em 934.000 casos por ano, com 56% dos novos casos ocorrendo no leste da Ásia, incluindo 41% na China e 11% no Japão [2]. Embora a incidência global da GC tem diminuído nos últimos anos, a sua taxa de mortalidade na China é o maior entre todos os tumores e representa 25% da mortalidade GC em todo o mundo [3]. Apesar dos recentes avanços na quimioterapia e técnicas cirúrgicas, a taxa de 5 anos a sobrevida global (OS) na China é baixa em 40%. A maioria dos HGCs são diagnosticados em estágio III ou IV, ea taxa de metástase ganglionar de GC é alta (50-75%) [4]. A patogênese da HGC é multifatorial incluindo predisposição genética e fatores ambientais. Várias alterações genéticas estão associados com a predisposição para HGC, incluindo aqueles que envolvem os genes supressores de tumores, oncogenes, moléculas de adesão celular, factores de crescimento, e instabilidade genética [5]. Portanto, obtenção de uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na HGC e identificação de marcadores de diagnóstico valiosas e novas estratégias terapêuticas é de grande importância clínica.

Tetraspanins são proteínas de superfície celular que atravessam a membrana quatro vezes, e são encontrados em vários tipos de células em muitos organismos. Eles exibem numerosas propriedades indicativas da sua importância fisiológica na adesão celular, motilidade, a activação e a proliferação, bem como a sua contribuição para condições patológicas tais como a metástase e angiogénese patológica [6], [7], [8]. CD151 é uma glicoproteína de superfície celular que pertence à superfamília tetraspanina que foi exibido pela primeira vez para promover metástases em um estudo no qual um anticorpo desconhecido especificamente inibiu a formação de metástases em um carcinoma epidermóide humano

in vivo

[

9

]. O anticorpo reconheceu CD151 e inibiu a migração de células sem afectar a proliferação ou a adesão. Pequeno ARN interferente (siRNA) a regulação negativa da expressão mediada por CD151 em melanócitos primários resultou na perda de motilidade, enquanto teve pouco efeito sobre os níveis de estado estacionário de integrinas. Além disso, estas alterações podem ser revertidos quando CD151 foi re-expressa [10]. A sobre-expressão de CD151 foi mostrado activar a integrina e o receptor de factor de crescimento de vias de sinalização dependentes, o que resultou no aumento da motilidade e invasividade de células cancerosas [11]. Este processo foi também sugerida para contribuir para a activação das vias mediadas por GTPases pequenas, o que aumenta a ligação a Cdc42 e Rac, organizadores do citoesqueleto celular GTP. A activação dependente de Ras-adesão, ERK /MAPK1 /2 e proteina quinase B (PKB) /Akt tem sido mostrado para ser modulada por CD151 [7], [12]. A vasta gama de funções de CD151, e em particular o seu envolvimento na capacidade de invasão e metástases de células cancerosas, sugerem que uma melhor compreensão do papel e a sua expressão em HGC pode ser importante.

No presente estudo, nós investigada a expressão de CD151 nas células epiteliais gástricas humanas (HGeC), linhas celulares, amostras de HGC GSC, e tecidos não tumorais adjacentes. Além disso, nós explorado o efeito de silenciamento de ARNsi CD151 sobre a proliferação, capacidade de invasão e a capacidade metastática de células HGC-27, e examinaram o relacionamento entre a CD151 e α3 integrina. Finalmente, a expressão de CD151 e integrina α3 foi examinada por imuno-histoquímica em um tissue microarray consistindo de 76 casos de HGC, e o papel prognóstico do CD151 e /ou integrina α3 no HGC foi investigada.

Materiais e Métodos

linhas celulares

linhas celulares HGeC e HGC, incluindo HGC-27, AGS, MKN28 e MGC803, foram obtidas a partir da American Type Culture Collection e mantidos em nosso laboratório. Todas as linhas celulares foram mantidas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, Invitrogen) suplementado com 10% de soro bovino fetal (Hyclone) a 37 ° C numa incubadora humidificada sob 5% de CO

2.

Pacientes e Follow-up

Vinte amostras de tumores frescos de áreas próximas à margem do tumor e tecidos combinados não-tumorais (mais de 3 cm de distância do tumor) foram cegamente obtidos de pacientes consecutivos com HGC submetidos à ressecção curativa entre fevereiro 2009 e Novembro de 2010, Shaoxing Hospital Segundo Popular (Shaoxing, China). Outros 76 pacientes com câncer gástrico submetidos à ressecção R0 com estendido dissecção de linfonodos (D2) entre setembro de 2005 e setembro de 2008 em Shaoxing Hospital Segundo Popular foram incluídos neste estudo. A avaliação de espécimes ressecados foi realizada de acordo com as diretrizes da Associação Japonesa de Câncer Gástrico (1998). Cada ressecção padrão envolveu a remoção dos nodos grupo 1 e 2 linfáticos (gama 36-60, média 47,6). classificação etapa foi realizada de acordo com a classificação TNM para HGC (UICC). Os espécimes foram selecionados com base na disponibilidade de tecidos adequados fixados em formalina e embebidos em parafina e clínico-patológica completa e follow-up dados dos pacientes. As características dos sujeitos do estudo foram resumidos na tabela 1. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Shaoxing segundo de Pessoas Hospital de Ética em Pesquisa e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os indivíduos. Nenhum dos pacientes tratados com quimioterapia ou radioterapia, antes ou após a cirurgia como parte de um programa de adjuvante. recolha de dados de acompanhamento foi encerrado em setembro de 2012. A mediana de acompanhamento foi de 43,0 meses (intervalo de 6-78 meses). procedimentos de acompanhamento consistiu de história interino, exame físico, avaliação de marcadores tumorais (CEA, CA-199), ultra-sonografia abdominal e radiografia do tórax a cada 2-3 meses ou CT a cada 6 meses. A sobrevida global (OS) foi definido como o intervalo entre a cirurgia ea morte ou entre a cirurgia ea última observação em pacientes sobreviventes. Os dados foram censurados no último follow-up para os pacientes vivendo.

Extração de RNA e transcrição reversa da polimerase Reacção em Cadeia (RT-PCR)

O RNA total foi extraído utilizando o TRI Reagent (Sigma) de acordo com o protocolo do fabricante. O ARN foi, em seguida, tratada com a ADNasel (Roche Diagnostics), purificado através de uma coluna RNeasy (Qiagen) e a electroforese para determinar a integridade do ARN antes do uso em experiências de 5′-RACE. O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado a partir de 2 ug de ARN total, utilizando hexâmeros aleatórios (Proligo) e SuperScript III Transcriptase Reversa (Invitrogen). RT-PCR foi realizada num painel de linhas celulares de tumor e amostras. Os iniciadores utilizados para a PCR foram as seguintes: CD151, 5′-ACTTCATCCTGCTCCTCATCAT-3 ‘e 5′-TCCGTGTTCAGCTGCTGGTA-3′; integrina α3, 5’-CGAGAGGAAAGAGGAAGTAGGGGGT-3 ‘e 5′-ATGAAGAAGGAGTGAGGGGTGAGCA-3′; Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), 5’-GGCATCCTGGGCTACACTGA-3 ‘e 5′-GTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’. As condições de RT-PCR foram as seguintes: 10 min a 94 ° C, a desnaturação a 94 ° C durante 20 s, hibridação a 59 ° C durante 30 s e extensão a 72 ° C durante 60 s. A expressão de CD151 e integrina α3 relação ao GAPDH gene housekeeping foi analisado por análise de densidade usando o software v5.0 Banda Scan. Todas as experiências foram realizadas em triplicado.

imunotransferência e imunofluorescência

de proteína total extracto celular (30 ug) foi separada por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida, transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno, e incubadas com o anticorpos correspondentes. As membranas foram desenvolvidos com o método de quimioluminescência aumentada (Pierce, Rockford, IL, EUA). De ratinho anti-humano CD151 (11G5a, 1:200; Serotec, Reino Unido) e anti-integrina a3 anticorpos monoclonais (P1B5, 1:300; Chemicon International, Temecula, CA) foram utilizados para detectar a expressão de CD151 e integrina α3, respectivamente . GAPDH (1:5,000; Chemicon, EUA) foi usada como um controlo interno. Todas as experiências foram realizadas em triplicado.

células HGC-27 foram usados ​​para detectar a localização de CD151 e integrina α3 como descrito anteriormente [13]. De ratinho anti-humano CD151 anticorpo monoclonal (11G5a, 1:200; Serotec, Reino Unido) e de anticorpo de integrina α3 de ratinho anti-humano (P1B5, 1:300; Chemicon International, Temecula, CA) foram usadas. As fatias foram analisados ​​por microscopia de fluorescência (Leica Microsystems Imaging Solutions).

A transfecção de Lentivirus vetores com Pequeno Hairpin RNA contra CD151 e integrina α3

O vector pGMLV /Neo-shRNA-CD151 foi construído de acordo com as instruções do fabricante (pGMLV, um pequeno ARN de gancho de cabelo (shRNA) i Vector, Xangai Genomeditch Co. Ltd). Três vetores de lentivírus shRNA-CD151 (pGMLV-GFP-shRNA -CD151) foram geradas para silenciar a expressão de CD151 em células HGC-27 (shRNA-CD151-HGC-27). As sequências de direccionamento para CD151 shRNA foram como se segue: # 1, 5′-CATGTGGCACCGTTTGCCT-3 ‘; # 2, 5’-TACCTGCTGTTTACCTACA-3 ‘; # 3, 5’-CATACAGGTGCTCAA AATA-3 ‘. A sequência de direccionamento para a integrina shRNA α3 foi como se segue: 5’-CCTCTATATTGGGTACACGAT-3 ‘(Xangai Genomeditech, Xangai, China). Estavelmente transfectadas clones foram caracterizados por RT-PCR e analisados ​​por imunotransf erência para os níveis de expressão do CD151 e proteínas de integrina a3.

Ensaio MTT, a migração celular, invasão de Matrigel e Assays

As células foram semeadas em placas de 96 poços (2.000 por 200 ul-poço) e incubou-se durante 24, 48, e 72 h. Um volume de 20 jil de solução de MTT foi adicionado nos pontos de tempo indicados e incubadas durante 4 h. O (DMEM 200 ul contendo 10% de soro fetal de bovino) o meio foi então substituído por 150 ul de DMSO, as placas foram agitadas durante 10 min e a absorvância a 490 nm foi medida para determinar o número de células viáveis ​​em cada poço. Todos os experimentos foram realizados três vezes.

A migração celular foi avaliada através de um ensaio de cicatrização. As células foram cultivadas até 80-90% de confluência em placas de 24 poços. Uma ferida foi feita por arrastando uma ponta de pipeta de plástico através da superfície da célula. As restantes células foram lavadas três vezes para remover os detritos celulares e incubaram-se a 37 ° C com meio isento de soro. Nos tempos indicados, as células que migram na frente da ferida foram fotografadas e comparadas. Três experiências separadas foram realizadas

ensaios celular invasão foram realizadas utilizando transwells de 24 poços (tamanho 8 de poro; Millipore). Pré-revestidas com Matrigel (Falcon 354.480; BD Biosciences). Um total de 1 × 10

5 células foi então suspensa em 500 ul de DMEM contendo FBS a 1% e adicionadas à câmara superior, enquanto que 750 ul de DMEM contendo FBS a 10% foi colocada na câmara inferior. Após 48 h de incubação, Matrigel e as células restantes na câmara superior foram removidos por cotonetes. As células na superfície inferior da membrana foram fixadas em paraformaldeído a 4% e coradas com Giemsa. As células em 5 campos microscópicos (ampliação, × 200) foram contadas e fotografadas. Todos os experimentos foram realizados em triplicado.

In Vivo Metástase Ensaios

Para in vivo ensaios de metástase, MGC-803-Mock, MGC-803-vshRNACD151 e MGC-803-vshRNA CD151-cDNA- células CD151 foram transplantados para ratinhos nus (5 semanas de idade BALB /c-nu /nu, 5 por grupo, 1 × 10

6 células para cada ratinho), através da veia lateral da cauda [14]. Após 7 semanas, os ratinhos foram sacrificados. Os seus pulmões foram removidos e submetidos a hematoxilina e eosina (H E) de coloração. Toda pesquisa envolvendo animais foi realizada em conformidade com os protocolos aprovados pela Comissão Cuidado Animal Hospital das Shaoxing Segundo Popular.

Co-imunoprecipitação (Co-ip) Assays

As células foram lisadas com tampão de lise RIPA suplementado com NaF 40 mM, 100 mM Na

3VO

4, e completa Protease Inhibitor (Roche). Após a remoção do material insolúvel por centrifugação a 12.000 x g, os lisados ​​pré-aclarados com proteína foram incubadas pré-absorvido mAb primário A- e pérolas G-Sefarose (Pierce Biotechnology) durante a noite a 4 ° C. Os precipitados foram lavados três vezes com tampão de lise, fervidos em tampão de amostra 2 × de SDS durante 5 minutos, e as proteínas foram resolvidas por SDS-PAGE em géis de gradiente de 10%. imunoblots subsequentes foram sondadas com o anticorpo apropriado e detectado por ECL.

Construção de Tissue microarrays e imuno-histoquímica

Tissue microarrays foram construídos como descrito previamente [15]. Resumidamente, todas as amostras de pacientes HGC foram analisados ​​histologicamente por hematoxilina eosina, e áreas representativas foram pré-marcadas nos blocos de parafina, longe de materiais necróticas e hemorrágicas. Duplicados de cilindros de 1 mm de diâmetro a partir de duas áreas diferentes, o centro de tumor e a margem benigno mais próximo (designado como intratumoral e peritumoral, respectivamente; um total de quatro punções) foram incluídos em cada um dos casos, juntamente com diferentes controlos, para garantir a reprodutibilidade e coloração homogênea das lâminas (Shanghai Biochip Co. Ltd, Shanghai). Assim, quatro blocos de tissue microarray diferentes foram construídas, cada uma contendo 140 cilindros. As secções de 4 um de espessura foram colocadas em lâminas revestidas com 3-aminopropiltrietoxissilano. CD151 monoclonal de murganho anti-humano (11G5a, 1:200; Serotec, Reino Unido) e α3 rato anti-integrina humana (P1B5, 1:300; Chemicon International, Temecula, CA) foram utilizados anticorpos para detectar a expressão de CD151 e integrina α3 . As imagens foram capturadas pelo software Leica v3 QWin Plus. A intensidade de coloração positiva foi medida como descrito. A intensidade de CD151 e integrina α3 foi classificada em dois níveis de expressão de acordo com a área média da coloração positiva como o valor de corte, como se segue: CD151

elevada, 50% da secção do tumor; e integrina α3

elevada, 25% da secção do tumor; CD151

baixo, 50%, e integrina α3

baixo, 25% [15]

Análise Estatística

A análise estatística foi realizada com SPSS 16.0 software (. SPSS). Os valores foram expressos como a média ± desvio padrão. Para marcadores imuno-histoquímica, o ponto de corte para a definição dos subgrupos foi valor de intensidade mediana. A χ

2-teste e teste t de Student foram utilizados para comparações entre os grupos. OS foi definido como descrito anteriormente [15]. Significado prognóstico foi avaliada usando estimativas de sobrevivência de Kaplan-Meier e testes de log-rank. modelo de regressão de riscos proporcionais de Cox foi utilizado para analisar os fatores prognósticos independentes. Todos os testes foram bicaudais e

p Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

foi analisada Resultados

CD151 é abundante no HGC

expressão CD151. por RT-PCR e imunotransferência em HGC tumoral e tecidos não tumorais correspondentes. CD151 foi expressa em baixos níveis em tecidos não tumorais em comparação com tecidos HGC. Como mostrado na Fig. 1A, B e C, a expressão relativa da proteína CD151 em amostras HGC foi de 2,95 ± 0,21 (escala, 1,13-3,59) em comparação com 1,30 ± 0,09 (escala, 1,00-1,81) em amostras não tumorais, e a diferença foi estatisticamente significativa (

p Art 0,01). Além disso, os níveis de expressão de CD151 foram significativamente menores do que no HGeC em HGC-27, AGS, e MKN28 MGC803 células (p 0,05). Não houve diferenças nos níveis de expressão de CD151 foram detectadas entre as células HGC (Fig. 1D, E e F). O estudo imunoistoquímico (IHC) As análises confirmaram que a proteína CD151 foi expresso em níveis elevados nos tecidos do que em HGC combinado não tumorais tecidos (Fig. 1G).

(A) A expressão de ARNm e proteína CD151 em amostras de GC ea combinava amostras não tumorais; (B e C) um histograma mostrou CD151 ARNm em amostras de GC e as amostras não tumorais correspondentes (p 0,05); (D) RT-PCR e immunoblotting analisada a expressão de CD151 em HGeC e HGC-27, AGS, e MKN28 MGC803 células (p 0,05); (E e F) Um histograma mostrou CD151 mRNA e proteína na HGeC e HGC-27, AGS, MKN28 e MGC803 células (p 0,05).

CD151 Promovido a invasão e metástase de células HGC

in vitro e in vivo

Para examinar o papel do CD151 em células HGC, modificamos a expressão de CD151 em HGC-27 células por interferência de RNA e cDNA-CD151 transfecção (Fig. 2A) . Os resultados do ensaio de cicatrização da ferida apresentaram um atraso na velocidade de encerramento de feridas de células de shRNA-CD151-HGC-27 às 48 h comparado com células-HGC-27 Mock, o qual foi recuperado por ADNc de CD151 a transfecção (fig. 2B). A sub-regulação de CD151 tinha nenhum efeito significativo na proliferação de células (

P

0,05, Figura 2C.). No entanto, a regulação negativa da expressão de CD151 prejudicada a capacidade de invasão de células HGC-27 (Figuras 2D, E.)

(A) A expressão de CD151 em HGC-27 células por interferência de ARN e ADNc de CD151 transfecção.; (B) O baixo /ou aumento da regulação do CD151 não têm qualquer influência sobre a proliferação celular (

p Art 0,05); (C) O ensaio de cicatrização revelou que um atraso evidente na taxa de fechamento da ferida de células HGC-27-vshRNA-CD151 foi encontrado em 24 e 48h, em comparação com células HGC-27 Mock, ao mesmo tempo que foi recuperada pelo cDNA- CD151 transfecção; (D e E) de Matrigel ensaios de invasão mostrou que para baixo /ou a sobre-regulação da expressão de CD151 foi acompanhada por uma descida /ou invasão de células ascender HGC in vitro; (F e G) Cortes seriados de pulmão de rato mostrou a capacidade de metástase das células cancerosas que expressam diferentes (Barra de escala: 50 mm) CD151.

Para explorar ainda mais o papel de CD151 na metástase do tumor in vivo, MGC-803-Mock, MGC-803-vshRNACD151 e MGC-803-vshRNACD151-cDNA-CD151 células foram transplantadas em camundongos nus através da veia lateral da cauda. A análise histológica de pulmões de ratinhos confirmou que a sub-regulação de CD151 suprimida a formação de metástases pulmonares. O número e o tamanho dos nódulos metástases pulmonares foram significativamente menores no grupo MGC-803-vshRNACD151 quando comparado com células MGC-803-vshRNACD151-ADNc-CD151 (Figs. 2 F, G) MGC-803-Mock e. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que CD151 é um regulador positivo da metástase do câncer gástrico.

CD151 forma um complexo com integrina α3 e silenciamento de integrina α3 Prejudica HGC celular Invasion induzida por CD151 superexpressão

A envolvimento de tetraspanins na regulação mediada por integrina de metástases do cancro tem sido demonstrada, e α3β1 integrina foi mostrado para promover a invasão e metástase de GC [16]. Por isso, foi investigada a relação entre α3 integrina e CD151 nas células HGC. Como mostrado na Fig. 3A, α3 integrina foi expresso em níveis mais elevados em células do que em células HGC HGeC. experiências de co-imunoprecipitação mostraram que a CD151 formado um complexo com integrina α3 em HGC-27 células (Figs. 3B e C). Além disso, CD151 e α3 integrina co-localizado na membrana plasmática de células HGC-27 como se mostra através de imunofluorescência (Fig. 3D).

(A) A expressão da integrina α3 foram muito mais elevados em células HGeC e HGC ; (B e C) A co-IP identificado que a integrina α3 formar um complexo com α3 integrina; (D) A coloração por duas vezes indicada a CD151 e integrinα3 co-localizado na membrana de células HGC-27; (E) A sub-regulação da integrina nas células α3 HGC; ensaios de invasão (F) Matrigel mostraram que a infra-regulação da integrina α3 foi acompanhada por uma invasão descida de células HGC, os anticorpos de interferência integrina α3 e a3 integrina inibiu a invasão células dotados pelo CD151.

Para examinar ainda mais o envolvimento de CD151 em função integrina α3, as células foram sujeitas a interferência de ARN ou ADNc de transfecção e analisadas por experiências Transwell após a substituição da matriz de gel com laminina-332 [17]. Os resultados mostraram que o silenciamento de integrina α3 inibiu marcadamente a invasão de células HGC-27 e o ADNc CD151 transfecção resgatado a capacidade invasiva de HGC-27-vshRNACD151, mas não a de HGC-27-vshRNA integrina a3 células. Além disso, os anticorpos de integrina a3 inibiu a invasão de células HGC-27-vshRNACD151-ADNc-CD151 (Fig. 3E, F). Estes resultados sugerem que a função coordenada do complexo α3 CD151-integrina, e indicaram que níveis elevados de CD151 e integrina α3 estão associados com o aumento do potencial metastático de células de GC.

A expressão de CD151 ou Integrina α3 é positivamente associado com fenótipos malignos do HGC por imuno-histoquímica

A expressão de CD151 e integrina proteína α3 foi investigada em 76 pacientes HGC primário, utilizando microarrays de tecido (TMA). CD151 imunorreactividade de proteínas localizadas na membrana celular (Fig. 4A). Em tecidos de tumor, a expressão CD151 revelou heterogeneidade considerável nas diferentes amostras (Fig. 4a1, B1, C1 e D1). CD151

alta foi responsável por 50% (38/76) de toda a coorte. Como mostrado na Tabela 1, CD151

alta foi significativamente correlacionada com o tamanho do tumor (

p = 0,021

), profundidade da invasão (

p = 0,004

), comprometimento de linfonodos (

p = 0,028

) e estágio de alta tumor (

p =

0,002). No entanto, outras características clínicas, incluindo a idade, o sexo e a diferenciação do tumor, não foram significativamente relacionadas com a expressão de CD151.

(A) A imunorreactividade da proteína CD151 e integrinα3 foi localizado nas membranas celulares. Em tecidos de tumor, a expressão CD151 revelou heterogeneidade considerável nas diferentes amostras (Fig.4a1, B1, C1 e D1). A coloração positiva de Integrinα3 foi observada na membrana das células de carcinoma (fig. 4 A2, B2, C2 e D2). (B, C e D) Significado prognóstico avaliada por estimativas de sobrevivência de Kaplan-Meier e testes de log-rank. Comparações de OS por CD151 (B), Integrinα3 (C), e co-sobre-expressão de CD151 e integrinα3 (D).

As membranas das células tumorais coradas positivo para integrina α3 (Fig. 4a2, B2, C2 e D2). Em todos os tecidos analisados, altos níveis de expressão da integrina α3 foram detectados em 27 amostras de tecidos HGC (35,52%). Consistente com os resultados de estudos anteriores [16], [18], os pacientes com expressão elevada de integrinas α3 foram mais propensos a apresentar características agressivas. Integrina α3

pacientes de alto mostraram tumores maiores (

p =

3.46E-4), maior profundidade da invasão (

p =

0,001), maior estágio do tumor (

p =

0,005), e mais comprometimento dos linfonodos (

p =

0,040) do que os pacientes com expressão α3 baixo integrina (Tabela 1).

a superexpressão de CD151 e /ou integrina α3 estão Independent fatores previsão do prognóstico de pacientes HGC

até o último follow-up, os 3 e 5 anos as taxas de oS na população total foram 53,0 e 40,78%, a 5 anos oS na CD151

baixo grupo foi significativamente maior do que no CD151

alta grupo (68,42%

vs.

23,68%, respectivamente,

p

= 0,007, Fig. 4B), e pós-operatório 5 anos oS de pacientes HGC foi maior no α3 integrina

baixo do que no α3 integrina

alta grupo (66,67%

vs.

13,51%,

p = 6.67

E-6). Avaliação do efeito combinado de CD151 e integrina α3 no prognóstico de HGC mostrou que o 5-ano OS de CD151

alta /integrina α3

pacientes de alto (grupo III, n = 23) foi de 17,40%, o que foi significativamente menor do que a de CD151

baixo /integrina α3

pacientes de baixo (grupo 77,78% I, n = 27) e ambos os pacientes de baixo (pacientes com qualquer baixa CD151 ou baixa α3 integrina sozinho) (23,08%, o grupo II , n = 26, Fig. 4C e D).

A análise univariada mostrou que o tamanho do tumor, profundidade de invasão, comprometimento de linfonodos, estágio tumoral elevada, a alta expressão de CD151, alto nível de integrina α3 e co-expressão de CD151 e α3 integrina foram preditores para OS. Outras características, incluindo idade, sexo e diferenciação não tinha nenhum significado prognóstico para OS (Tabela 2). Multivariada Cox modelo de riscos proporcionais mostrou que a profundidade de invasão foi um indicador prognóstico independente para OS (Tabela. 2).

Discussão

Os resultados do presente estudo mostraram que CD151 foi expressa em níveis mais elevados em células de GC e tecidos tumorais do que em células HGeC e tecidos não tumorais, o que é consistente com os relatórios anteriores sobre a expressão de CD151 de uma variedade de tumores, incluindo colangiocarcinoma intra-hepática, carcinoma hepatocelular, da mama, do pulmão, do cólon e cancro da próstata [15], [19], [20], [21]. Além disso, o nosso estudo mostrou que a CD151 forma um complexo funcional com α3 integrina, e a regulação negativa da expressão de integrina ou CD151 α3 inibiu marcadamente a invasão e metástase de células HGC in vitro. Clinicamente, os nossos resultados indicam que o alto nível de expressão CD151 ou o co-sobre-expressão de CD151 e integrina α3 pode ter implicações desfavoravelmente prognósticos para pacientes com GC.

A evidência inicial de que CD151 promove metástase veio de um estudo mostrando que um anticorpo com especificidade desconhecida inibiu a formação de metástases por uma linha de carcinoma epidermóide humano

in vivo

. O anticorpo reconheceu CD151 e inibiu a migração de células sem afectar a proliferação ou a adesão [22]. A sobre-expressão de CD151 foi detectado em muitos tipos de tumor, aumento da expressão de CD151 e tem sido associado com um mau prognóstico no cancro da mama, pancreático, e cancros do pulmão de células não pequenas, bem como o HCC. Além disso, CD151 foi demonstrado ser um melhor indicador de prognóstico em pacientes com cancro da próstata do que de classificação histológica [23]. No presente estudo, duas linhas de evidência indicam que a sobre-expressão de CD151 é de relevância clínica em HGC. Em primeiro lugar, CD151 superexpressão foi mais frequentemente observada em pacientes HGC com mau prognóstico. Em segundo lugar, o aumento da expressão de CD151 reforçada a invasão e metástase de células HGC. Além disso, dados clínicos revelaram que a expressão elevada CD151 superou outros parâmetros clínicos normalmente utilizadas, tais como aumento do tamanho do tumor e diferenciação para predizer HGC prognóstico. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a CD151 desempenha um papel importante na progressão da HGC. No presente estudo, mostramos que CD151 interage com a integrina α3 em células HGC. A modulação dos níveis de integrina α3 em células HGC-27-vshCD151-ADNc-CD151 expressão revelou a formação de um complexo α3 CD151-integrina funcional e mostraram que a co-sobre-expressão de CD151 e integrina α3 foi associado com o aumento do potencial metastático de células HGC . Considerando o papel estabelecido de integrina α3 no HGC [16], é razoável supor que CD151 superexpressão pode promover metástases /invasão no GC.

Devido à sua natureza hidrofóbica, tetraspanins associado com o outro e com outra membrana proteínas [24]. Na verdade, é bem estabelecido que tetraspanins fornecer uma plataforma de sinalização na membrana do plasma por meio da formação de microdomínios enriquecido-tetraspaninas (ETM) [6], [7]. Até à data, os diferentes tipos de proteínas de membrana, incluindo receptores de factores de crescimento, integrinas, domínios de imunoglobulina e EWI-F (uma subfamília de proteínas de Ig) foram encontrados em ETMs [25]. Além disso, as funções destas proteínas de membrana têm sido relatados para ser intimamente associada com ETM. Por exemplo, foram encontrados diferentes combinações de tetraspanins formando ETM para afectar a função de receptores de factores de crescimento e integrinas. Mais importante ainda, o nível de tetraspanins individuais em ETMs expressão também tem um efeito significativo sobre as proteínas associadas [26], [27]. Em estudos recentes, knock-down de CD151 foi mostrada para afectar a formação de ETM e CD151 eliminação inibida a função de várias proteínas da membrana, indicando que CD151 desempenha um papel crítico na formação e função MET [7], [26]. Além disso, o bloqueio de CD151 marcadamente prejudicada a capacidade de invasão e potencial metastático das células tumorais, e direccionamento da proteína CD151 ou ETM tornou-se uma estratégia terapêutica promissora [23]. No presente estudo, foi mostrado a expressão de CD151 para ser um preditor independente para OS. No entanto, a expressão combinada de CD151 e integrina α3 era um indicador mais fiável do que o CD151 de SO ou expressão de integrina α3 sozinho, apoiando a noção de que tanto CD151 e integrina α3 desempenhar um papel importante em HGC. Por conseguinte, os nossos resultados são significativos e sugerem que o complexo de CD151 ou CD151 α3-integrina pode ser alvos importantes para o tratamento de pacientes com GC.

Em conclusão, a sobre-expressão CD151 é um preditor de mau prognóstico em pacientes com HGC