Sumário

A ciclina D1 regula a progressão G1. A sua regulação da transcrição é bem compreendida. No entanto, o mecanismo subjacente ubiquitinação da ciclina D1 e sua subsequente degradação ainda não está clara. Relatamos que a ciclina D1 sofre aumento da degradação no citoplasma durante a fase S numa variedade de células cancerosas. Esta fosforilação é mediada por pelo Thr286 através da actividade da /Raf /MEK cascata Ras /ERK e a proteína F-box FBXW8, que é uma ligase E3. A maioria dos FBXW8 é expressa no citoplasma durante a fase S e G1. Em contraste, a ciclina D1 acumula-se no núcleo durante a fase G1 e sai para dentro do citoplasma na fase S. O aumento da degradação da ciclina D1 está ligada à associação com FBXW8 no citoplasma, e fosforilação de ciclina D1 através sustentada sinalização ERK1 /2 melhorada. Depleção de FBXW8 causou uma acumulação significativa de ciclina D1, bem como o sequestro de CDK1 no citoplasma. Isto resultou numa severa redução da proliferação celular. Estes efeitos podem ser resgatados por expressão constitutiva nuclear de ciclina D1-T286A. Assim, FBXW8 desempenha um papel essencial na proliferação de células cancerosas através de proteólise de ciclina D1. Pode apresentar-se novas oportunidades para desenvolver terapias que atingem a destruição da ciclina D1 ou seu regulador E3 ligase seletivamente

Citation:. Okabe H, Lee SH, Phuchareon J, Albertson DG, McCormick F, Tetsu O (2006) A Critical papel para FBXW8 e MAPK em ciclina D1 Degradação e cancro da proliferação celular. PLoS ONE 1 (1): E128. doi: 10.1371 /journal.pone.0000128

Editor do Academic: Dong-Jin Yan, do Departamento de Bioquímica, China

Recebido: 07 de novembro de 2006; Aceito: 23 de novembro de 2006; Publicação: 27 de dezembro de 2006

Direitos de autor: © 2006 Okabe et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Sociedade americana do Câncer, a Fundação Concern, os Pharmaceuticals Daiichi, Alocação Research-Avaliação da UCSF, e da Fundação V para OT, os Institutos Nacionais de Saúde (R01 CA101359) à DGA e da Fundação de madeira para FM

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a ciclina D1 regula a progressão G1 em células cancerosas e é abundante em várias neoplasias malignas [1 ]. Como resultado, é um alvo potencial para a terapêutica do cancro [2]. A regulação transcricional de ciclina D1 tem sido extensivamente estudada e é bem compreendida [3] – [5]. Ele é estimulada quando, por exemplo, vários sinais mitogénicos activar a cascata de Ras /Raf /MEK /ERK (MAPK). Após a síntese após a ativação da cascata MAPK, ciclina D1 associados com CDK4 /6, p21 Cip1 ou p27 KIP1 [6], [7].

Em contraste, o mecanismo de ubiquitinação da ciclina D1 e subsequente degradação não foi totalmente caracterizado. Sabe-se que a ciclina D1 é polyubiquitinated e subsequentemente degradada através da via do proteassoma 26S. Este processo requer a fosforilação de ciclina D1 em treonina (Thr) -286, que está localizada perto do seu terminal C [8]. A ciclina D1 T286A mutante é resistente a ubiquitination

in vitro

e

in vivo

e é uma proteína altamente estável. Glicogénio-sintase-quinase-3β (GSK3β) pode fosforilar ciclina D1 em Thr286, promover a redistribuição nuclear para citoplasmático de-ciclina D1 [9], [10]. No entanto, o papel de GSK3β em ciclina D1 fosforilação e a sua estabilidade tem sido questionada recentemente [11], [12], e p38 SAPK2 tem sido implicada na degradação da ciclina D1 proteossómica seguinte choque osmótico [13].

Buscou-se identificar a quinase responsável pela fosforilação da ciclina D1 em Thr286. Nosso trabalho mostra que a ciclina D1 é desestabilizado especificamente durante a fase S em células cancerosas e que o aumento da degradação é mediada por fosforilação em Thr286 através da atividade do /Raf /MEK /cascata de sinalização MAPK Ras.

A ubiquitina-proteína -ligase necessária para a degradação da ciclina D1 ainda não foi identificado. Uma proteína F-box, Skp2, foi proposto [14], [15]. No entanto, a regulação mediada por Skp2 de ciclina D1 pode ser linha ou ao contexto celular dependente, e pode ser indirecta [7]. Além disso, a ciclina D1 não se acumule em células de ratinho knockout Skp2 fibroblasto embrionário (MEF) [16], [17].

A formação de conjugados de poliubiquitina em proteínas é bem compreendida [18]. Três componentes participar em reacções de transferência de ubiquitina sequenciais:. E1, uma enzima de activação, E2 /UBC, uma enzima de conjugação de ubiquitina-, e E3, uma ligase de proteína, que se liga a ubiquitina a um resíduo de lisina numa proteína alvo

o melhor caracterizado destes enzimas são as ubiquitina ligases E3 SCF, que regulam a ubiquitinação substrato de um modo dependente da fosforilação [19] – [21]. Estes ligases formar uma família altamente diversificada de complexos nomeados para os seus componentes, S-phase Kinase-associado Protein 1 (SKP1), Cullin 1 (CUL1 /Cdc53), proteínas F-box, e RBX1 /ROC1. SKP1 é uma subunidade essencial do adaptador e selectivamente interage com uma proteína de andaime, quer CUL1 ou Cullin 7 (CUL7), para promover a ubiquitinação dos substratos segmentados [22], [23]. Associação de CUL7 com SKP1 depende FBXW8 e forma uma SCF como complexo específico [22], [23]. Nosso estudo demonstra que a proteína F-box FBXW8 reconhece especificamente a ciclina D1 em uma maneira dependente da fosforilação e regula a sua estabilidade através da via da ubiquitina-proteassoma.

Resultados

proteína ciclina D1 é desestabilizado especificamente na fase S em células cancerosas

Para investigar o mecanismo e a importância da proteólise da ciclina D1, que em primeiro lugar avaliadas no perfil de expressão de ciclina D1 durante a progressão do ciclo celular da quiescência em três linhas de células normais (NIH 3T3 WI -38 fibroblastos e CCD841 CoN células do cólon do epitélio) e em três linhas celulares de cancro (HCT 116 e SW480 cancros do cólon e T98G glioblastomas). As células normais (Fig. 1A e Fig. S1 [A]) e células de cancro (Fig. 1B e a Fig. S1 [B]) foram libertadas da quiescência perfis G0 /em fase G1 do ciclo celular e foram determinados pelo ciclo celular por citometria de fluxo analisa. Em ambos os tipos de células, expressão de ciclina D1 aumentou gradualmente após a re-entrada no ciclo celular e atingiu um máximo na zona de transição G1-S. Em todas as três linhas de células normais, os níveis de ciclina D1 permaneceu constante durante a fase S (Fig. 1A e Fig. S1 [A]), embora tenhamos observado uma ligeira diminuição na expressão de ciclina D1 após a entrada em fase S. Este resultado é consistente com observações anteriores [24], [25]. Em contraste, todas as três linhas de células de cancro mostrou uma redução dramática da expressão da ciclina D1 durante a fase S (Fig. 1B e a Fig. S1 [B]). Estas observações sugerem que a rotação de ciclina D1 é aumentado durante a fase S nestas células.

Ciclina D1 é desestabilizado durante a fase S por meio da via da ubiquitina-proteassoma nas células cancerosas. (A, B) perfil de expressão de ciclina D1 durante a progressão do ciclo celular em células libertadas da quiescência. As células normais (A) e células de cancro (B) foram testadas. fibroblastos de rato (A), NIH 3T3 e CCD841 CoN cólon normal de epitélio. (B) HCT 116 e SW480 células. células con CCD841 foram sincronizados em fase G0 /G1 por tratamento com ACL-4 mídia sem EGF durante 24 horas, e em seguida estimuladas com completos ACL-4 mídia contendo EGF. Outras células foram libertadas da quiescência por estimulação do soro. As amostras foram coletadas em pontos de tempo indicados. distribuições de ciclo celular foi determinada por citometria de fluxo e as percentagens de cada fase são indicadas. Ocidentais-blots foram realizados com ciclina D1 e anticorpos de p-actina, respectivamente. (C, D) Análise de pulse-chase de ciclina D1 em células NIH 3T3 (C) e as células HCT 116 (D). As células foram libertadas da quiescência e marcadas com

35 S-metionina durante 1 hora, quando a maioria das populações estavam em fase G1 (9 horas para NIH3T3 e 6 horas para HCT 116) ou na fase S (21 horas para NIH3T3 e 15 horas para HCT 116). As células foram perseguida com metionina fria durante os tempos indicados e depois lisadas. A ciclina D1 foi imunoprecipitada e analisados ​​com SDS-PAGE. A autorradiografia foi realizada. Níveis de metabolicamente marcado com ciclina D1 foram estimados por varrimento quantitativa utilizando Quantity One Software (Bio-Rad) e colocados a hibridar com o gráfico para determinar a meia-vida de ciclina D1. a distribuição do ciclo celular é indicado abaixo das figuras. (E) O volume de negócios de ciclina D1 é mediado pela via da ubiquitina-proteassoma. NIH3T3 e células HCT 116 foram libertados da quiescência por estimulação com soro e tratadas na presença (+) ou ausência (-) de MG132 durante 2 horas, antes da colheita em cada ponto de tempo. Western blot foi realizada com ciclina D1 e anticorpos de p-actina. (F-H) Polyubiquitination da ciclina D1. (F) HCT 116 células de cancro do cólon foram transfectadas com ADNc de ubiquitina marcada com HA (pistas 1-3) ou sem (pista 4) e, em seguida, sincronizado para a fase S por meio da manipulação sequencial de privação de soro e a estimulação. As células foram tratadas com 25? M MG132 (pistas 3 e 4) ou sem (pistas 1 e 2) durante uma hora. Os lisados ​​foram imunoprecipitados com anticorpos anti-Ciclina D1 de anticorpos (pistas 2-4) ou IgG de controlo (pista 1) e imunotransferidas com um anticorpo HA (painel superior) ou um anticorpo de ciclina D1 (painel inferior). Os asteriscos indicam bandas de fundo não específica (F-G). (L) nuclear (N) e as proteínas citoplasmáticas (C) foram fraccionados (Pe) a partir de lisados ​​de células recolhidos no painel F, pista 3. extractos citoplasmáticos e nucleares foram imunoprecipitados com anticorpos anti-ciclina D1 (pistas 1 e 2) ou IgG ( pista 3) e imunotransferidas com um anticorpo HA (painel superior) ou um anticorpo de ciclina D1 (painel inferior). (H) distribuições ciclo celular.

Para confirmar esta observação, NIH 3T3 de fibroblastos de rato e HCT 116 células cancerígenas do cólon foram sincronizadas na fase G0 /G1 e lançado a partir de quietude e submetido a pulsar-chase análise . As Figs. analisa 1C e D mostram pulse-chase on

35S metabolicamente marcadas ciclina D1 em 9 horas (NIH 3T3) ou 6 horas (HCT 116), quando a maioria das células estavam em fase G1 e em 21 horas (NIH 3T3) e 15 horas (HCT 116), quando a maioria estava na fase S (Fig. 1C e D, mesas de fundo). ciclina D1 níveis rotulados de foram estimados por varrimento quantitativa (Figs. 1C e D). Não houve diferença significativa na meia-vida de ciclina D1 durante a G1 e S fases em que as células NIH 3T3. Em contrapartida, houve uma diferença significativa nas células HCT 116 (fase S T

1/2 = 11,8 min, em comparação com T

1/2 = 27,5 min na fase G1). Assim, a ciclina D1 é desestabilizada especificamente em fase S em células HCT 116.

Ciclina D1 é degradado no citoplasma durante a fase S por meio da via da ubiquitina-proteassoma nas células cancerosas

próxima determinado se ciclina D1 desestabilização durante a fase S era devido ao aumento da proteólise através da via da ubiquitina-proteassoma. Foram tratados células HCT 116 e NIH 3T3 com MG132, um inibidor de proteassoma, durante 2 horas, antes da colheita em cada ponto de tempo durante a progressão do ciclo celular (Fig. 1E). Em células HCT 116 tratados, ciclina D1 acumulada significativamente na fase S, sem acumulação significativa durante a fase G1. Em contraste, a diferença de ciclina D1 acumulada entre G1 e na fase S em células NIH 3T3 pareceu ser muito menor. Estes resultados sugerem que, nestas células cancerosas, ciclina D1 é desestabilizado durante a fase S através da via do proteassoma 26S.

Figuras 1F-H confirmar que desestabilização da ciclina D1 envolve polyubiquitination. Na Fig. 1F, as células HCT 116 foram transfectadas com (pistas 1-3) ou sem (pista 4) de ADNc de ubiquitina marcada com HA e, em seguida, sincronizado para a fase S. As células foram tratadas com MG132 (pistas 3 e 4) ou sem (pistas 1 e 2) por uma hora. Os lisados ​​foram imunoprecipitados com um anticorpo de ciclina D1 (pistas 2-4) ou IgG de controlo (pista 1) e imunotransferidas com um anticorpo HA. Um grupo de bandas mais lento de migração foi detectado pelo anticorpo HA exclusivamente nos imunoprecipitados D1 anti-ciclina, na presença de ubiquitina (pistas 2 e 3) e as bandas de mobilidade reduzida foram reforçada após a exposição a MG132 (pista 3), indicando que essas bandas incluídas ciclina D1 polyubiquitinated. Estas observações confirmaram que a ciclina D1 é degradado durante a fase S por meio da via da ubiquitina-proteassoma nas células HCT 116. FIG. 1H mostra que mais de 70% destas células estavam em fase S.

Para identificar onde a degradação da ciclina D1 é aumentado durante a fase S, extraímos nuclear (N) e citoplásmico (C) proteína de lisados ​​de células recolhidos em FIG. 1F pista 3 (Fig. 1G). A histona H1 foi detectada exclusivamente na fracção nuclear, ao passo que MEK1 foi totalmente expresso no extracto citoplasmático, sugerindo que os lisados ​​de células fraccionadas com sucesso (Fig. S1 [C]). A maioria da ciclina D1 foi localizada no citoplasma (Fig. S1 [C]). extractos citoplasmáticos e nucleares foram imunoprecipitados com anticorpos anti-ciclina D1 (figura 1G, pistas 1 e 2) ou IgG (pista 3) e imunotransferidas com um anticorpo HA. ciclina D1 Polyubiquitinated bandas foram predominantemente detectada nos extractos citoplasmáticos. Além disso, a inibição de localização nuclear para citoplasmático de-ciclina D1 com Leptomycin B (LMB) não aumentou significativamente estas bandas no núcleo (Fig. S1 [D]). Conclui-se que a ciclina D1 é degradado no citoplasma especificamente em fase S através de um mecanismo dependente de proteassoma em células HCT 116.

MAPK interage com ciclina D1 através de um domínio D-fosforila e Thr286

actividade de MAPK é elevada em todas as três linhas de células de cancro examinados (dados não apresentados; [ref.4]). Foi investigada a possibilidade de que a cascata de sinalização de Ras /Raf /MEK /ERK MAPK pode regular a fosforilação de resíduos de ciclina D1 Thr286, que é seguido por prolina (Figura 2A;. [Refs 8.], [9])

.

MAPK fosforila ciclina D1 em Thr286, o que desencadeia ubiquitination subsequente. (A) Identificação da D-domínio no ciclina D1 (Cyc D1). A ilustração dos de comprimento completo humana Cyc D1 mostra a região do domínio D-(A. A. 179-193) e o local de fosforilação da MAPK Thr (T), 286 seguido por prolina (P) (barra sólida e uma seta, respectivamente). A sequência de aminoácidos da D-domínio dentro Cyc D1 está alinhado com outros locais conhecidos de MAPK-docking de vários substratos de ERK. O dupleto de (+) e não polar (φ) aminoácidos básicos são resíduos conservados no núcleo motivo D-domínio L /I /V-X-G /I /V. As posições dos aminoácidos das mais 5 ‘dos ​​resíduos D-domínios são indicados com números na esquerda de cada sequência de aminoácidos, respectivamente. (B, C) p42 ERK2

in vitro

ensaios de cinase de ciclina D1 (painéis superiores). (B) proteína de tipo selvagem ou mutante T286A recombinante GST comprimento completo Cyc D1 foi misturada com

32P-ATP em tampão de reacção de ensaio de cinase na presença ou ausência de ERK2 purificado. As reacções foram realizadas a 30 ° C durante 30 minutos e parada pela adição de tampão de carregamento de amostra. As amostras foram separadas por SDS-PAGE e

32P-absorção foi detectada por autoradiografia. A análise de imunotransferência (IB), utilizando anticorpos para ciclina D1 é fornecida como uma referência para mostrar as quantidades de substrato. (C) A GST sozinho (pista 1), proteína de fusão GST WT Cyc D1-C-terminal de retenção do local de ligação de MAPK (aminoácidos 165-295, pista 2), T286A (pista 3) e uma supressão completa da D- domínio ΔD, pista 4) foram usadas. análise IB utilizando anticorpos para GSTs fornecidas como referência para mostrar as quantidades de substrato. (D) imunoprecipitação (IP) e análise IB seguinte expressão ectópica de ERK2 marcada com Flag em conjunto tanto com 116 células cancerígenas do cólon marcada com HA WT ou ΔD Cyc D1 no HCT. Um Western blot para os controlos de entrada (10% lisados ​​totais) também é mostrada. (E) a análise Western blot com Thr286 fosforilada ciclina D1 (pCycD1 Thr286) e total Cyc D1 após a transfecção de várias formas de vectores de expressão de Cyc D1 HA-tag em HCT 116 células cancerígenas do cólon. (F, G)

In vitro

ubiquitinação ensaios utilizando células HeLa extrai Fracção II como uma fonte das enzimas necessárias para conjugar ubiquitina para substratos e ATP. (F) de comprimento total de GST-Cyc D1 WT, T286A, ou ΔD foram usadas para uma reacção quer com ERK2 recombinante (pistas 3-5) ou sem (colunas 1-2). As amostras foram separadas por SDS-PAGE e imunotransferidas com um anticorpo de ciclina D1. ATP foi adicionado a todas as pistas, e não ubiquitina foi adicionado a pista 1 (L) de comprimento total de GST-Cyc D1 WT foi usado com ou sem ubiquitina. Após a separação por SDS-PAGE, immunobloting foi realizada com anticorpos para ciclina D1 (pistas 1, 2) ou ubiquitina (pistas 3, 4). (H, I) análise pulse-chase de ciclina D1 em células HCT 116 após a exposição ao U0126. Exponencialmente o crescimento de células HCT 116 foram tratadas com DMSO ou 10 U0126 uM durante 30 min. (H) As células foram marcadas com impulsos-

35S-metionina e foram perseguidos durante os tempos indicados. A ciclina D1 foi imunoprecipitada e, em seguida, analisados ​​com SDS-PAGE. A autorradiografia foi realizada. (I) Níveis de D1-ciclina marcado metabolicamente. (J) análise de transferência de Western com pCycD1 Thr286, ciclina D1 totais, a fosforilação de ERK específica (pERK), e anticorpos totais de ERK. distribuições de ciclo (K) celular são mostradas.

ERK /MAPK é uma proteína quinase prolina (Pro) -directed [26]. Ele requer um local de ancoragem de cinase (ou D-domínio) sobre o seu substrato para aumentar a eficiência de fosforilação (Figura 2A;. [27 Ref.]). D-domínios têm sido encontrados em vários substratos de ERK, como Elk-1, Sap-1, 2-sap, Ets-1 e c-Myc (Figura 2A;. [. Refs 27], [28]). Temos procurado por um D-domínio no ciclina D1 com software Motif Scan (https://scansite.mit.edu). Através de uma série de pesquisas rigorosas, identificou-se uma D-domínio altamente significativa (dentro de 0,041 percentil) em aminoácidos 179-193 (Fig. 2A), sugerindo que a cascata de sinalização de Ras /Raf /MEK /ERK MAPK pode ser responsável pela ciclina D1 fosforilação.

para testar a possibilidade de que purificado ERK /MAPK fosforilam pode ciclina D1 recombinante, a ERK2 foi purificado certamente utilizadas para fosforilar um glutationa

S

-transferase (GST) -cyclin D1 proteína de fusão (fig. 2B e C). ERK2 fosforilado purificado de forma eficiente de comprimento completo GST-tipo selvagem (WT) ciclina D1 (Fig. 2B, coluna 2). Em contraste, a ERK2 falhou para fosforilar T286A, um mutante de ciclina D1 (Fig. 2B, faixa 4), sugerindo que Thr286 é o principal local de fosforilação de ERK /MAPK. Resultados idênticos foram obtidos na presença de CDK4 /6 purificado; ERK foi capaz de fosforilar a ciclina D1 em Thr286, não apenas sob a forma monomérica, mas também dentro de ciclina D1-CDK4 /6 de complexos (dados não mostrados).

Para determinar se ERK /MAPK requer o domínio D-para eficiente fosforilação ciclina D1 em Thr286, foi realizada

in vitro

ensaios de cinase utilizando uma supressão completa da D-domínio (ΔD) a partir da proteína de fusão da ciclina D1 GST-C-terminal. Esta proteína de fusão retém o sítio de ligação de MAPK. FIG. 2C mostra que a ERK2 fosforilado purificada eficazmente WT ciclina D1 (pista 2), mas não o T286A e mutantes ΔD (pistas 3 e 4).

Estes resultados sugerem fortemente que MAPK interage com ciclina D1 através do seu domínio D- para fosforilar Thr286. Para confirmar esta possibilidade, foi realizada uma análise (IP-IB) imunoprecipitação e immunoblotting seguinte expressão ectópica de ERK2 marcada com Flag com qualquer HA-tagged WT ou ΔD ciclina D1 em HCT 116 células cancerígenas do cólon (Fig. 2D). ERK2 associados com WT bem ciclina D1 (pista 2) e fracamente com ciclina D1 ΔD (pista 3). Para estabelecer a importância da MAPK na fosforilação de ciclina D1 em Thr286 nas células HCT 116, que as células transfectadas com várias formas de vectores de expressão da ciclina D1 (Fig. 2E). A expressão ectópica da ciclina D1 foi distinguido de expressão endógena pela mobilidade reduzida de ciclina D1 marcada com HA. Analisamos o estado de fosforilação de expressão da ciclina D1 exógena em Thr286. A ciclina D1 fosforilação foi significativamente reduzido pela eliminação do domínio D-(pista 4). Estas observações sugerem que a maioria dos Thr286 fosforilação em células HCT 116 é através da actividade de MAPK.

Ras /ubiquitinação e degradação de ciclina D1 está directamente relacionada com a associação de MAPK /ERK com ciclina D1

a seguir, investigou se a fosforilação mediada por MAPK da ciclina D1 pode levar ubiquitinação da ciclina D1

in vitro

(Fig. 2F e G). Foi utilizado um sistema de ensaio de ubiquitinação, que utiliza extractos de células HeLa a fracção II como uma fonte das enzimas necessárias para conjugar ubiquitina para substratos e de ATP [29]. Polyubiquitination de ciclina D1 (figura 2F, pistas 1 e 2) foi ainda reforçada por ERK-2 (Fig. 2F, a pista 3 e Fig. 2G, pistas 2 e 4). Mais lenta migração de bandas não foram detectadas na ausência de ubiquitina (Fig. 2G, pistas 1 e 3), o que sugere que elas consistem de formas polyubiquitinated de ciclina D1 (Fig. 2G, pistas 2 e 4). Acreditamos que polyubiquitination necessária a interacção directa de ERK2 com ciclina D1 e a fosforilação da ciclina D1 em Thr286, porque ubiquitination foi em grande parte prevenidas na forma D-domain mutante de deleção (ΔD) e a alanina para substituição Thr286 (T286A) da ciclina D1 ( Fig. 2F, pistas 4 e 5).

a estabilidade da proteína ciclina D1 é regulada por actividades /MAPK ERK no HCT 116 células cancerosas

Nós também determinou a contribuição de ERK /MAPK para a estabilidade de ciclina D1 em células cancerosas. Foram realizadas análises pulse-chase em D1-ciclina marcado metabolicamente após inibir atividades MAPK (Fig 2H-K;. [Refs 30.], [31]). Exponencialmente o crescimento de células HCT 116 foram tratados com U0126 durante 30 min, a qual esgotou significativamente a forma fosforilada de ERK (pERK) e ciclina D1 em Thr286 (PCYC D1 Thr286) sem afectar o perfil do ciclo celular (Fig. 2J e K). Níveis de ciclina D1 marcado metabolicamente foram estimados por varrimento quantitativa, tal como descrito acima (Fig. 2I). Reduzir a actividade de MAPK aumentada a sua meia-vida de ciclina D1, de 22,5 minutos para 54,6 minutos. Estes dados indicam que a estabilidade da ciclina D1 é regulada pela atividade /MAPK ERK em células cancerosas.

estabilidade ciclina D1 é regulada através da SCF ou a via SCF-like

Por causa da estrita especificidade da E3 ligases e seus substratos [18], a ciclina D1 é provável que tenha o seu próprio ligase E3. Colocámos a hipótese de que a proteólise da ciclina D1 é mediada pela SCF ligases E3 ou um complexo de SCF como ligases de E3, em que uma proteína F-box determina a especificidade para o seu substrato. Para testar essa ideia, foi realizada análise de IP-IB (Fig. 3A). A ciclina D1 em crescimento exponencial de células HCT 116 foram imunoprecipitados e sequencialmente colocados a hibridar com anticorpos para ciclina D1, CDK4, SKP1, CUL1 e CUL7. Ciclina D1 associado com SKP1, CUL1 ou CUL7 e CDK4, sugerindo que a sua proteólise é mediada pelo SCF (proteína SKP1-CUL1-F-box) ou o SCF-like (SKP1-CUL7-FBXW8) complexo de ligases E3.

FBXW8 ubiquitinates ciclina D1 em uma maneira dependente da fosforilação Thr286. análise (A) IP-IB (esquerda). A proteína das células em crescimento exponencial HCT 116 foi precipitado com anticorpos de ciclina D1 ou IgG. Os imunoprecipitados foram sujeitos a SDS-PAGE e colocados a hibridar com sequencialmente ciclina D1, CDK4, SKP1, CUL1 e anticorpos CUL7. análise IB com 5% de lisados ​​de células totais foi fornecida como um controlo (direita). (B) Análise IB após a depleção de expressão SKP1 por 48 horas após o tratamento com SKP1 siRNA oligonucleotídeos de cadeia dupla em HCT 116 células. transfecção não-alvo siRNA (Control) e simulada (-) serviram como controle. (C) PI-IB análise. Vinte e seis F-box full-length cDNAs codificadores foram clonados em vectores de expressão tag V5 ou epitopo FLAG. Estes V5 ou plasmídeos de ADN de proteína F-box Flag-tag foram transfectadas, juntamente com a ciclina D1 marcada com HA (HA-Cyc D1) e expressão CDK4 vectores em células T98G. As células foram recolhidas 24 horas mais tarde. As amostras foram precipitadas com um anticorpo marcador de epitopo HA. Os imunoprecipitados foram sujeitos a SDS-PAGE e subsequentemente corados com V5 ou bandeira (proteínas F-box), anticorpos HA (Cyc D1). análise IB com 10% de lisados ​​de células totais foi fornecida (parte inferior). (D) Análise de IP-IB (em cima). V5-tag plasmídeos de ADN da proteína F-box foram transientemente transfectadas em conjunto com qualquer marcada com HA ciclina D1 (D1 Cyc) de tipo selvagem (WT) ou mutante T286A, e vectores de expressão de CDK4 em células T98G, respectivamente. As amostras foram precipitadas com um anticorpo epitopo-marcador de HA. Os imunoprecipitados foram sujeitos a SDS-PAGE e colocados a hibridar com posteriormente V5 (proteínas F-box), HA (Cyc D1), e anticorpos Thr286 fosforilada ciclina D1 (D1 PCYC Thr286). análise IB com 10% de lisados ​​de células totais foi proporcionada para comparação (parte inferior). (E)

In vitro

ensaio de ubiquitinação.

In vitro

traduzido proteínas F-box com recombinante GST-full-length ciclina D1 (Cyc D1) do tipo selvagem, células HeLa extrai Fracção II com ATP, ubiquitina e ERK2, e

in vitro

-translated quer SKP1, RBX1 e CUL1, ou SKP1, proteínas RBX1 CUL7 e foram incubadas a 30 ° C durante 2 horas. As amostras foram separadas por SDS-PAGE e imunotransferidas com um anticorpo de ciclina D1. (F)

In vitro

polyubiquitination da ciclina D1 através da SCF-like (SCFL) FBXW8 complexo (SKP1-CUL7-FBXW8-RBX1 /SCFL

FBXW8). WT ou T286A GST- Cyc D1 foi incubada na presença de ERK2 purificado (pistas 1 e 3) ou a sua ausência (pista 2), a 30 ° C durante 2 horas. As amostras foram separadas por SDS-PAGE e imunotransferidas com um anticorpo de ciclina D1. O asterisco indica bandas não específicas. (G) Reconstituição de polyubiquitination da ciclina D1 através SCFL

FBXW8

in vitro

usando purificado E1 e E2. GST-WT Cyc D1 foi incubada com SCFL recombinante

FBXW8 na presença ou ausência de E1 e E2 /UbcH5C. As amostras foram separadas por SDS-PAGE e imunotransferidas com um anticorpo de ciclina D1.

Para testar se os níveis de ciclina D1 são regulados principalmente pela SCF ou a via SCF semelhante, foi realizada uma análise de imunotransferência 48 horas após esgotar expressão SKP1 com siRNA oligonucleotídeos de cadeia dupla no HCT 116 células (Fig. 3b). siRNA para SKP1 reduziu significativamente a expressão SKP1 e resultou em acúmulo de ciclina D1. Estas observações suportam a idéia de que a estabilidade ciclina D1 é regulada através da SCF ou a via SCF-like.

FBXW8, uma proteína F-box, associa especificamente com a ciclina D1 em uma Thr286 fosforilação dependente maneira

a seguir, identificou a proteína responsável pela estabilidade da ciclina D1. Testamos genes de proteínas F-box humanos candidatos para identificar a ligase E3 ubiquitina única para ciclina D1. Especificidade do substrato de complexos de SCF ocorre através de domínios interacção proteína-proteína que são muitas vezes de ácido aspártico-triptofano (WD) 40 motivos ou repetições ricas em leucina (LRR) dentro proteínas da caixa-F [20], [21]. Foram pesquisados ​​os bancos de dados do NCBI para proteínas F-box humanos com motivos WD40 ou LRR. Encontramos cerca de 70 genes potenciais. Entre estes, 9 tinha WD40 motivos repetidos e 17 apresentaram motivos LRR.

Obtivemos estes genes pela primeira execução da transcriptase reversa-PCR (RT-PCR) usando o RNA total a partir de células HEK 293, HCT 116 ou células WI-38 . Os cDNAs completos nós recuperados foram clonados em vetores de expressão tag V5 ou epitopo Flag. Para avaliar se algum dos produtos destes genes poderiam reconhecer ciclina D1, que transitoriamente transfectadas plasmídeos de ADN para a V5 ou proteínas F-box Flag-tag em células T98G, com ou sem ciclina marcada com HA vectores D1 e expressão CDK4 N-terminais ( A Fig. 3C). Após 24 horas, as células foram recolhidas e realizada a análise de IP-IB. As amostras foram precipitadas com um anticorpo epitopo marcador de HA e coradas com a bandeira (FBXW7 e FBXL5) ou V5 (outros), e anticorpos de ciclina D1. O painel C mostra ciclina D1 associar com duas proteínas F-box, FBXW8 (pista 7) e FBXL12 (pista 15). FBXW8 possuía motivos WD40 e FBXL12 tinha motivos LRR.

Porque substratos de proteínas F-box deve ser fosforilada [19], nós testamos se FBXW8 e FBXL12 reconhecem ciclina D1 em uma maneira dependente da fosforilação Thr286. Nós transitoriamente transfectadas células T98G com plasmídeos V5-tag proteína F-box de DNA e ciclina D1 (tipo ou T286A selvagem mutante) e vectores de expressão de CDK4. As amostras foram precipitadas com um anticorpo marcador de epitopo HA e colocados a hibridar com V5, HA e anticorpos ciclina D1 Thr286 fosforilada (Fig. 3D). FBXW8 foi associada tanto a ciclina D1 tipo selvagem e o mutante T286A, mas a maioria foi obrigada a do tipo selvagem, que foi principalmente fosforilada em Thr286. Em contraste, não vimos uma diferença significativa entre o tipo selvagem ciclina D1 e do mutante em associação com FBXL12. Estes resultados sugerem que a ciclina D1 FBXW8 reconhece de um modo dependente da fosforilação Thr286, mas não faz FBXL12. Consistente com este achado, FBXL12 não estava envolvido na ciclina D1 polyubiquitination

in vitro

(Fig. 3E, pista 9). Concluímos que FBXW8 pode desempenhar um papel na estabilidade ciclina D1.

FBXW8 ubiquitinates ciclina D1 em uma fosforilação forma dependente Thr-286

Nós investigamos se

in vitro

ubiquitinação de ciclina D1 requer FBXW8 (Fig. 3E). Incub�os Cada

in vitro

-translated proteína F-caixa com, fração II extratos de células HeLa GST-ciclina D1 (Cyc D1) recombinantes com ATP, ubiquitina e ERK2, e ou

in vitro

SKP1 -translated, RBX1 e CUL1, ou SKP1, proteínas e RBX1 CUL7. A seguir, apagou-los com um anticorpo de ciclina D1. Ubiquitinação da ciclina D1 foi detectada nas combinações de FBXW8 com SKP1, CUL1, e RBX1 (pista 5), ​​ou com FBXW8 SKP1, CUL7, e RBX1 (pista 6). No entanto, as bandas polyubiquitinated não foram aumentados em outras combinações. Para confirmar que os complexos de SCF foram montadas corretamente ao

in vitro

tradução, realizamos immmunoprecipitation com cada proteína F-box nas

35S marcado

in vitro

amostras traduzido (não mostradas ) e testou-se se os complexos contendo β-TRCP eram funcionais para polyubiquitination de β-catenina (Fig. S1 [e]). Nossos resultados sugerem que a ciclina D1 ubiquitination envolve FBXW8.

A seguir, investigou se

in vitro

ubiquitinação da ciclina D1 através da SCF-like (SCFL) FBXW8 complexo (SKP1-CUL7-FBXW8-RBX1 /SCFL

FBXW8) requer fosforilação de ciclina D1 em Thr286 (Fig. 3F). Polyubiquitination através SCFL

FBXW8 foi drasticamente reduzido pelo esgotamento dos ERK2 (pista 2). Além disso, polyubiquitination da ciclina D1 foi largamente impedido pela alanina para-Thr286-substituição (T286A, pista 3), sugerindo que a fosforilação de ciclina D1 em Thr286 é necessária para a ubiquitinação por SCFL

FBXW8. Estes dados estão em bom acordo com nossa observação de que FBXW8 associa especificamente com a ciclina D1 em uma maneira dependente da fosforilação Thr286.

Finalmente, reconstituído polyubiquitination ciclina D1

in vitro

usando purificado E1 e E2 enzimas (Fig. 3G). SCFL

FBXW8 promove montagem da cadeia poliubiquitina UbcH5C catalisada [22]. FIG.