Abstract
actividade desregulada de fatores de transcrição (TFS) da família Sp /KLF, como SP1, SP3 e SP4, e consequente sobre-expressão de genes Sp regulamentados ocorrem frequentemente em cancros humanos. Isso fornece a base racional para o desenvolvimento de inibidores de Sp TFs como cancro terapêutica. Um Mitramicina (MTM-A) é um policetido natural que se liga a sequências de ADN rico em GC, inibe a actividade de TF Sp e apresenta actividade antitumoral potente em sistemas experimentais. No entanto, a utilização clínica de MTM-A é limitada pela toxicidade grave do composto. Aqui, foram estudados dois análogos MTM-A, que tinha sido geradas por engenharia genética do A-MTM via biossintética, e avaliada a sua actividade no cancro da próstata humana em culturas de células e os modelos de ratinho. Os compostos, chamados MTM-SDK e MTM-SK, foram altamente eficazes
In vitro
inibição da proliferação de células de cancro da próstata e a transcrição de genes Sp-regulados por bloqueio da ligação de proteínas SP para os promotores de genes Quando administrado a ratinhos , ambos os compostos foram bem toleradas, com doses máximas toleradas de MTM-SDK e MTM-SK, respectivamente, 4 e 32 vezes maior do que o MTM-A. Após a administração sistémica, ambos os compostos foram rapidamente eliminado da circulação sanguínea, mas manteve níveis plasmáticos bem acima das concentrações activas necessárias
in vitro Compra de inibição da actividade TF Sp e proliferação celular. Consistentemente, MTM-SDK e MTM-SK inibiu a transcrição de genes Sp regulamentados em xenoenxertos de tumor da próstata e exibiu potente actividade antitumoral em modelos de xenotransplante tumoral subcutâneo e metastático sem ou com o mínimo de toxicidade. Tomados em conjunto, estes dados indicam que MTM-SDK e MTM-SK possuem significativamente melhores propriedades farmacológicas e toxicológicas em comparação com MTM-A e representam drogas promissoras para o tratamento de câncer de próstata avançado
Citation:. Malek A, Núñez LE , Magistri M, Brambilla L, Jovic S, Carbone GM, et al. (2012) Modulação da atividade de fatores de transcrição Sp pelo mitramicina Análogos como uma nova estratégia para o tratamento de câncer de próstata metastático. PLoS ONE 7 (4): e35130. doi: 10.1371 /journal.pone.0035130
editor: Leo T.O. Lee, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 07 de outubro de 2011; Aceito: 13 de março de 2012; Publicação: 19 de abril de 2012
Direitos de autor: © 2012 Malek et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Fondazione Ticinese per la Ricerca sul Cancro, Swiss National Science Foundation e Câncer League suíça a CVC e GMC. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:. Os co-autores FM e LEN são funcionários e FM é acionista da EntreChem SL, a empresa licenciado dos compostos descritos no manuscrito. Todos os outros autores têm de declarar que não há interesses concorrentes exist.This não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
iniciação e progressão tumoral são mediada por múltiplas vias de sinalização e os benefícios terapêuticos alcançáveis por segmentação percursos individuais podem ser limitados [1]. Visando os locais de convergência de diversas cascatas reguladoras pode representar uma estratégia mais promissora para o tratamento do câncer. Os fatores de transcrição (TFS) são particularmente atraentes, a este respeito, uma vez que são pontos nodais em vias de sinalização e são frequentemente desregulado em cancros humanos [1], [2]. expressão ou actividade dos membros da família Sp /KLF do TFS aberrante, como SP1, SP3 e SP4, ocorre em muitos cancros humanos [3] Sp TFs se ligam a elementos de DNA rico em GC (GC-box) em promotores de genes, interagem com componentes da maquinaria de transcrição basal, cooperar com outras TFs e são efectores a jusante de vias de sinalização múltiplas [3]. Vários estudos têm demonstrado que a SP TFs têm um papel importante na patogênese dos cancros humanos e são promissores alvos terapêuticos [3], [4], [5],.
Mitramicina A (MTM-A) é natural policetídeo aromáticos policíclicos produzidos por vários
espécies de Streptomyces
[14]. MTM-A liga-se preferencialmente a sequências ricas em GC no DNA, blocos competitivos os elementos de ligação de Sp TFs e outras proteínas de ligação GC para GC-rica em genes promotores e inibe a transcrição de Sp genes regulados [15], [16], [ ,,,0],17], [18], [19]. A inibição de genes regulados Sp é o principal determinante da actividade biológica de MTM-A em sistemas experimentais [20], [21]. O uso clínico de MTM-A no entanto, é limitado devido à toxicidade do composto [22]. Geneticamente engenharia do A-MTM via biossintética tem a oportunidade para gerar novos análogos de MTM-A que possa possuir melhores propriedades farmacológicas e toxicológicas [23], [24], [25], [26]. Recentemente, dois compostos, chamados MTM-SDK e MTM-SK, foram obtidos usando a abordagem de engenharia metabólica [27], [28]. MTM-SDK e MTM-SK apresentou maior capacidade de bloquear Sp1 ligação ao DNA e captação celular em comparação com MTM-A. Isto levou a um aumento da actividade biológica como inibidores de Sp transcrição regulada de genes e proliferação de células de cancro, quer in vitro e in vivo [27], [29]. Assim, estes novos análogos MTM-A pode ser útil para o tratamento de cancros com atividade anormal do Sp TFs.
Neste estudo, avaliou-se a actividade dos análogos MTM-A MTM-SDK e MTM-SK em modelos experimentais de cancro da próstata humano. O câncer de próstata é o câncer mais comum ea segunda causa de morte por câncer em homens nos países ocidentais [30]. manejo convencional do câncer de próstata inclui cirurgia, radioterapia e da privação do andrógeno [31]. Apesar do aumento gradual na sobrevida e qualidade de vida livre de doença, disseminação metastática ainda é a principal causa de morte para pacientes com câncer de próstata [31]. cancro da próstata avançado, é muitas vezes resistentes ao tratamento hormonal e a quimioterapia sistémica tem eficácia limitada [31], [32]. terapia paliativa continua a ser a principal opção para muitos desses pacientes. Portanto, novas abordagens terapêuticas precisam ser implementadas para gerenciar o câncer de próstata metastático. O estado de Sp TFs no cancro da próstata tem sido pouco investigada até à data. No entanto, encontramos evidências que suportam um papel para a atividade desregulada de Sp TFs na iniciação e progressão do câncer de próstata. Muitos genes referida como estando envolvida na tumorigénese da próstata são regulados por factores Sp (ver Métodos S1; Tabela S1, S2 e suas referências). Os compostos que interferem com a SP TFs por diferentes mecanismos têm actividade relevante em vários tipos de câncer, incluindo câncer de próstata [7], [8], [9], [10], [11], [33], [34], [35] , [36], [37], [38]. Essas considerações, juntamente com bioinformática análises de conjuntos de dados de expressão de genes publicados, levou-nos a hipótese de que Sp TFs poderiam ser alvos relevantes em tumores de próstata e que o novo MTM-A análogos com melhores propriedades farmacológicas pode ser útil para o tratamento desta doença.
Materiais e Métodos
compostos e linhas celulares
PC3 cancro da próstata humano, DU145, as células 22Rv1 e LNCaP foram mantidas em RPMI 1640 [39]. fibroblastos humanos normais foram mantidas em DMEM [27]. MTM-A, foram preparados MTM-SK (CE-7072) e MTM-SDK (CE-7073) tal como previamente descrito [27]. As soluções-mãe dos compostos (10 mM) foram preparadas em solução salina estéril ou DMSO e diluída em solução salina estéril imediatamente antes da utilização [29]. Para a expressão de genes e as células imunoprecipitação da cromatina (ChIP) foram tratadas com 100 nM de MTM-SDK e MTM-SK ou veículo durante 24 h.
ARN e proteína análise
O ARN total a partir de células cultivadas e tecidos de tumor foi isolado e transcrito de forma inversa tal como descrito [27], [29]. Quantitativa em tempo real de RT-PCR (qRT-PCR) foi realizada usando o ABI PRISM 7000HT Sequence Detection Sistema e SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems), como descrito [29]. Os iniciadores de PCR estão apresentados na Tabela S3.
GAPDH
e
B2M
foram usados como controles internos. Expressão de dados foram expressos como uma percentagem de controlo da expressão de genes, como descrito [29]. Ponto final de RT-PCR foi realizada como descrito anteriormente utilizando o One-Step sistema SuperScript RT-PCR (Invitrogen) e iniciadores específicos para o gene [27]. Os lisados celulares foram preparados a partir de células de controlo e proteínas e tratados com droga separadas em géis de SDS-poliacrilamida. A imunotransferência foi realizada como descrito anteriormente [27], [40].
imunoprecipitação da cromatina (ChIP)
As células foram recolhidas, reticulada com formaldeído e processadas seguindo um protocolo do kit EZ-chip modificado (Upstate Biotechnology), como descrito [41]. Cromatina foi imunoprecipitado com um anticorpo para o SP1 e IgG normal de rato como controlo negativo. ADN-proteína ligações cruzadas foram invertidos e o ADN foi purificado a partir de lisados de células totais (input) e fracções imunoprecipitadas. qPCR foi realizado como indicado anteriormente. Os iniciadores para a análise do chip do C-MYC e promotor de VEGF são mostradas na Tabela S3. A quantidade de ADN ligado foi calculado em referência a uma curva padrão e expressos como percentagem de ADN de entrada [41].
In vitro
inibição do crescimento celular
A viabilidade celular foi determinada usando o ensaio colorimétrico MTT como descrito [27]. As células foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubou-se com o veículo ou os compostos durante 24 e 72 h. Cada tratamento foi realizado em triplicado e experimentos foram repetidos pelo menos três vezes.
Animais e modelos de xenotransplante
ratinhos nu masculino atímicos (Balb c nu /nu, 6-8 semanas de idade) foram adquiridos dos Laboratórios Harlan. Os ratos foram mantidos em condições livres de patógenos com alimentos e água fornecidos
ad libitum Comprar e seu estado geral de saúde foi monitorada diariamente. Todos os protocolos envolvendo animais de laboratório foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais e em conformidade com as leis e políticas nacionais e internacionais. procedimentos experimentais e protocolos de estudo foram revistos e aprovados pelos suíços Cantonal Autoridade Veterinária (Aprovação no. 05/2011). Para estabelecer xenoenxertos de tumores subcutâneos, as células PC3 (2 × 10
6 células) foram inoculados no flanco de ratinhos. Para o modelo de xenotransplante metastático, as células PC3 (0,6 × 10
6) foram injectados duas vezes na veia da cauda, com um intervalo de 24 horas entre as injeções.
Toxicidade
Saudável CD-1 camundongos fornecido pela Universidade de Oviedo Biotério foram tratados com injecções únicas ou repetidas IV do MTM-SK, MTM-SDK e MTM-a. Cada grupo consistia em 4 ratos. Para doses repetidas, as drogas foram administradas por IV injeções a cada dois ou três dias para um total de 10 injecções. O peso corporal, mortes, mudanças no comportamento, motilidade, comer e hábitos de consumo, e qualquer outro sinal de toxicidade local ou sistêmica foram registrados diariamente.
Farmacocinética
saudáveis ratos CD-1 foram injectados IV com MTM-SK (18 mg /kg) e MTM-SDK (2 mg /kg). O sangue foi coletado em cinco pontos de tempo entre 5 e 120 min. Em cada ponto de tempo foram analisados 3 murganhos por grupo. As amostras de plasma foram diluídas com 4 volumes de acetonitrilo, vortex e centrifugada para eliminar qualquer precipitado insolúvel. O sobrenadante foi então usado para medir MTM-SDK e MTM-SK por LC-MS. Os níveis plasmáticos foram avaliados após intraperitoneal (IP) e IV injeção de MTM-SK (18 mg /Kg) também por CLAE-UV.
análise
A expressão gênica em xenoenxertos tumorais
Para avaliar os efeitos na transcrição em tecidos de tumor, os ratinhos portadores de tumores subcutâneos foram tratados com solução salina MTM-SDK (1,2 mg /kg) e SK-MTM (8 mg /kg) ou por injecção IV. Os animais foram sacrificados após 1, 3 e 7 dias após a injeção. Os tumores foram imediatamente recolhido e congelado rapidamente para o isolamento de RNA. qRT-PCR foi realizada como descrito acima. Em cada ponto de tempo de 4 ratinhos foram analisados em cada grupo experimental e de qRT-PCR realizado em triplicado para cada amostra.
actividade antitumoral
Os ratinhos portadores de tumores subcutâneos foram tratados com os compostos ou o veículo. Cada grupo experimental consistiu de 10 ratos. As drogas foram preparadas em solução salina estéril e dada por injecções IP a cada 3 dias. Os ratinhos de controlo receberam uma injecção IP de solução salina estéril. O tamanho do tumor foi medido com um calibrador duas vezes por semana. Os dados representam a média ± DP de 10 ratinhos por grupo.
actividade antimetastática
Para avaliar a capacidade dos compostos para bloquear o crescimento de tumores metastáticos, os ratinhos receberam injecções na veia da cauda de células tumorais para estabelecer metástases do pulmão. Em seguida, os ratinhos foram tratados com MTM-SDK (1,2 mg /kg), MTM-SK (8 mg /kg) ou solução salina estéril dada por injecções IP a cada 3 dias, com início duas semanas após a injecção na veia da cauda de células tumorais. Dois grupos de ratinhos não tratados (
n = 3 por grupo
) foram sacrificados após 1 e 2 semanas a partir da injecção para confirmar a implantação e crescimento de células metastáticas. Controlo e ratinhos tratados com o fármaco (
n = 3 por grupo
) foram então sacrificados após 1 e 2 semanas a partir do início do tratamento. tecidos pulmonares foram coletadas para análise qPCR e exame histológico após a H E coloração. As metástases pulmonares foram quantificadas utilizando um método baseado qPCR anteriormente descrito [42]. O ADN genómico extraído de tecidos de pulmão congeladas foi amplificado com os conjuntos de iniciadores para única, conservadas e regiões específicas de espécies, do genoma humano e de ratinho. A PCR foi realizada utilizando SYBRGreen qPCR Mistura de PCR [42]. A percentagem de células humanas em tecidos do pulmão foi determinada em triplicado reacções emparelhados para cada animal utilizando curva padrão de amostras misturadas humano /murganho como descrito [42]. Os dados são SD ± média de 3 ratos por ponto experimental.
A análise estatística
Todos os dados são expressos como média ± SD. O valor de IC50 foram calculados utilizando SigmaPlot. As diferenças entre grupos experimentais foram analisados para significado estatístico utilizando o t-teste bilateral desemparelhado usando Software GraphPad Prism 4.0. P values≤0.05 foram considerados estatisticamente significativos.
Resultados
MTM-SDK e MTM-SK inibir a expressão de genes Sp regulados em células de câncer de próstata
A análise da literatura atual mostrou que muitos genes sobre-expresso no cancro da próstata primário e metastático, são regulados por SP TFs e são potenciais alvos dos análogos MTM-a (ver Métodos S1, Tabela S1, S2 e suas referências). Aplicando bioinformática abordagens para publicamente disponíveis conjuntos de dados de expressão de genes que encontramos que os genes com sítios de ligação previstos para SP TFs em seus promotores foram frequentemente desregulado em tumores de próstata, tanto em estágios iniciais e avançados da doença, apesar da falta de evidência direta de sobre-expressão de TFs Sp nestes tumores (Fig. S1). Além disso, descobrimos que muitos genes regulados negativamente pela MTM-SDK em uma linha de células de cancro do ovário e alvos putativos de Sp TFs foram sobre-representados entre os genes regulados positivamente em tumores da próstata primários e metastáticos (Fig. S1). Portanto, avaliamos o impacto dos novos análogos MTM-a na transcrição de genes Sp-regulados em células de câncer de próstata. Foram selecionados genes conhecidos por ser sobre-expressos em tumores da próstata e envolvido em vários aspectos da tumorigénese da próstata como a proliferação celular, apoptose e angiogênese (Tabela S1). células de cancro da próstata PC3 foram tratadas com 100 nM de MTM-SDK, MTM-SK ou veículo durante 24 h e os efeitos na expressão de genes foram avaliados por qRT-PCR. Esta dose foi escolhida com base no nosso trabalho anterior em células de cancro do ovário [27]. Além disso, verificou-se que 24 h de tratamento com doses ≤100 nM foi citotóxico minimamente (≤30% de redução da viabilidade celular; Fig. S2). Sob essas condições, o tratamento com MTM-SDK reduzido nível de mRNA de
C-MYC
,
hTERT
,
VEGFA
,
C-SRC
,
CCDN1
,
CCNE1
,
XIAP
,
MCL1
e
BIRC5
por ≥75% (Fig. 1A). Como foi mostrado anteriormente em células de cancro do ovário [27], MTM-SK foi ligeiramente menos eficaz do que MTM-SDK. O nível de
C-MYC
,
hTERT
,
VEGFA
,
C-SRC
e
CCDN
1 mRNA foi reduzida em MTM-SK células tratadas por 50-75% em comparação com células de controlo, enquanto que
XIAP
,
CCNE1
,
MCL1
e
BIRC5
foram minimamente ou não afectada.
células PC3 foram tratadas com 100 nM de MTM-SDK, MTM-SK ou veículo (DMSO) durante 24 h. A) A expressão de genes foi medida por qRT-PCR. Os dados foram normalizados para
B2M nível de ARN
e são apresentados como percentagem da expressão em comparação com as células tratadas com o veículo (controlo). Os dados representam a média ± DP de 3 experiências independentes. B) A ligação do SP1 para os promotores de
C-MYC
e
VEGF
no controle e células tratadas com droga foi determinada pelo chip usando um anticorpo específico anti-SP1. ADN em fracções de entrada e imunoprecipitadas foi quantificada por qPCR com iniciadores que abrangem o sítio de ligação Sp nos promotores de genes. Os dados (média ± DP) de 3 experiências independentes são expressos como percentagem de ADN de entrada em fracções imunoprecipitados. *, P 0,01; **, P 0,001. C) Nível de SP1, SP3 e ARNm Sp4 foi determinada por RT-PCR em células PC3 foram incubadas com 100 nM de MTM-SDK, MTM-SK ou veículo durante 24 e 48 h. GAPDH foi usada como controlo. D) nível de proteína de SP1, c-Myc, XIAP, e ciclina D1 foi determinada por imunotransf erência, em células PC3 foram incubadas com 100 nM de MTM-SDK, MTM-SK ou veículo durante 24 e 48 h.
MTM-a e os seus análogos ligam-se a elementos de ADN rico em GC e de prevenir a ligação de proteínas de ligação como os GC TFs SP para promotores de genes. Para determinar se os efeitos sobre a transcrição foram devido a inibição da ligação Sp, medimos a ligação do SP1 para o
C-MYC
e
VEGFA
promotor no controle e drogas células tratadas por cromatina imunoprecipitação . MTM-SDK e MTM-SK significativamente reduzida ligação do SP1 para o
C-MYC
e
VEGFA
promotor (Fig. 1B). MTM-SDK foi mais eficaz do que MTM-SK, de acordo com os dados de expressão gênica. Como as proteínas SP pode controlar a sua própria transcrição [3], avaliamos se MTM-SDK e MTM-SK afetado sua expressão. Sp1, Sp4 SP3 e são expressos em células PC3 e o tratamento com os análogos de MTM-A reduziu o nível de ARNm de SP1, SP4 e em menor medida Sp3 (Fig. 1C). Mais uma vez, MTM-SDK foi mais eficaz MTM-SK. Os níveis de proteína de alvos SP1 e SP, como c-Myc, também foram reduzidos por tratamento com MTM-SDK- e MTM-SK, de acordo com dados de mRNA (Fig. 1D).
MTM-SDK e MTM- SK inibir a proliferação de células cancerosas da próstata
a inibição do Sp TFs foi mostrado para afetar a proliferação e sobrevivência de células cancerosas. Foram examinados os efeitos antiproliferativos da MTM-SDK e MTM-SK em um painel de linhas celulares de cancro da próstata representam andrógeno-dependentes (AD) e (AI) tumores de próstata andrógeno-independente. células LNCaP são receptor de andrógeno (AR) positivo e depender de sinalização AR. 22Rv1 são AR positivo, mas AI. PC3 e DU145 são AR negativo e AI. O crescimento de todas as linhas celulares testadas, independentemente do seu estado de AR, foi fortemente inibida por ambos os compostos, com MTM-SDK sendo mais eficaz do que MTM-SK (Fig. 2). A IC
50 valores são apresentados na Figura 2. Além disso, o crescimento de células de cancro da próstata foi inibida por ≥50% em ≤100 nM de ambas as drogas. Notavelmente, as drogas não tiveram qualquer efeito nestas doses em fibroblastos humanos normais (Fig. 2). A viabilidade de fibroblastos normais foi afectada ligeiramente apenas com doses mais elevadas (~20-30% de inibição a 500 nM). Esta diferença de sensibilidade entre células normais e cancerosas em linha com os nossos dados anteriores que mostram que os fibroblastos normais foram mais resistentes do que as células de cancro do ovário para a indução de apoptose quando expostos a MTM-SDK [27].
O câncer de próstata células (DU145, 22Rv1, PC3 e LNCaP) e de culturas primárias de fibroblastos humanos normais (NHF) foram incubadas com os compostos durante 72 h. A viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT colorimétrico. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão de amostras em triplicado de 3 expericias independentes. IC
50 para cada tipo de célula são relatados no painel inferior.
Toxicidade de MTM-SDK e MTM-SK
A toxicidade sistémica é uma grande limitação para o uso clínico de MTM-A. Portanto, avaliamos as doses em que MTM-SDK e MTM-SK pode ser administrado com segurança aos ratos após administração tanto aguda como crónica. As doses máximas toleradas (DMT) de MTM-SDK e MTM-SK após uma única injecção IV foram de 4 mg /kg e 32 mg /kg, respectivamente (Tabela 1). O MTD da MTM-SK para o tratamento repetido era 8 e 18 mg /kg utilizando o q2d × 10 e Q3D × 10 horário, respectivamente. A MTD de MTM-SDK foi de 1,2 mg /kg e 1,8 mg /kg, respectivamente, quando administrado com a q2d × 10 × 10 e Q3D programação. Foram testados para comparação MTM-A e descobriram que os DMT foram de 1 mg /kg e 0,5 mg /kg para única ou repetida (q2d x 10) de administração, respectivamente. Além disso o aumento da dose de ambos MTM-SK que MTM-SDK e tratamento repetido resultou em perda progressiva de peso corporal e outros sinais de toxicidade crónica grave, incluindo diminuição da mobilidade, conjuntivite e neuropatia periférica. Em conclusão, as doses extremamente elevados de MTM-SK que MTM-SDK comparação com MTM-A poderia ser dado com segurança tanto como única e repetida injeções para ratos sem sinais de toxicidade.
Farmacocinética de MTM-SDK e MTM-SK
os níveis sanguíneos de MTM-SK e MTM-SDK foram medidos após injecções únicas IV na dose de 18 e 2 mg /kg (Fig. 3). Ambos os compostos foram rapidamente eliminado da circulação sanguínea com cinética geral semelhantes. Após 5 min níveis plasmáticos eram cerca de 20 e 0,7 mM para MTM-SK e MTM-SDK, respectivamente. Após 1 h, os níveis de MTM-SK e MTM-SDK eram aproximadamente 1 e 0,1 uM, respectivamente. Assim, os níveis de plasma de ambos os compostos eram iguais ou superiores a concentração necessária
In vitro
para a inibição do crescimento celular e supressão da transcrição dependente SP1. Em seguida, comparamos farmacocinética do MTM-SK seguintes única IV e injeções IP. Ao lado do pico inicial visto com a injecção IV, a cinética seguintes administração IV e IP foram bastante semelhantes, atingindo níveis de droga comparáveis no plasma dentro de 15-30 min e a manutenção de níveis semelhantes ao longo do período de 2 h de a análise (Fig. S3 ).
Os ratinhos (n = 3 /grupo) receberam uma única injecção IV de MTM-SK (a) ou MTM-SDK (B) e os níveis de plasma foram determinadas por LC-MS. Doses de MTM-SK e MTM-SDK foram de 18 mg /kg e 2 mg /kg, respectivamente.
MTM-SDK e MTM-SK inibir a expressão de genes em xenoenxertos de tumores de próstata humana
para determinar se os análogos de MTM-a foram capazes de interferir com a actividade do Sp TFs in vivo após a administração sistémica, os ratinhos portadores de xenoenxertos de tumores PC3 foram tratadas com uma única injecção IV de MTM-SDK (1,2 mg /kg), MTM -SK (8 mg /kg) ou solução salina. Os tumores foram excisados após 1, 3 e 7 dias após a níveis de ARN de genes regulados Sp seleccionados injecção e foram medidos por qRT-PCR. Expressão de
C-MYC
,
hTERT
,
VEGFA
,
C-SRC
,
CCDN1
,
CCNE1
,
XIAP
,
MCL1
e
BIRC5
diminuiu significativamente tanto pela MTM-SDK e MTM-SK às 24 h (Fig. 4). No entanto, houve uma diferença entre os dois compostos em a cinética da recuperação a partir da inibição da transcrição. O efeito do MTM-SDK durou mais tempo. A maioria dos genes ainda eram reprimidos por 30 a 50% após 3 dias. Mesmo depois de 7 dias
VEGFA
,
C-SRC
e
XIAP
ainda eram significativamente regulada para baixo. O efeito de MTM-SK foi invertida mais rapidamente com a maioria dos genes de retornar para controlar os níveis dentro de 3 ou 7 dias. Assim, ambas as drogas eram eficazes na redução da transcrição de genes regulados por Sp quando administrado sistemicamente a murganhos, confirmando a acumulação das concentrações de drogas activas no tecido do tumor. Além disso, o efeito de MTM-SDK foi mais pronunciada e persistente em comparação com MTM-SK, consistente com
In vitro
dados sobre ligação SP1 e expressão do gene.
Ratos (n = 4 /grupo ) com tumores subcutâneos foram tratados com uma única injecção IV de MTM-SDK, MTM-SK ou solução salina estéril. Doses de MTM-SK e MTM-SDK foram de 8 mg /kg e 1,2 mg /kg, respectivamente. Os tumores foram colhidas 1, 3 e 7 dias após a injecção de drogas. A expressão de genes foi avaliada por meio de qRT-PCR. Os dados representam a média ± SD de o nível de transcrição normalizada para B2M ARN e são apresentados como percentagem da expressão em comparação com ratinhos de controlo que receberam solução salina estéril. *, P 0,01; **, P . 0.001
MTM-SDK e MTM-SK inibir o crescimento de xenoenxertos de tumor da próstata
A actividade anti-tumoral de MTM-SDK e MTM-SK foi examinado utilizando xenoenxertos de tumores subcutâneos de células cancerosas da próstata PC3. células PC3 são AI, altamente tumorigénicas e metastático. Assim, estas células representa um bom modelo de cancro da próstata avançado resistente à castração. Os ratinhos portadores de xenoenxertos de tumores PC3 recebeu MTM-SDK (0,6, 1,2 e 1,8 mg /kg, Q3D x 10) e SK-MTM (4, 8 e 12 mg /kg), a cada 3 dias por injecções IP. A administração IP foi escolhido como é comumente usado para tratamentos prolongados com compostos anticancerígenos. Além disso, IV e IP injecções eram quase equivalentes em termos de níveis de plasma e farmacocinética. As doses e o calendário de administração também foram baseados nos dados farmacocinéticos e MTD descritos acima. O tratamento foi encerrado quando os ratos em grupos de controlo tiveram de ser sacrificados devido à carga tumoral excessiva. ratinhos tratados com a droga foram seguidos durante mais uma semana após o final do tratamento. O tratamento com MTM-SDK e MTM-SK reduziu o crescimento do tumor (Fig. 5A-B). A diferença entre os ratos tratados e não tratados foi estatisticamente altamente significativa em todas as doses testadas. Depois de o tratamento ter sido interrompido, o crescimento dos tumores subcutâneos lentamente retomado com uma cinética ligeiramente mais rápido no caso de as doses mais baixas de MTM-SK. Isto está de acordo com os dados farmacodinâmicos, indicando uma recuperação mais rápida da expressão do gene após o tratamento MTM-SK. É interessante notar, no entanto, mínima novo crescimento do tumor foi observada em ratos tratados com a dose mais elevada de MTM-SK. O tratamento com MTM-SDK e MTM-SK resultou numa ligeira perda de peso corporal, o que estava correlacionado com o nível de dose, mas não estatisticamente significativa (Fig. 5C-D). Não havia sinais de toxicidade aguda ou irritação local no sítio da injecção foram observadas durante o tratamento. Dois ratinhos tratados com a dose mais elevada de MTM-SDK (1,8 mg /kg) mostraram sinais de toxicidade (por exemplo, diminuição da mobilidade, neuropatia periférica) após injecções múltiplas. Estes ratos foram retirados do tratamento e não foram incluídos na avaliação da actividade antitumoral. Uma vez que a mesma dose foi administrada com segurança a ratinhos portadores não-tumorais, a toxicidade observada com esta dose poderia ser devido à presença do tumor ou diferenças de estirpe de ratos ou sexo.
Os ratinhos com tumores subcutâneos foram tratados com as doses indicadas de MTM-SDK, MTM-SK ou solução salina estéril (controlo) administrada por injecções IP duas vezes por semana durante cinco semanas (Q3D x 10). O volume do tumor (A) e do peso corporal (B) foram medidos duas vezes por semana. Os resultados são expressos como média ± DP do volume do tumor em cada grupo. As setas indicam a iniciar e no final do tratamento. **, P . 0.001
MTM-SDK e MTM-SK inibir o crescimento do câncer de próstata metastático
Estávamos interessados em determinar se o tratamento com os análogos MTM-A foi também eficazes num modelo de cancro da próstata metastático. Para este fim, utilizou-se um modelo de metástase pulmonar experimental para estudar os efeitos do tratamento sobre as células cancerosas humanas disseminadas em ratinhos imunodeficientes. células PC3 foram injectados na veia da cauda de ratos e o crescimento de metástases do pulmão foi monitorizada por qPCR ao longo de um período de 4 semanas [42]. Um grupo de ratinhos de controlo não tratados foi sacrificado após a primeira e segunda semana da injecção de células tumorais. Nesta altura, os pulmões continha 0,015 e 0,135% de células humanas, respectivamente, confirmando a implantação e a proliferação das células cancerosas injectadas humanos (Fig. 6A). A partir daí, os ratinhos receberam cada 3 dias injecções de IP-MTM SDK (1,2 mg /kg), MTM-SK (8 mg /kg) ou veículo. Grupos de controlo e ratos tratados com o fármaco foram sacrificados dois dias após a segunda e a quarta injecção e os seus pulmões examinados relativamente à presença de metástases. Neste momento, os ratos de controlo continham 2,08% e 5,94%, respectivamente, das células cancerosas humanas consistentes com a expansão dos focos metastáticos no pulmão (Fig. 6A). Em vez disso, os ratinhos tratados com MTM-SDK tinha 0,14% e 0,09% e aqueles tratados com MTM-SK tinha 0,43% e 0,42% de células cancerosas humanas após a segunda e a quarta injecção, respectivamente. Assim, o crescimento de células metastáticas humanos disseminada foi quase completamente suprimida pelo tratamento. Os dados qPCR foram confirmadas por exame histológico de secções de pulmão tomadas no final da experiência (Fig. 6B). Múltiplos nódulos metastáticos foram detectados no pulmão de ratinhos de controlo, ao passo que não houve metástases detectável por exame microscópico de cortes seriados dos pulmões dos animais tratados com o fármaco.
os ratinhos receberam PC3 por injecção IV na veia da cauda e depois a partir de 3 semanas mais tarde receberam injecções IP de MTM-SDK, MTM-SK ou solução salina esterilizada, duas vezes por semana durante duas semanas. As doses de MTM-SK e MTM-SDK foram de 8 mg /kg e 1,2 mg /kg, respectivamente. A) avaliação qPCR de metástase pulmonar. Os ratinhos de controlo foram sacrificados 1 e 2 semanas antes do tratamento e depois controlar e ratinhos tratados com o fármaco foram sacrificados no final da primeira e segunda semanas de tratamento. Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão da percentagem de células humanas em relação ao número total de células de ratinho no pulmão (n = 3). As setas indicam o momento da injecção de drogas. B) A avaliação microscópica de metástase pulmonar. O tecido pulmonar foi recolhido a partir de ratinhos de controlo e tratados com droga no fim da experiência e corados com H E para exame histológico. As secções representativas são mostradas (20 ×). **, P . 0.001
fatores de transcrição da família Discussão
Sp controlar muitos processos celulares essenciais para o desenvolvimento de tumores humanos [3]. Diversas estratégias têm sido exploradas nos últimos anos para interferir com a actividade do FT Sp incluindo compostos naturais e pequenos RNAs interferentes. derivados do ácido Aureolic, como MTM-A, são inibidores eficazes de Sp TFs [15], [18], [19], [20]. Estes compostos ligam-se ao ADN rico em GC e de evitar a interacção do TFs com sequências ricas em GC em promotores de genes. Além disso, uma vez que Sp TFs controlar a sua própria transcrição, MTM-A reduz o nível de proteínas SP, reforçando assim o efeito sobre a actividade de transcrição [21], [34]. Vários factores podem influenciar as propriedades farmacológicas e toxicológicas dos antibióticos aureolic: afinidade para sequências ricas em GC, cinéticas de associação /dissociação ao DNA, capacidade para competir com proteínas Sp para a ligação a DNA e a absorção celular [17], [20], [ ,,,0],27], [43].