Abstract
Microenvironment enrijecimento desempenha um papel crucial na tumorigênese. Enquanto filopios são geralmente pensado para ser um dos mechanosensors celulares para sondar rigidez ambiental, os efeitos da rigidez ambiental sobre as actividades filopoidais de células de cancro permanecem obscuros. Neste trabalho, investigamos as atividades filopoidais de células de adenocarcinoma de pulmão humano CL1-5 cultivadas em substratos de rigidez ajustável usando uma plataforma de romance. A plataforma consiste de um sistema óptico de iluminação estruturada chamados nano-perfilometria, que permite a visualização em tempo decorrido de actividade filopoidais sem marcação por fluorescência. Os substratos de cultura foram feitos de policloreto de vinilo misturado com um plastificante do meio ambiente, para se obter o módulo de Young compreendido entre 20 e 60 kPa. Estudos de viabilidade celular mostrou que a viabilidade das células cultivadas sobre os substratos foi semelhante àqueles cultivadas em elastómeros vulgarmente utilizados tais como polidimetilsiloxano. imagens de células vivas tempo decorrido foram adquiridos e as atividades filopoidais em resposta a substratos com diferentes foram analisados graus de rigidez. A análise estatística revelou que as células de cancro do pulmão cultivadas em substratos macios parecia ter mais filopios, densidades filopoidais mais elevados em relação ao perímetro celular, e as taxas de retracção mais lento filopoidais. No entanto, a análise temporal das atividades filopoidais revelou que se um filopodium decide estender ou retrair é puramente um processo estocástico sem dependência de rigidez substrato. A discrepância das actividades filopoidais entre as células de cancro do pulmão cultivadas em substratos com diferentes graus de rigidez desapareceu quando as actividades de miosina II foram inibidas por tratamento das células com blebbistatin, o que sugere que as actividades filopoidais estão intimamente modulada pela força de adesão das células. Nossos dados quantitativamente relacionar as actividades filopoidais de células de câncer de pulmão com rigidez ambiental e deve lançar luz sobre o entendimento e tratamento de progressão e metástase do câncer
Citation:. Liou YR, Torng W, Kao YC, Sung KB, Lee CH , Kuo PL (2014) de substrato de rigidez Regula filopoidais Actividades em células de câncer de pulmão. PLoS ONE 9 (2): e89767. doi: 10.1371 /journal.pone.0089767
editor: Chih-Hsin Tang, China Medical University, Taiwan
Recebido: 13 de junho de 2013; Aceito: 26 de janeiro de 2014; Publicação: 27 de fevereiro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Liou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Os autores agradecemos o apoio financeiro com os números de concessão NSC 100-2112-M-001-022-MY3 e NSC101-2220-e-002-011 fornecidos pelo Conselho Nacional de Ciência de Taiwan (https://web1.nsc.gov. tw /) e conceder número 101-EC-17-a-19-S1-174 fornecido pelo Ministério dos Assuntos Económicos de Taiwan (https://www.moea.gov.tw/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Microenvironment rigidez desempenha um papel crucial no desenvolvimento e progressão do câncer. Endurecimento da matriz extracelular resultando do aumento da reticulação do colagénio ocorre durante a tumorigénese [1], [2]. O endurecimento da matriz afecta a motilidade celular, dirige a migração de células cancerosas, e pode ainda estar relacionado com a metástase específico do órgão [3]. matriz rígida promove a estabilidade das células de adesão focal, o que aumenta a sinalização de factor de crescimento intracelular e, por sua vez aumenta a transformação das células de tumor e o crescimento [2], [4]. Por exemplo, foi recentemente mostrado que várias linhas celulares de cancro de pulmão cresceram melhor em substratos mais rígidos [5], e que a redução de stifferening matriz através da inibição da progressão do tumor impedido lisil-oxidase mediada por colagénio de ligação cruzada [6]. Entender como as células cancerosas perceber e responder à rigidez do ambiente deveria constituir informações valiosas sobre os meandros da progressão do câncer e ajudar na melhoria das estratégias de tratamento.
filopódios, saliências semelhantes a dedos, nas bordas de células, são geralmente observadas em altamente células de cancro metastáticas, tais como CL1-5, altamente invasivos de células de adenocarcinoma do pulmão humano [7], [8]. A morfologia única e actividades altamente dinâmicos de filopios torná-los adequados para organelos intrinsecamente sondagem rigidez ambiental. Filopódios normalmente estender e retrair dentro de uma escala de tempo de dezenas de segundos, enquanto sua longa duração e alta relação de superfície-volume permitem uma interação íntima com o microambiente. retracção filopoidais envolve o fluxo retrógrado de F-actina devido principalmente a contracção de miosina II, [9], enquanto que as actividades de miosina estão positivamente correlacionados com a rigidez do substrato [4], [10]. Assim, pensa-se que filopios pode actuar como mechanosensors celulares por sondagem rigidez ambiental a retracção. Recentemente, o substrato dinâmica sensível à rigidez de filopios foi demonstrada em cones de crescimento neuronal e explicada por um modelo estocástico com base no “motor de embraiagem” hipótese de [11], [12]. O modelo prevê que a taxa de fluxo retrógrado impulsionado-miosina de aumentos de F-actina e diminui a força de tração filopoidais com o aumento da rigidez substrato. Os resultados experimentais confirmaram que a filopios destacada do substrato mais frequentemente com maior rigidez do substrato. Se estas previsões e observações pode ser generalizado para as células cancerígenas, pode-se esperar que as actividades filopoidais globais de uma célula de cancro, tais como a distribuição de comprimento filopoidais e densidade também seria regulada pela rigidez do substrato. Isso é importante porque a presença e as atividades de filopódios em células cancerosas são pensados para ser correlacionada com a capacidade da célula de câncer de casa para os vasos sanguíneos e invadir os tecidos [7], [13] – [15].
No entanto , os efeitos de rigidez do substrato sobre as actividades filopoidais de células de cancro permanecem incertos, devido a várias limitações da técnica. Os diâmetros de filopios variam tipicamente de uma a três centenas de nanometros, que estão na margem do limite de resolução da microscopia óptica convencional. Consequentemente, a maioria das imagens de células vivas sobre as atividades filopoidais foram retirados de neurônios embrionários proteína-transf-actina fluorescentes, que têm grande filopódios em cones de crescimento. No entanto, a expressão aumentada do complexo de proteína actina fluorescente transfectadas podem alterar as atividades filopoidais, enquanto a fototoxicidade trazido pela luz de excitação pode afetar as atividades celulares e mudar a dinâmica do filopódios [16], [17].
neste trabalho, investigamos os efeitos da rigidez substrato sobre as atividades filopoidais das células de câncer de pulmão CL1-5 usando uma técnica de imagem recém-desenvolvida chamada estruturada-iluminação nano-perfilometria (SINAP), que utiliza a sensibilidade topográfica para aumentar o contraste da imagem de um filopodium em superfícies planas e permite a livre-label, visualização tempo decorrido das atividades filopoidais a uma taxa de quadros de até 0,2 Hz [18], [19]. Para melhorar o contraste de imagem entre filopodia e o meio circundante, o cloreto de polivinilo (PVC), materiais de base com elevados índices de refracção e rigidez sintonizável foram adaptados para cultura de células. A biocompatibilidade dos substratos à base de PVC foi avaliada utilizando o ensaio de MTT [20]. Foram quantificados os actividades filopoidais de células individuais através da medição da densidade filopoidais (isto é, o número de filopios por unidade de comprimento das periferias celulares), o comprimento filopoidais média, a extensão e retracção filopoidais taxas, e a probabilidade de extensão /retracção de filopios indivíduo , a qual é definida como a fracção de tempo em que uma filopodium passou para a extensão /retracção. Para determinar se o efeito da rigidez do substrato sobre as actividades filopoidais é dependente de actividades de miosina II, que também mediu a alteração das actividades filopoidais quando as células cultivadas em substratos com diferentes graus de rigidez foram tratados com blebbistatin, um inibidor da miosina II.
resultados
Caracterização dos substratos à base de PVC
os substratos de cultura foram feitas de uma mistura de PVC e um ambientalmente amigável, carboxilato tipo plastificante, di (isononilo) ciclo-hexano-1, 2-dicardoxylate (DINCH). A rigidez da mistura foi afinado por ajuste da proporção do PVC para o plastificante, enquanto que proporções maiores resultou em compósitos mais duras. módulos dos compósitos de PVC de Young, tal como medido através da aplicação de compressão sequencial para os materiais a granel, foram 20,2 ± 2,5 kPa (
N
= 6), 35,7 ± 0 kPa (
n = 1
), e 61,1 ± 12,9 kPa (
n
= 6) para PVC 01:01, PVC 02:01, e PVC 03:01 respectivamente. Aqui, o PVC 01:01, 02:01 e 03:01 referem-se aos compostos de PVC com razões de PVC para o plastificante sendo 01:01, 02:01 e 03:01, respectivamente. Estes dados indicam que a rigidez dos materiais compósitos de PVC está dentro da gama da maioria dos tecidos em condições malignas [21].
O princípio de funcionamento de SINAP requer que o substrato de cultura tem um índice de refracção diferente daquela das células a melhorar a relação sinal-ruído das imagens. Os índices de refracção dos compósitos de PVC foram determinadas utilizando o novo tomografia holográfica digital como recentemente descrito [22]. Os índices de refracção medidos do PVC e do plastificante foram 1,53-1,57 e 1,47, respectivamente. Deste modo, os índices de refracção resultantes do compósito de PVC variou 1,47-1,53, que é muito próximo do do vidro (-1,5) e maior do que a de células (~1.36) [23].
o teste de viabilidade celular foi usada para determinar se a biocompatibilidade dos materiais compósitos de PVC é compatível com outros substratos compatíveis vulgarmente utilizadas para a cultura de células. Conduzimos ensaios MTT de células de adenocarcinoma do pulmão humano CL1-5 cultivadas em vidro, os compostos de PVC, poliacrilamida geles (PA), e poli (dimetil) siloxano (PDMS). A Figura 1 mostra as imagens típicas das células cultivadas sobre as diferentes substratos. O ensaio de MTT quantifica células activas metabólicas como a densidade óptica (OD) a 570 nm. Como mostrado na Fig. 2, as células cultivadas sobre o vidro e gel de PA tinha o maior viabilidade quando comparados com outros substratos elastoméricos. As viabilidades de células cultivadas em compósitos de PVC e que os substratos de PDMS foram semelhantes. Não houve diferença significativa na viabilidade celular entre o PVC 03:01, 02:01, e 01:01. Isto indica que a biocompatibilidade dos materiais compósitos de PVC é semelhante ao de outros substratos elastoméricos habitualmente utilizados e não afectadas por variação da proporção do PVC para o plastificante.
O PVC 1:01, 2:01, e três :1 referem-se aos compostos de PVC com razões de PVC para o plastificante sendo 01:01, 02:01 e 03:01, respectivamente; PA e PDMS são abreviados por poliacrilamida e poli (dimetil) siloxano, respectivamente. Barra de escala = 100 pm.
O corante tem uma cor púrpura e foi quantificada pela absorvência óptica a 570 (
N
= 8, 5, 4, 4, 3, e 3 para o vidro, PVC 03:01, PVC 02:01, PVC 01:01, gel PA, e do substrato PDMS respectivamente).
Efeitos da rigidez substrato sobre o comprimento filopoidais e densidade
Para determinar se as actividades filopoidais são afectados pela rigidez do substrato, as células foram semeadas em CL1-5 o PVC 01:01, 03:01 de PVC, e substratos de vidro. Os substratos foram revestidos com fibronectina antes de semeadura de células para facilitar a fixação das células. A imunocoloração contra a fibronectina revestido confirmou que a fibronectina absorvida tinham concentrações de superfície semelhantes entre os três tipos de substratos; as proporções da intensidade de fluorescência média da fibronectina corada para o fundo do substrato foram de 1,64, 1,59, e 1,41 para o PVC 01:01, 03:01 de PVC, e substratos de vidro, respectivamente. módulos dos compósitos de PVC de Young foram cerca de 60 kPa e 20 kPa para a 03:01 PVC e 01:01, respectivamente, enquanto o módulo de vidro de Young é da ordem de GPa. imagens de células vivas foram adquiridos utilizando um sistema SINAP. SINAP imagens típicas para as células de cancro cultivadas em PVC 01:01, 03:01 de PVC, e o substrato de vidro são mostrados na Fig. 3, em que filopódios são caracterizados como finas, saliências brilhantes com vários comprimentos nas periferias celulares.
Barra de escala = 5 mm.
Foi observado que o número de filopódios por célula variaram de 50 a 70. para as células individuais, identificamos todos filopódios visível e calcularam a densidade e comprimento médio do filopódios, referido como
f
d e
f
L, respectivamente. A densidade filopoidais foi definida como a razão entre o número de filopios para o perímetro da célula. A Figura 4A mostra a variação da
f
d amostrados a partir de células cultivadas em PVC 01:01, 03:01 de PVC, e substratos de vidro, respectivamente. As células cultivadas sobre a 01:01 de PVC tinha a maior
f
d (média = 0,55 uM
-1, o número de células = 33), seguido pelas células cultivadas na PVC 3: 1 (média = 0,31 mm
-1, número de células = 18) e que cultivadas no vidro (média = 0,31 mm
-1, número de células = 43). A análise estatística revelou que há diferença significativa entre os resultados do PVC 01:01 e 03:01 (
P
= 4,4 × 10
-9), e o PVC e o vidro 1:01 (
P
= 1,1 × 10
-9), enquanto não há nenhuma diferença significativa entre os resultados do PVC 03:01 e o vidro (
P
= 0,75). Consistentemente, como mostrado na Fig 4B, o
f
L de células cultivadas sobre a 01:01 de PVC foi significativamente mais longa do que a das células cultivadas sobre a 03:01 de PVC (
P
= 8,8 × 10
-4) eo vidro (
p
= 2,2 × 10
-4), enquanto não há nenhuma diferença significativa entre a do PVC 03:01 e o vidro (
p
= 0,67). Os meios de
f
L foram 3,77, 3,08, e 3,03 mm para a 01:01 de PVC, PVC 03:01, e vidro, respectivamente. Estes dados indicam que quando as células cancerosas são cultivadas em substratos elastoméricos, as células que crescem em substrato mais macia e ter mais longo filopios.
A densidade filopoidais foi definida como o número de filopios por unidade de comprimento do perímetro celular. O comprimento filopoidais-se a média de todos os filopios visível da célula. As barras representam as médias das variáveis e os erros denotam os desvios padrão calculados a partir de 33, 18, e 43 para as células a 1:01 de PVC, PVC 03:01, e substratos de vidro, respectivamente. Foram encontradas diferenças significativas entre os dados de PVC 01:01 e 03:01, e PVC 01:01 e vidro com que ** indica p
Art . 0,01
Effects da rigidez do substrato sobre a dinâmica de extensão filopoidais e retração
Perguntamos se o filopódios têm diferentes taxas e probabilidades para estender ou retrair quando as células cancerosas foram cultivadas em substratos de diferentes graus de rigidez. Especificamente, nós fundamentado que o filopódios de células cancerosas cultivadas em substratos mais rígidos podem ter uma maior propensão para retrair, o que leva a um menor
f
D e um curto
f
L, como mostrado na Fig. 4. Para analisar a retracção e estendendo dinâmica de filopódios indivíduo, imagens SINAP de tempo decorrido de células vivas foram levados um quadro a cada 10 segundos durante cinco minutos. Apenas filopódios durou mais de um minuto (isto é, aparecendo em 6 quadros consecutivos) foram rastreadas e os comprimentos filopoidais instantâneos foram medidos a partir quadros individuais. Um perfil temporal de um comprimento representativo filopodium rastreados está representado na Fig. 5. O filopodium tinha um comprimento inicial de 0,92 uM no início do acompanhamento, continuamente estendido durante 100 segundos, e retraída para 1,02 ^ M no final da aquisição da imagem. Foram calculadas as taxas de variação de comprimento entre quadros consecutivos e referiu mudanças positivas como extensão e negativo como taxas de retração. Isto produziu um conjunto de taxas de extensão /retração associados com vários comprimentos filopoidais. Por exemplo, as taxas de extensão para o filopodium mostrado na Fig. 5 são 0,004, 0,04 e 0,001 μm⋅s
-1 no comprimento filopoidais de 0,92, 1,14 e 1,79 mm, respectivamente. Nós rastreamos 51, 59, e 34 filopódios para as células cultivadas sobre o PVC 01:01, PVC 03:01, e substratos de vidro, respectivamente. Assumiu-se que as células cultivadas sobre o mesmo tipo de substratos têm dinâmica filopoidais semelhantes e reuniram-se os dados de taxa de acordo com o tipo de substratos de cultura. Para facilitar a comparação dos dados da taxa em vários comprimentos filopoidais, nós variados os dados com um conjunto de intervalos de comprimento separados pela mesma abertura. Em primeiro lugar, escolheu 2 mm como a distância; ou seja intervalo de 1 referido filopoidais ≥0 comprimento e 2 mm, gama 2 a que se refere filopoidais comprimento ≥2 uM e 4 mm, e assim por diante. A Figura 6 resume a variação dos dados da taxa em toda as gamas de comprimento definido para as células cultivadas sobre os três tipos de substratos. As barras representam as médias dos dados de taxa de variados no intervalo de comprimento e os erros denotam os desvios padrão. Em geral, as taxas de extensão exibiu uma tendência para diminuir à medida que o comprimento filopoidais aumentada, enquanto as taxas de retracção apareceu a aumentar à medida que o comprimento aumentado, com um máximo local em comprimento de 11, 7, e 7 ^ M para as células cultivadas na PVC 1:01, 3:01 de PVC, e substratos de vidro, respectivamente. Observou-se uma tendência similar quando assorting os dados utilizando diferentes lacunas, tais como 1 ou 0,5 mM para os intervalos de comprimento. Note-se que na Fig. 6, os dados de taxa de as células sobre substratos mais macios mediu gamas de maior comprimento, o que é consistente com os resultados mostrados na Fig. 4B.
A célula foi cultivado em substrato de vidro. O comprimento filopoidais foi de 0,92 uM no início de aquisição de imagem, continuamente estendido para 1,81 uM, e retraída para 1,02 ^ M no final da aquisição da imagem. As imagens SINAP correspondentes aos dados de comprimento marcados por círculos são mostrados no lado direito e anotada com o tempo de gravação. O filopodium rastreados foi destacado pela seta na imagem 1
st.
(A), (B) e (C) mostrar a relação entre as taxas de extensão e comprimentos filopoidais para o células cultivadas sobre o PVC 01:01, PVC 03:01, e substrato de vidro, respectivamente; (D), (E) e (F) mostra a variação das taxas de retracção em relação a vários comprimentos filopoidais para as células cultivadas na PVC 01:01, 03:01 de PVC, e o substrato de vidro, respectivamente. As barras representam as médias dos dados de taxa de variados nas gamas de comprimento e os erros denotam os desvios padrão. Os dados foram sorteados em um conjunto de categorias de comprimento, separados por 2 m. Os números de filopódios rastreados para a medição da frequência são 51, 59, e 34 para o PVC 01:01, PVC 03:01, e substratos de vidro, respectivamente.
Substrato rigidez afetou significativamente as taxas de retração quando comprimento filopoidais ultrapassado uma certa escala. Verificou-se que a significância apareceu quando a escala foi ajustado para ser de 4 mm, que é de cerca de os meios de a
f
L mostrados na Fig. 4B. Para cada filopodium rastreados, nós aglomeradas os dados de taxa mensurados ao filopoidais comprimento ≥4 mm e calculados os meios. Nós nos referimos aos meios de a extensão e as taxas de retração como
V
E e
V
R respectivamente. Juntamos o
V
E e
V
R calculado a partir de células cultivadas no mesmo tipo de substrato e variados os dados em um conjunto de intervalos de taxas que foram igualmente separados por 0,02 μm⋅s
-1. A probabilidade de ocorrência de uma gama determinada taxa foi assim estimada pelo cálculo da fração de dados variados para a faixa de interessados. A Figura 7 ilustra a distribuição de probabilidade de as taxas de extensão e retracção estimados para as células cultivadas sobre os três tipos de substratos. As linhas a cheio, a tracejado, e pontilhadas representam distribuição normal adapta aos dados de vidro, PVC 03:01, e 01:01, respectivamente de PVC. A análise estatística revelou que não houve diferença significativa entre o
V
E para células cultivadas em três substratos (
p
= 0,17). Os meios de
V
E foram 0,052, 0,064 e 0,054 μm⋅s
-1 para as células cultivadas sobre o PVC 01:01, PVC 03:01, e o substrato de vidro, respectivamente . No entanto, a
V
R para as células cultivadas sobre a 01:01 de PVC foi significativamente mais lento do que o do vidro (
P
= 0,02), ao passo que as diferenças de
V
R entre as células de cultura na PVC 1:01 e o 03:01 do PVC (
P
= 0,31) e que o PVC de 3:01 e o vidro (
p
= 0,05) não foram significativas. Os meios de
V
R foram 0,059, 0,063 e 0,069 μm⋅s
-1 para as células cultivadas sobre o PVC 01:01, PVC 03:01, e o substrato de vidro, respectivamente . Estes resultados sugerem que o filopios de células cultivadas em substratos macios parecem retrair mais lenta quando a duração filopoidais excede o comprimento médio.
Os dados foram sorteados em uma série de intervalos de taxas que foram igualmente separadas por 0,02 μm⋅s
-1. As linhas a cheio, a tracejado, e pontilhadas representam distribuição normal adapta aos dados de vidro, PVC 03:01, e 01:01, respectivamente de PVC. Os coeficientes de determinação (ou seja,
R-
quadrado) para os três acessórios são . 0,9
Para quantificar a tendência de retração filopoidais quando as células foram cultivadas em substratos de particular rigidez, definimos a probabilidade de que um filopodium prefere retratar como (1) onde
t
e e
t
R denotam as fracções de tempo que o filopodium gastos para extensão e retracção respectivamente. Desde que foram principalmente interessados na dinâmica filopoidais que afetam os meios de o
f
L, foram excluídos apenas os dados temporais após o comprimento filopoidais superior foram consideradas 4 um e os períodos que o comprimento filopoidais permaneceram estacionárias . Note-se que a estender e retrair a probabilidade de filopodium são o mesmo se
P
R é igual a 0,5. A Figura 8 mostra a distribuição de probabilidade de o
P
R calculada a partir das células cultivadas sobre as três tipos de substratos. Mais uma vez, as linhas a cheio, a tracejado, e pontilhadas representam distribuição normal adapta aos dados de vidro, PVC 03:01, e 01:01, respectivamente de PVC. A análise estatística revelou que não houve diferença significativa entre o
P
R de células cultivadas sobre os três tipos de substrato (
p
= 0,54). Os meios de
P
R foram 0,48, 0,48, e 0,47 para o PVC 01:01, PVC 03:01, e vidro, respectivamente. Estes resultados sugerem que se um filopodium decide estender ou retrair é puramente um processo estocástico sem dependência de rigidez substrato. Assim, a variação do
f
L entre substratos de diferentes graus de rigidez resultou principalmente das taxas variadas de retração filopoidais, que foi impulsionado principalmente pelo miosina II contração e dependente da rigidez substrato.
a tendência de retração foi definida como a fração de tempo que o filopodium passou para a retração. As linhas a cheio, a tracejado, e pontilhadas representam distribuição normal adapta aos dados de vidro, PVC 03:01, e 01:01, respectivamente de PVC. Os coeficientes de determinação (ou seja,
R-
quadrado) para os três acessórios são . 0,9
tratamento blebbistatin altera atividades filopoidais
Uma vez que a rigidez do substrato regula a força de adesão celular e miosina II actividades [10], nos perguntamos se a discrepância observada de comprimento filopoidais e densidade entre as células cultivadas em substratos de diferentes graus de rigidez desaparece se as atividades de miosina foram inibidas. Em primeiro lugar, examinou as viabilidades e atividades filopoidais de células cancerosas tratadas com blebbistatin de várias concentrações. As células foram cultivadas CL1-5 em substratos de vidro durante 24 horas e expostas a soluções contendo 10-30 uM blebbistatin durante 1 hora para inibir as actividades de miosina, como referindo-se a uma literatura recente [24]. Estudos de viabilidade celular utilizando o ensaio de MTT revelou que o tratamento de 10-30 uM blebbistatin não trazer a células CL1-5 toxicidade significativa (Fig. 9), enquanto que a densidade e filopoidais comprimento médio aumentou com o aumento da blebbistatin concentrações (Fig. 10) . A análise estatística revelou que a densidade filopoidais de células cancerígenas tratadas com 30? M blebbistatin foi significativamente maior do que o tratado com 0 (
P
= 0,006) e 10 uM blebbistatin (
P
= 0,03), mas não houve diferença significativa entre esse tratadas com 0 e 10 uM (
P
= 0,1). Da mesma forma, o comprimento filopoidais de células cancerosas tratadas com blebbistatin 30 mM foi significativamente maior do que o tratado com 0 (
p
= 3,2 × 10
-5) e 10 blebbistatin? M (
p
= 0,02), e não houve diferença significativa entre essa tratados com 0 e 10? M (
p
= 0,01).
As células foram cultivadas em substratos de vidro para 24μM de DMSO ou blebbistatin para 1 hora (
N
= 5 para cada concentração). As densidades ópticas de células sem aplicação dos reagentes foram referidos como controlo (
N
= 8). As barras representam as médias das variáveis e os erros denotam os desvios-padrão.
As barras representam as médias das variáveis e os erros denotam os desvios-padrão calculados a partir de 43, 24 e 31 células tratadas com 0, 10, e 30 uM, respectivamente blebbistatin. A marca * indica
p
. 0,05
Para atingir bloqueio significativo de actividades de miosina, que cultivaram as células CL1-5 sobre o PVC 01:01, PVC 03:01 e substratos de vidro e tratou-se as células com uma solução de blebbistatin 30 uM durante 1 hora. A Figura 11 demonstra o campo brilhante e as imagens imunocoloração representativa de células que foram tratados e não tratados com blebbistatin. Calculou-se o número de vinculin manchado por células. Afigura-se que o tratamento de células aumentou blebbistatin arredondamento em todos os três tipos de substratos e uma maior alongamento filopoidais e ramificação, mas reduziu o número de adesões focais de células cultivadas em substratos mais rígidos. A média eo desvio padrão do número vinculin por célula foram 53,2 ± 28,3, 93,6 ± 30,3 e 155,8 ± 35,5 para as células cultivadas sobre o PVC 01:01 (
n
= 5), PVC 03:01 (
n
= 5) e substrato de vidro (
n
= 8) sem tratamento bleddistain. Após a exposição bleddistain, os números alterado para 40,5 ± 13,6, 51,7 ± 19,5, e 101,6 ± 22,3 para as células cultivadas sobre a 01:01 de PVC (
N
= 3), de PVC 03:01 (
N
= 4), e o substrato de vidro (
N
= 9).
(A), (B) e (C) são as imagens de campo claro de células tratadas com regulares meio de cultura como controlo; (D), (E) e (F) são as suas imagens de imunofluorescência correspondentes do núcleo (azul) e vinculin (verde); (L) – (L) mostra o campo brilhante e as imagens correspondentes immunofluroresence de células tratadas com blebbistatin 30 pM durante uma hora para inibir a actividade da miosina II. Barra de escala = 10 uM.
A análise estatística revelou que, depois de expostos a blebbistatin 30 pM durante uma hora, a diferença de
f
D entre as células de cultura na PVC 01:01 e 03:01 PVC tornou-se insignificante (
p
= 0,11), e
p valor
para a importância do
f
D diferença entre esse no PVC 01:01 eo vidro diminuiu (
p
= 0,0069) em comparação com que, sem o tratamento blebbistatin (
p
= 1,1 × 10
-9). Além disso, o tratamento blebbistatin significativamente aumentada
f
D, com um aumento mais significativo em células cultivadas em PVC 03:01 (
p
= 0,046 para o PVC 01:01,
p
= 2,1 × 10
-6 para o PVC3:1, e
p
= 0,006 para o vidro). Os números de células foram amostrados 10, 13, e 31 para o PVC 01:01, 03:01 de PVC e vidro, respectivamente. A Figura 12A resume a alteração de
f
D para células expostas a blebbistatin durante uma hora. Note-se que os resultados mostrados na Fig. 4A foram representados graficamente ao lado destas barras para comparação
As barras brancas representam as médias dos dados medidos a partir de células sem tratamento blebbistatin (isto é, os dados na Fig. 4).; as barras a cinzento indicam as médias dos dados medidos a partir de células com tratamento blebbistatin; e os erros especificar os desvios-padrão dos dados. Os números de células tratadas com blebbistatin são 10, 13, e 31 para o PVC 01:01, 03:01 de PVC, e substratos de vidro, respectivamente. # E ## denotam
P
0,05 e
P
0,01, respectivamente, para a diferença entre os dados adquiridos a partir do mesmo tipo de substratos com e sem tratamento blebbistatin; * E ** são anotados para
p Art 0,05 e
p Art 0,01, respectivamente, para a diferença entre os dados adquiridos a partir de diferentes tipos de substratos com e sem tratamento blebbistatin. Note-se que para as células sem tratamento blebbistatin, foram encontradas diferenças significativas entre os dados de PVC 01:01 e PVC 03:01, e entre a de PVC 01:01 e vidro; para as células tratadas com blebbistatin, diferença significativa foi encontrada apenas entre os dados de PVC 01:01 e vidro.
O
f
L de células cultivadas em substratos de diferentes graus de rigidez semelhante exibiram alterações após o tratamento de 30 uM blebbistatin (Fig. 12B). Mais uma vez, os resultados mostrados na Fig. 4B foram plotados próximo aos observados após o tratamento blebbistatin para comparação. A análise estatística revelou que o tratamento blebbistatin aumentou significativamente o
f
L para as células na PVC 03:01 (
p
= 0,005) eo vidro (
p
= 3,2 × 10
-5); enquanto a mudança de
f
L não foi significativa para células na 1:01 PVC (
p
= 0,48). As médias de
f
L foram 4,32 mm, 3,95 mm e 4,98 mm para o PVC 01:01, PVC 03:01, eo vidro, respectivamente. A discrepância de
f
L entre as células cultivadas em substratos de diferentes graus de rigidez tornou-se insignificante após o tratamento blebbistatin (
p
= 0,12). Estes resultados sugerem que o substrato observado actividades sensíveis à rigidez das filopódios foram, pelo menos em parte, modulado pela atividade da miosina II.
Discussão
Neste trabalho, nós quantificamos a relação entre as atividades filopoidais de pulmão células cancerosas e rigidez substrato utilizando uma técnica de imagem sem rótulo. Descobrimos que a rigidez substrato regulada a duração filopoidais e densidade em células cancerosas provavelmente através afetando a taxa de retração filopoidais, que foi modulado principalmente por atividades de miosina variadas.