Abstract

Objectivo

A metástase é a causa mais comum de morte de pacientes com câncer de próstata. Identificação de biomarcadores específicos e metástases novos alvos terapêuticos é considerada essencial para uma melhor prognóstico e tratamento da doença. MicroRNAs (miRNAs) formam uma classe de não-codificante pequenas moléculas de RNA consideradas importantes reguladores da expressão do gene. A sua desregulação demonstrou desempenhar um papel no aparecimento do cancro, progressão e metástase, e miARNs representam uma classe nova e promissora de biomarcadores de cancro. O objetivo deste estudo foi identificar jusante e up-regulamentados miRNAs em câncer de próstata que poderiam fornecer potenciais biomarcadores e /ou alvos terapêuticos para a metástase do câncer de próstata.

Métodos

tecnologia de sequenciamento de próxima geração foi aplicado para identificar miARNs expresso diferencialmente numa metastático transplantáveis ​​contra uma linha de xenoenxerto de cancro da próstata não metastático, ambas derivadas de cancro primário de um paciente. Os enxertos foram desenvolvidos através de enxertia cápsula subrenal de câncer

tecido

em NOD /SCID, uma metodologia que tende a preservar as propriedades dos cancros originais (por exemplo, a heterogeneidade do tumor, perfis genéticos).

resultados

foram identificados

diferencialmente expressos miARNs, isomiRs e 36 novos miARNs conhecido. Um número destes miARNs (21/104) foram anteriormente relatadas para mostrar jusante semelhante ou a sobre-regulação em cancros da próstata em relação ao tecido normal da próstata, e alguns deles (por exemplo, o miR-16, o miR-34a, o miR-126 *, miR-145, o miR-205) têm sido associadas a metástase do cancro da próstata, apoiando a validade da abordagem analítica.

Conclusões

o uso de metastático e não metastático subrenal cancro da próstata xenotransplantes cápsula derivadas de câncer de um paciente, é provável que os miRNAs diferencialmente expressos identificados neste estudo incluem biomarcadores potenciais e /ou alvos terapêuticos para a metástase do câncer de próstata humana

Citation:. Watahiki a, Wang Y, Morris J, Dennis K, O’Dwyer HM, Gleave M, et al. (2011) MicroRNAs Associated com câncer de próstata metastático. PLoS ONE 6 (9): e24950. doi: 10.1371 /journal.pone.0024950

editor: Irina Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 25 de fevereiro de 2011; Aceito: 24 de agosto de 2011; Publicado: September 30, 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Watahiki et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelos Institutos canadenses de Pesquisa em Saúde (YZW /MG). YZW é um destinatário de um Scholar Award Chinese Overseas da National Science Foundation Natural da China (Sem 30.928.027) e um destinatário de um prêmio Innovative Scholar da Aliança Cancer Internacional para Pesquisa do Câncer e da Educação e da Fundação do Câncer fibrolamelar. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores declaram que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer

próstata é o câncer mais comum em homens ea segunda principal causa de mortes por câncer nos Estados Unidos [1]. Embora os avanços consideráveis ​​têm sido feitos no tratamento de tumores localizados, confinado ao órgão, o cancro da próstata é actualmente incurável, uma vez que tem progredido a metástase, e a maioria das mortes por esta doença são devidos a metástases, que são altamente resistentes a terapias convencionais. Actualmente, antigénio específico da próstata (PSA) é um dos principais biomarcador soro utilizado para a detecção e monitorização da progressão do cancro da próstata. No entanto, o valor prognóstico do aumento dos níveis de PSA é limitada, uma vez que o cancro da próstata avançado pode ser associada com valores muito baixos ou normais de PSA. Existe, portanto, uma necessidade urgente de novos biomarcadores, mais específicos que podem ser utilizados para prever a progressão do cancro sozinhos ou em cooperação com um biomarcador corrente, tais como PSA [2]. Além disso, são urgentemente necessários novos alvos terapêuticos associados com a metástase do cancro da próstata.

MicroRNAs (miARNs) são pequenos RNAs não codificantes (17 a 27 nucleótidos) que regulam negativamente a expressão de genes alvo ligando-se a 3 ‘não traduzida regiões (UTRs) de ARNm e inibir a tradução ou promovendo a degradação de ARNm [3]. Estudos recentes têm mostrado desregulação de miARNs em tumores humanos indicando um papel para tais moléculas na patogénese do cancro, incluindo cancro do início, a progressão e metástase [4], [5]. Até agora, apenas um pequeno número de estudos investigaram expressão miARN no cancro da próstata, e apenas alguns têm lidado com metástases desta doença. As diferenças nos perfis de miARNs até agora identificados expressão pode ter um valor prognóstico para os vários aspectos da doença e uma melhor compreensão do papel de miARN no desenvolvimento e progressão do cancro da próstata é necessário [6]. Mais pesquisas também podem levar à identificação de novos miRNAs que são especificamente relacionados com a progressão e metástase de câncer de próstata. Tais miRNAs associados a metástase pode servir biomarcadores como metastáticos e /ou novos alvos para a terapia da doença metastática.

Os estudos visam identificar fatores genéticos com papéis-chave na metástase do câncer de próstata têm sido impedidas pela falta de modelos experimentais ideais . Enquanto modelos de xenoenxerto com base em linhas celulares de cancro estabelecidas que representam diferentes fases da progressão de cancro pode ser útil para a identificação de mecanismos metástase subjacente, eles não imitam de forma adequada a doença clínica [7]. Esforços têm, portanto, focada no uso de cancro da próstata dos pacientes

tecidos

. No entanto, a heterogeneidade típico de tais tecidos, que consiste em ambas as subpopulações não metastáticos e potencialmente metastático, faz com que seja difícil de identificar factores, tais como genes que estão subjacentes ao desenvolvimento de metástases [8]. Além disso, é difícil a obtenção de tecidos de cancro da próstata metastático por pacientes para fins experimentais, uma vez que eles não são rotineiramente ou viabilizar biópsia ou ressecção de pacientes, e programas de autópsias rápidas são extremamente caro e difícil de gerir. Para superar os obstáculos acima, desenvolvemos modelos de xenotransplante de cancro da próstata derivadas de pacientes de próxima geração, que se assemelham mais de perto a situação clínica, usando enxerto cápsula subrenal de tecido de câncer dos pacientes em ratinhos imunodeficientes. Esta metodologia favorece a retenção das propriedades dos cancros originais [9] – [11]. Além disso, tem sido possível estabelecer transplantáveis, metastáticos e não metastáticos sublinhas de cancro da próstata a partir de xenoenxertos heterogéneos [12], [13]. Uso de metastáticos e não-metastáticos xenotransplantes já tem sido eficaz na identificação de genes associados à metástase do câncer de próstata [13].

sequenciamento de DNA massivamente paralelo da Illumina pela tecnologia de síntese é uma plataforma de sequenciamento de última geração amplamente adotada . Ele suporta sequenciação paralela utilizando um método baseado em terminador reversível propriedade que permite a detecção de bases individuais, eles são incorporados em cadeias de ADN em crescimento. Um terminador fluorescentemente marcado é visualizada como se cada dNTP é adicionado e depois clivado para permitir a incorporação da base seguinte. Desde todos os quatro dNTPs-bound terminator reversíveis estão presentes durante cada ciclo de sequenciação, a concorrência natural, minimiza viés de incorporação, levando a verdade sequenciamento base-por-base de [14].

No presente estudo, a tecnologia de seqüenciamento Illumina próxima geração foi utilizado para comparar os perfis de miRNA de uma metastático transplantáveis ​​versus uma linha de xenotransplante de cancro da próstata não metastático, ambos derivados via cápsula subrenal miocárdio [10] – [12] a partir de tecido câncer primário de um paciente. Diferencialmente expressos conhecidos e novos miRNAs foram encontrados que podem ter papéis específicos na metástase do câncer de próstata.

Materiais e Métodos

modelos de xenotransplante de cancro da próstata derivado do paciente

NOD /SCID usados ​​para xeno foram criados e mantidos no Centro de British Columbia Cancer Research Centre animal (Vancouver, Canadá). Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê Columbia University of British animal Care (A10-0100). Uma amostra da biópsia de câncer de próstata foi obtida no BC Cancer Agency, com consentimento informado do paciente. A aprovação ética foi fornecido pela University of British Columbia -. Conselho de Ética em Pesquisa Agência britânica Cancer Columbia (UBC BCCA REB # H04-60131)

O estabelecimento de linhas de xenotransplante de tecido de câncer de próstata transplantáveis ​​via enxertia cápsula subrenal tem sido descrita anteriormente [9]. No presente estudo, uma preparação recente de próstata metastático linha de xenotransplante de cancro, LTL-313H [15], e uma contraparte não-metastático, LTL-313B (não publicado), foram utilizados que haviam sido derivadas de diferentes loci da biópsia de câncer de próstata de um paciente amostra (www.livingtumorlab.com). Ambas as linhas foram PSA e AR-positivas, como mostrado através de imuno-histoquímica ([15]; dados não publicados). Eles foram rotineiramente mantidas sob cápsula renal de ratinhos NOD /SCID machos suplementadas com testosterona, como previamente descrito [9]. Os xenoenxertos LTL-313H mostrou invasão do rim hospedeira de ratinho e as células cancerosas foram detectados nos pulmões dos hospedeiros após 3 meses de enxertia. Em contraste, os xenotransplantes LTL-313B mostrou nenhuma invasão óbvia do rim do rato e não mostraram metástases à distância (dados não mostrados).

Pequena construção biblioteca de RNA e cDNA sequenciamento

LTL- 313H e tecidos de xenoenxerto LTL-313B foram recolhidas e o ARN foi extraído utilizando TRIzol (Invitrogen, Mississauga, ON, Canadá) de acordo com as instruções do fabricante. O ARN foi submetido ao Centro Genome Sciences na British Columbia Cancer Agency (www.bcgsc.bc.ca) para o ADNc de ARN de pequena a construção da biblioteca e sequenciação, como descrito anteriormente [16], com modificações menores. Cada biblioteca tinha uma sequência de índice específico na sua ‘adaptador 5, ou seja, “ACATCGA” para a biblioteca LTL-313H e “CGTGATA” para a biblioteca LTL-313B; ambas as bibliotecas foram misturados eo sequenciamento foi executado em uma célula de fluxo na plataforma do Illumina.

mapeamento de RNA pequeno e diferenciais de detecção de expressão

A 5 ​​’indexado sequências de cDNA foram usados ​​para distinguir a origem do os RNAs. Adaptador sequências 3 ‘foram removidos a partir de todas as leituras e essas etiquetas restantes que foram 16 a 27 nucleótidos de comprimento e expressas com uma contagem de marcação de dois ou mais em cada biblioteca foram usadas para análise posterior. As sequências aparadas foram mapeados para miRBase 15 sequências de haste-laço humanos (https://www.mirbase.org/) usando o programa Novoalign (www.novocraft.com) permitindo até 3 desencontros. Aqueles que combinava com uma sequência miRBase foram então agrupadas em: 1) conhecido madura miRNA e miRNA *, 2) putativo miRNA *, não previamente relatado na miRBase, 3) sequências de loop e 4) sequências que combinaram a seqüência-circuito, mas não ter sabido sequências maduras. As sequências correspondentes miRNAs conhecidos foram ainda agrupados, com base em suas posições iniciais, e contadas. As marcas de posição variação /partida mais abundantes foram usadas para comparação entre bibliotecas. contagens de tags foram normalizadas para as contagens totais de as sequências que correspondiam às sequências de haste-laço miRBase 15 e as duas bibliotecas foram comparados para expressão diferencial das sequências utilizando o teste exato de Fisher com correção de Bonferroni. As sequências foram consideradas significativamente diferencialmente expressos pelas duas bibliotecas se o p-valor foi . 0.001 e houve pelo menos uma mudança de 2 vezes na contagem normalizados das sequências

identificação Novel miRNA

As sequências que não correspondia conhecidas sequências de haste-laço de miRNA foram filtradas com sequências de transcrições conhecidos baixados da UCSC [17]. Para identificar novos candidatos de miARN entre as sequências restantes não compensadas, foi utilizado o programa miRanalyzer [18] (https://web.bioinformatics.cicbiogune.es/microRNA/miRanalyser.php). Os candidatos de saída foram verificadas uma a uma para homologias a RNA não-codificante conhecido, e as sequências não homólogas foram tomadas como novos miRNA candidatos.

miRNA previsão e via-alvo análise

Os genes alvo para cada miRNA diferencialmente expressos foram preditos usando microcosmos versão 5 [19], [20] com um limiar de

p

= 0,001. Como alguns dos genes foram regulados pelo potencialmente tanto supra-regulados e regulados negativamente miARNs, concentramos para posterior análise dos genes que foram potencialmente regulamentados apenas por sobre-regulada ou regulada para baixo miARNs. Identificação de vias KEGG associados com genes alvo em potencial foi realizada utilizando DAVID 6,7 (banco de dados para anotação, visualização e descoberta integrada, https://david.abcc.ncifcrf.gov/). Além disso, foram comparadas as listas de genes alvo com dados de expressão gênica por ensaio de microarray usando os mesmos tecidos de xenotransplante para identificar os alvos putativos que podem ser reguladas ao nível do ARNm.

análise Microarray expressão do gene

o RNA que foi utilizada para a sequenciação de miARN biblioteca também foi utilizado para análise de expressão de genes à base de ARNm utilizando a plataforma humano GE 44K da Agilent na facilidade Vancouver próstata Centro Microarray (www.mafpc.ca). Todos os dados são Miame complacente e os dados brutos foram depositados em GEO (número de acesso GSE28029). O sinal de expressão foi transformada em z-pontuação e Z-relação calculada e os mRNAs com mais do que 1,96 de proporção Z-tratadas foram supra-regulados e inferior a -1,96 como sub-regulada [21]. Os dados também foram filtrados por Bandeira.

cultura celular

A linha de células de cancro da próstata 22Rv1 foi cultivada em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) a 37 ° C em numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2.

miARN precursor transfecção

a sequência precursora de miR-486, mostrado na miRBase, e um controlo negativo não-silenciamento foram subclonados o plasmídeo pcDNA6.2-GW /EmGFP miR (Invitrogen). 22Rv1 células foram semeadas em placas de 12 poços a uma densidade de 1,0 x 10

5 culas por po, 24 horas antes da transfecção. A transfecção foi efectuada utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen), seguindo as instruções do fabricante. A eficiência de transfecção foi validado por monitorização do sinal de GFP utilizando um sistema de microscópio invertido de fluorescência (Zeiss). Para confirmar o aumento dos níveis de miARN alvo maduro, uma porção das células transfectadas foi utilizado para a validação por quantitativa (qPCR). Para este fim, o RNA total foi extraído usando um miRNeasy Mini Kit (Qiagen) e a quantidade de ARN determinada por espectrofotometria NanoDrop (Thermo Scientific). Porções (25 ng) de cada uma das preparações de ARN total foram sujeitos a transcrição reversa para ADNc utilizando um kit de síntese de ADNc Universal (Exiqon) seguindo as instruções do fabricante. O cDNA foi diluída e misturada com primers microRNA LNA PCR e master mix SYBR Green (Exiqon). qPCR foi realizado utilizando um modelo ABIPRISM 7900HT (Applied Biosystems) seguindo as instruções do fabricante. O ΔΔCT foi utilizado para o cálculo da dobra muda em relação ao controlo e U6 foi usado como um controle endógeno.

Ensaio MTT

As células transfectadas foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1 × 10

4 células /poço. solução de MTT (20 ul de 5 mg /ml) foi adicionada às culturas (volumes de 200 ul) para uma incubação de 4 h a 37 ° C. A seguir à remoção do meio de cultura, os cristais remanescentes foram dissolvidos em DMSO e a absorvância a 570 nm foi medida.

Migração /invasão ensaio

câmaras de invasão de Matrigel BioCoat (BD Biosciences) foram usadas para medir invasividade das células de tecido. Nas câmaras superiores, 1 × 10

5 células /poço foram semeadas em 0,50 ml de meio isento de soro. Nas câmaras inferiores, 0,75 ml de meio /10% de FBS foi entregue. As câmaras foram incubadas durante 30 h a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO

2. As células que permaneceram na câmara superior foram removidas e as células transmigrou fixadas em metanol e coradas com violeta de cristal e as células coradas foram contadas por análise microscópica. invasão celular tumoral foi expressa como a percentagem de células que haviam passado através das membranas revestidas de Matrigel em relação ao número de células que haviam passado através das membranas não revestidas (índice de invasão). Todos os ensaios foram realizados em triplicado.

Resultados

sequenciamento miRNA e anotação

RNAs Pequenos foram isolados a partir metastático LTL-313H e não-metastáticos LTL-313B câncer de próstata xenoenxertos de tecido e processados ​​para permitir o seqüenciamento de profundidade usando a plataforma da Illumina. A lê com sequências de índice adaptador “ACATCGA” e “CGTGATA” foram dadas origem LTL-313H e origem LTL-313B, respectivamente. Mais de 10 milhões Total de leituras foram obtidos para cada uma das bibliotecas. Estas leituras foram comparados com os dados de sequência no banco de dados miRBase 15 microRNA Sequence. Para os metastático da próstata e não metastático bibliotecas de tecido de cancro, 3,445,642 e 2,272,677 etiquetas, respectivamente, foram completamente mapeado para sequências de haste-laçada de miARN humana presentes no banco de dados miRBase (Tabela 1). O completamente compensada leituras foram anotados, de acordo com sua posição na estrutura stem-loop. Uma mudança de até 2 bases no posições inicial e final foi permitido para sequências a serem anotados como

isômeros

de miRNAs maduros conhecidos (isomiRs). Os números totais de miARNs conhecidos mais miARN * s na metastático e bibliotecas não metastáticos foram 447 e 509, respectivamente (Tabela 1). O miRNA mais altamente expresso (e isomiR) foi o miR-148a com contagens totais de 270.801 e 763.877 leituras por metastáticos e não-metastáticos bibliotecas, respectivamente. Quando os isomiRs foram agrupadas utilizando a mesma posição de partida, o miR-148a permaneceu o mais abundante miARN na biblioteca não metastática com uma contagem total de 846468, enquanto que na biblioteca metastático miR-21 era mais abundante com uma contagem total de 310102 .

expressões miRNA e miRNA *

no miRBase, miRNAs derivado de um precursor são designados miRNA, o braço predominantemente expresso, e miRNA * a menos expressa, braço oposto. Se ambos os braços são expressos de forma semelhante, eles são referidos como 5p e 3p braços. A expressão de miARN conhecidos nos xenoenxertos de cancro da próstata foi em geral mais elevada do que a de miARN * s. Num certo número de casos, miARN * s (como identificado por miRBase) foram expressos mais do que os correspondentes miARNs (Tabela 2). Assim miR-144 * foi substancialmente mais expresso do que miR-144 em ambas as bibliotecas metastáticos e não-metastáticos; Da mesma forma o miR-126 * foi expressa mais do que o miR-126, mas apenas na biblioteca não metastático. Também houve diferenças nos padrões de 3p e 5p miRNAs braço (Tabela 2) expressão. Os 3p braços de miR-28 e miR-339 mostrou expressões mais elevadas do que as correspondentes 5p braços na linha metastático, enquanto eles mostraram expressões mais baixos do que os correspondentes 5p braços na linha de não-metastático. Na linha metastático, o miR-542 mostrou aumento da regulação do braço 3p, mas a infra-regulação do braço 5p. Fragmentos que eram colegas de miRNAs maduros conhecidos, mas que não tinham sido previamente comunicados à base de dados miRBase, foram designados “romance putativo miRNA *” espécies (Tabela 3). Um total de 32 de tais putativo miARN * s foi observado que mostra, pelo menos, duas leituras em uma das duas bibliotecas. Alguns destes miRNA * s também apresentaram maior expressão do que os seus miRNAs correspondentes, por exemplo, miR-1277 * e miR-1307 *.

Novel miRNA candidatos

Uma vantagem utilizando uma abordagem de sequenciação de miARN perfilamento é a oportunidade de identificar novos miARNs ou miARN * s. Para este fim, utilizou-se um miRanalyzer, uma detecção e microARN ferramenta de análise de [18], em combinação com pesquisas de homologia para identificar transcritos conhecidos, incluindo os ARN não codificantes (por exemplo, ARNr, ARNt, etc.). Usando o software miPred distinguir pré-miRNAs reais de outras sequências sinuosas com haste-loops semelhantes [22], foram identificados 36 novos miRNA candidatos. As suas sequências, localizações cromossómicas e número de leituras no metastáticos e não metastáticos bibliotecas são apresentados na Tabela 4 e Tabela S1. análise comparativa das duas bibliotecas apresentaram expressão diferencial significativa de alguns destes novos miRNAs, incluindo sub-regulada miR-5680-3p e miR-5681a-3p.

Potencial miRNAs associados a metástase

a análise comparativa das metástases e de xenotransplante não metastático bibliotecas miRNA revelou um total de 104 miRNAs diferencialmente expressos ou miRNA * s com 55 sub-regulada e 49-regulada na linha metastático (Tabela 5,6,7). Dos miARNs regulada de deslocamento, 24 miARNs mostrou a diminuição de 5 vezes, incluindo quatro miARNs, isto é, o miR-205, o miR-503, o miR-708 e miR-2115 *, que foram indetectáveis ​​na linha metastático. Dois miRNAs, ou seja, miR-24-2 * e miR-101 *, mostraram aumento da expressão em um formulário de uma base-turno. Uma forma de uma base de deslocamento de miR-203 mostraram alguma expressão aumentada na linha metastático, relativamente à referência de miR-203, enquanto que na linha não metastático que mostraram uma menor expressão. Dos miARNs-regulada, 23 miARNs mostrou a mudança de 5 vezes nas contagens normalizadas. formulários One-base-de deslocamento de miR-9 *, miR-148b * e miR-1246 apresentaram maior expressão do que as formas de referência em ambas as linhas metastáticos e não-metastáticos.

Alguns dos miARNs diferencialmente expressos anteriormente têm sido associadas com o cancro da próstata, metástase do cancro da próstata ou a metástase de outros tipos de cancro (Tabela 5,6,7). Dos miARNs regulada por um certo número têm sido relatados para ser sub-regulada no cancro da próstata relativamente a tecidos benignos da próstata, isto é, o miR-16 [23] – [25], o miR-24 [26] – [28], miR- 29a [26], o miR-145 [23], [24], [27], [29], [30], e miR-205 [24], [31], [32]. A infra-regulação de miR-16 [25], o miR-34a [33], o miR-126 * [34], o miR-145 [35] e miR-205 [36] correlacionada com o desenvolvimento de metástases do cancro da próstata. Dos miARNs regulado para cima (na biblioteca metastático), o miR-210 tem sido relatada como sendo sobre-regulada em carcinomas da próstata relativamente a amostras BPH [23] e miR-301 tem sido associada a metástase do cancro da próstata [37]. Em alguns casos, miARNs que se verificou ser sobre-regulada no presente estudo foram relatadas para ser quer regulada para cima em carcinomas da próstata em relação ao tecido normal da próstata [38] – [40], ou sub-regulada [23], [24], [27] – [29]. Além disso, alguns dos miARNs expressos diferencialmente foram relatados para desempenhar um papel na metástase de outros tipos de cancro, por exemplo, os miARNs regulado para cima, deixa-7i, miR-9, o miR-30a, miR-125b, miR -142-5p, miR-151-3p, miR-450a e os miRNAs regulados para baixo, miR-24, mir-145, miR-146b-5p, miR-185, miR-186, miR-203 e miR-335 .

genes alvo putativo para miARNs expressos diferencialmente

Como um primeiro passo para a identificação de miARNs com significância potencial no processo metastático, foram identificados genes alvo putativo para cada um dos miARNs diferencialmente expressos usando análise microcosmo, um programa de previsão de destino com um algoritmo específico e cobertura de miRNA, incluindo variedades de armas estrela; um limiar

p

-valor = 0,001 foi mantida para obter uma identificação mais confiável alvo (microcosmo) [41]. Foram identificados genes alvo putativos para 49 de 55 miRNAs down-regulamentado e para 47 de 49 miRNAs up-regulamentados (Tabela S2); foram anotados utilizando o programa de Davi. Os genes alvo putativas dos miARNs regulada de deslocamento foram associados com uma variedade de vias incluindo KEGG “Fc gama fagocitose mediada por R” e “interacção-receptor de ECM (Tabela S3). Para os genes alvo putativas dos miARNs-regulada, vias, tais como “Percursos em cancro”, “adesão focal” e “metabolismo de purina” foram anotados.

a comparação dos genes putativos miARN alvo com genes diferencialmente expressos em o metastático e as linhas de xenoenxerto não metastáticos

Embora miARNs são pensados ​​para alterar os níveis de proteína, eles têm, em alguns casos, foi demonstrado que também afecta os níveis de ARNm [3]. Em vista disto, as duas linhas de xenoenxerto foram examinadas quanto à expressão de ARNm diferencial. Como mostrado na Tabela S4, 622 mRNAs foram sub-regulada e 348 mRNAs foram sobre-regulada na linha metastático. Alguns dos genes identificados por expressão de ARNm diferencial foram potencialmente alvo de ambas as miARNs para cima e para baixo-regulados. Em vista disso, uma análise mais aprofundada era restrito a genes que foram potencialmente direcionados tanto por miRNAs up-regulamentados ou para baixo-regulados. O grupo que apresentou-se regulamentados mRNAs associados com miRNAs única para baixo-regulados consistiu de 85 mRNAs; O grupo que apresentou mRNAs regulada negativamente associados com miARNs apenas até regulados consistiu de 58 mRNAs. Entre os ARNm sobre-regulada na linha metastático, alguns têm sido relatados para ter um papel na invasão de tecidos e /ou metástase de uma variedade de células cancerígenas, incluindo ARNm expressas pela

FSCN1

[42],

VEGFA

[43]

FGFR1

[44],

ADAMTS1

[45],

CCL2

[46] e

VIM

[47 ] genes. Da mesma forma, mRNAs regulada para baixo na linha metastático, incluindo mRNAs expressos pelo

CTGF

[48] e

SERPINB5

[49] genes, foram encontrados para ser regulada em vários metastático cancros, atestando a fiabilidade das nossas análises (Tabela S5).

Aumento dos níveis de maturidade miR-486 em células transfectadas

Às 24 horas após a transfecção de células 22Rv1 com pcDNA6.2-GW /EmGFP-mir486 sequência ou GW-pcDNA6.2 /EmGFP-controlo, foram encontradas mais de 90% das células para ser GFP positivo. O precursor de miR-486 tinham sido adequadamente processado para a forma madura de miR-486 tal como indicado por qPCR. Relativamente ao controlo, os níveis tanto de miR-486-5p e braços -3p expressão foram de 11,6 vezes mais elevada, o que indica que a maior parte das células expressaram niveis elevados de miR-486.

Invasividade de miR-486- 22Rv1 transfectadas células

a taxa de proliferação de miR-486-transfectadas e células transfectadas com sequência de controlo foi semelhante, tal como indicado pelo ensaio de MTT (Fig. 1A). No entanto, as células de miR-486 transfectadas mostraram um aumento de cerca de 85% na capacidade de invasão do tecido em relação às células de controlo (Fig. 1B). Embora este resultado tem significância limítrofe (

P

= 0,08), que indica que o aumento da expressão de miR-486 aumenta a capacidade de invasão do tecido.

a) como indicado pelo ensaio de MTT, não houve diferença significativa entre o crescimento de células de miR-486 transfectadas e células de controlo ao longo de um período de 72 h. B) Tecido invasividade, tal como medido pela invasão de Matrigel, de miR-486 células transf ectadas e as células de controlo. Os dados são expressos como percentagem de invasividade ± S.D. e mostram aumento da capacidade de invasão das células miR-486 transfectadas (85%;

p

= 0,08)

Discussão

Os microRNAs têm sido implicados na regulação da. a expressão do gene ao nível pós-transcricional, em quase todos os eventos biológica, e há um crescente corpo de evidência que as expressões alterados de miARNs específicos estão envolvidos no desenvolvimento e progressão de cancros [4], [5]. Usando próxima geração seqüenciamento para pequenas identificação RNA, o presente estudo teve por objetivo identificar miRNAs diferencialmente expressos conhecidos e novos em metastática X xenotransplantes não metastáticos de câncer de próstata que poderiam desempenhar um papel na progressão do câncer de próstata para a forma metastática. As linhas de cancro transplantáveis ​​que foram utilizados parece ser altamente adequado para o efeito, uma vez que tinha sido derivada de cancro de um paciente e, assim, possuía um fundo genético comum. Além disso, eles foram desenvolvidos através de enxertia cápsula subrenal do cancro

tecido em ratinhos NOD /SCID, uma metodologia que tende a preservar propriedades importantes dos cancros originais (por exemplo, a heterogeneidade do tumor, perfis genéticos) [9] – [11], [50]. Assim, a manutenção das linhas de tumor, no mesmo tipo de sítio do enxerto (sob a cápsula renal) assegurado que o seu crescimento não foi marcadamente influenciados por diferenças micro-ambientais que podem ter um impacto importante sobre o desenvolvimento do cancro [51]. Do mesmo modo, o mesmo tipo de sítio do enxerto seria minimizar as diferenças na produção de miARN por células hospedeiras presentes nos xenoenxertos. Embora tenha sido demonstrado que xeno-enxerto pode alterar a expressão de miARN [52], o nosso estudo centrou-se principalmente nas diferenças de miARNs entre amostras emparelhadas e as diferenças são, portanto, susceptíveis de ser real. Tomados em conjunto, os dados obtidos neste estudo deveriam ser úteis para o delineamento de miARNs com propriedades oncogénicas que estão envolvidas no desenvolvimento de metástases do cancro da próstata.

A maior lê nas duas bibliotecas de ARN foram observados para miR- 148a. A expressão deste miARN é androgénio induzíveis em células LNCaP [53]. Isto sugere que a expressão relativamente elevada de miR-148a encontrado nas duas bibliotecas é um resultado da suplementação da testosterona dos animais.

Dos 104 miARNs que foram encontrados para ser descarregado ou supra-regulados na xenoenxertos de cancro da próstata metastático, em relação com os seus homólogos não-metastáticas, 39 tinham sido previamente relatado para ser envolvido no cancro da próstata (Tabela 5,6,7). Estes relatórios foram baseados principalmente em comparações de expressões de miRNA em tecidos de câncer de próstata em comparação com tecidos da próstata normais sem definir a capacidade metastática das amostras malignas. É de interesse que 21 dos 39 miRNAs mostrou jusante ou up-regulamentação em vigor nos xenoenxertos metastáticos que coincidiram com os reportados para os tecidos de câncer de próstata (em relação aos tecidos benignos), sugerindo que estes tecidos de câncer de próstata pode ter tido a capacidade metastática. Dos miARNs que se verificou serem regulados negativamente nos xenoenxertos metastáticos, miR-16, que mostra a diminuição de 17 vezes na expressão, tem sido relatado para ser sub-regulada no cancro da próstata [23], [24] e de ter uma função de supressão de metástase. Além disso, o crescimento do tumor de próstata metastático

in vivo

poderia ser inibida pela entrega sistémica de miRNA-16 sintético [25]. A expressão reduzida de miR-34a na linha de xenoenxerto metastático é consistente com a sua inibição de metástase relatado cancro da próstata [33]. A expressão inferior do miR-126 * está de acordo com relatórios que este miARN é regulada negativamente em metástases de cancro da próstata [34], e que a expressão ectópica de miR-126 * inibiram a migração e a invasão de células de cancro da próstata [34]. O último sendo um exemplo de um miARN * desempenhando um papel como supressor de tumor. Curiosamente, o miR-126, um miARN reportado como sub-regulada no cancro da próstata em relação ao tecido normal da próstata [54], foi regulado para cima na linha de xenoenxerto metastático.