Abstract

Para a terapia de droga anticâncer, é crítico para matar as células com maior potencial tumorigénico, mesmo quando eles compreendem uma fração relativamente pequena da população total de células tumorais. Temos utilizado o ensaio de inibição estabelecido NCI /DTP 60 crescimento celular linha como uma plataforma para explorar a relação entre estrutura química e inibição do crescimento em ambas as linhas celulares de cancro tumorigénicas e não tumorigénicas. Utilizando medições experimentais de “índice de pega” em implantes ectópicos como um proxy para o potencial tumorigénico, foram identificados oito agentes químicos que aparecem para inibir fortemente e selectivamente o crescimento das linhas de células tumorigénicas mais. relações de dados de ensaio e estrutura-actividade bioquímica indica que estes compostos actuam através da inibição da polimerização da tubulina. No entanto, a sua actividade contra linhas de células tumorigénicas é mais selectiva do que a dos outros inibidores de microtúbulos em uso clínico. diferenças bioquímicas nas subunidades de tubulina que formam microtúbulos, ou diferenças na função de microtúbulos em conjunto fuso mitótico ou a divisão celular pode estar associada com a selectividade destes compostos

citação:. Abdullah NM, Rosania GR, Shedden K (2009) direcionamento seletivo de câncer Oncogenia celular Lines por microtúbulos inibidores. PLoS ONE 4 (2): e4470. doi: 10.1371 /journal.pone.0004470

editor: Winston Esconder, Universidade de Western Cape, África do Sul

Recebido: 08 de agosto de 2008; Aceito: 28 de novembro de 2008; Publicação: 13 de fevereiro de 2009

Direitos de autor: © 2009 Abdullah et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Estados Unidos National Institutes of Health conceder P20HG003890. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A agressividade de diferentes tipos de células tumorais derivadas de pacientes humanos pode ser avaliada em termos do seu potencial tumorigénico em modelos de rato de xenotransplante. Por exemplo, o potencial tumorigénico em xenoenxertos de ratinho recentemente tem sido utilizado para definir o câncer “células estaminais”, o que presumivelmente correspondem à subpopulação de células malignas que conduzem a formação e o crescimento do tumor [1]. Assim, postulou-se que alguns tipos de cancro são compostas de uma colecção heterogénea de células, apenas uma minoria dos quais são capazes de formar novos tumores [2]. Estas células podem ser enriquecidos a partir de populações de células tumorais heterogéneas com base na sua expressão de marcadores de superfície celular. Em tumores da mama, por exemplo, as células que co-expressam níveis elevados de CD44 e o antigénio específico do epitélio (ESA) e níveis baixos de CD24 são as células tumorais iniciar [2]. Da mesma forma, no cólon e cancro do cérebro, as subpopulações de células que expressam níveis elevados de CD133 (PROML1) iniciar os tumores [3], [4]. Mais importante ainda, após transplante em ratinhos imunocomprometidos, as células tumorais de iniciação pode reconstituir completamente um tumor com heterogeneidade reminiscente do tumor original [2] – [4]. Embora o conceito de um câncer “célula estaminal” ainda é controversa, do ponto de vista terapêutico, agentes anticancerígenos dirigida contra as células cancerosas tumorigênicos pode ser o mais eficaz em tumores erradicar.

A descoberta de drogas e setor de desenvolvimento de Câncer Nacional Institute (NCI), o Programa de Terapêutica de desenvolvimento (DTP), foi utilizado um painel de 60 linhas celulares derivadas de tumores humanos para pesquisar a potencial quimioterapêutico de mais do que 75000 compostos [5], [6]. Este painel de 60 linhas de células é geralmente conhecida como “linhas de células NCI60”. As linhas de células representam diversas leucemias, melanomas e os cancros do pulmão, cólon, cérebro, ovário, mama, próstata e do rim [5]. Para além da sua utilização no rastreio de fármacos, o potencial tumorigénico destas linhas celulares foi medida pelo xenotransplanting estas células em ratinhos imunocomprometidos e avaliar a sua capacidade para formar novos tumores [6]. Diferentes linhagens de células no painel NCI60 exibir uma gama de potenciais tumorigênicos sobre transplante em ratinhos imunocomprometidos. O potencial tumorigénico foi gravada como de cada linha celular de “take-taxa.”

Como uma hipótese, as diferenças de potencial tumorigénico entre as linhas celulares de cancro do NCI pode reflectir variações na actividade proliferativa e características de iniciação do tumor do real as células cancerosas como elas existem nos tumores de pacientes com cancro. Assim, as linhas celulares NCI60 demonstrando alta taxa de adesão pode ser mais representativo das células cancerosas de iniciação do tumor encontrado

in situ

. Aqui, nós identificar compostos do banco de dados DTP que são mais ativos contra linhas de células com a maior taxa de adesão, e proceder à criação de um mecanismo de ação que para estes compostos através da realização de estudos de relação estrutura-atividade, e comparando-os com agentes anticancerígenos padrão cujas mecanismo de ação é conhecido. Além disso, diferenças de potencial tumorigénico e capacidade de resposta a estes agentes são mostradas para ser relacionada com as diferenças na expressão dos genes entre as linhas de células tumorigénicas NCI60 com potenciais de alta e baixa, assim como para os marcadores de expressão de genes de células cancerosas tumorigénicas.

resultados de

Identificação de compostos seletivamente citotóxicos

actividade inibidora do crescimento na coleção DTP de agentes químicos como representados por -logGI50 podem ser comparadas com as quatro categorias de taxa tomada com base nos coeficientes de correlação de Pearson. Utilizando esta abordagem, nove compostos que possuem o coeficiente de correlação maior do que 0,5 em magnitude foram identificados a partir de 34,909 compostos testados (Figura 1). Todos os nove coeficientes de correlação foram positivas, indicando que estes agentes eram mais activos na inibição do crescimento celular nas linhas celulares tumorigénicas mais (Figura 2). Uma vez que o número esperado de compostos em cada 34.909 tendo um coeficiente de correlação superior a 0,5 em magnitude ao acaso é de 0,7 com uma 95

percentil de dois compostos, é muito improvável que duas ou mais destas nove compostos são falsos positivos.

Nenhum dos agentes anticancerígenos padrão no banco de dados DTP superar estes nove compostos em termos de citotoxicidade contra as linhas de células mais tumorigênicos. A maior coeficiente de correlação observada entre os agentes anti-cancro padrão é 0,47 para vinblastina, que é um agente anti-mitótico. Na verdade, agentes antimitóticos são a única classe mecanicista mostrando correlação positiva não negligenciável consistente com a taxa take. Apesar dos seus coeficientes de correlação positivos, nenhum dos agentes anti-cancro padrão antimitóticos mostram o coeficiente de correlação maior do que 0,5, o que sugere que os nove compostos identificados na nossa análise de correlação pode ser unicamente selectiva contra as linhas de células tumorigénicas mais. Vários destes nove compostos exibem uma janela ampla selectividade com diferença em -logGI50 entre linhas de células tumorigénicas e não tumorigénicas de dois ou mais. Os compostos 384634, 385177, 5468780, 361500 e 379512 são comparáveis ​​a todos os agentes anti-mitóticos padrão em relação à sua citotoxicidade; no entanto, a sua janela de seletividade é muito mais amplo (Figura 3)

A inibição da polimerização da tubulina como possível mecanismo de ação

Os compostos ponto identificados a uma grande classe de relação estrutura-actividade.: quatro dos compostos partilham uma estrutura naftiridin núcleo identificados (ver Figura 1). Três desses compostos (385177, 5468780, 5468781) são estruturalmente relacionadas, através da presença de um grupo R na posição naphthelene

2. Estas estruturas diferem umas das outras apenas com base no posicionamento de um ou dois grupos metilo no anel A: Os compostos 385.177 e 5.468.780 contém um grupo metilo nas posições R

5 e R

2, respectivamente, enquanto o composto 5.468.781 contém dois grupos metilo nas posições R

5 e R

2. O outro composto (384634) difere dos três compostos anteriormente mencionados, porque o grupo 3′-metoxi anel benzeno substituído substitui o grupo naftaleno na posição R

2. Este composto também contenha um grupo metilo na posição R

5 no anel A. A presença da estrutura de núcleo central comum a todos os compostos deste grupo sugere que ela pode desempenhar um papel fundamental no mecanismo de acção para este grupo de compostos .

a fim de identificar um possível mecanismo de ação, os nove compostos foram agrupados juntamente com os 168 agentes anticancerígenos padrão usando as 881 impressões digitais principais CACTVS. Cortando o dendrograma na Tanimoto um coeficiente de 0,7, cinco dos nove compostos estão agrupados nove com agentes anticancro convencionais incluindo vários agentes antitubulina, tais como vinblastina e vincristina. posterior análise da literatura científica revelou que muitos dos nossos compostos de fato inibir a polimerização de tubulina

in vitro

. Composto 384634 foi sintetizado e demonstrou para demonstrar a actividade antitublin num ensaio de polimerização de tubulina [11]. Da mesma forma, isósteros de composto 385177, 5468780 e 5468781 inibem de forma potente a polimerização da tubulina [12]. Ele é altamente plausível que o composto é um agente 379512 antitubulina assim, porque uma série de compostos contendo a estrutura do anel 2-fenilo-quinolonas têm sido sintetizados e exibem a polimerização da tubulina [13] – [17]. Composto 5388755 é estruturalmente quase idêntico ao combretastatina A-4, que é um agente muito potente antitubulina [18].

comparar análise [19] foi realizada para caracterizar ainda mais o mecanismo de acção dos compostos. Em COMPARAR, um coeficiente de correlação de 0,6 é geralmente feita para indicar evidência de mecanismos de acção semelhantes entre os compostos testados e de referência. Quanto maior for o coeficiente de correlação, o mais provável é que os compostos partilham o mesmo alvo intracelular [9]. O coeficiente de correlação das COMPARAR cálculos para os oito compostos mais potentes e os agentes anti-cancro padrão antimitóticos revela vários compostos que apresentam elevados correlações com inibidores de microtúbulos colchicina, maitansina, vinblastina e vincristina (Tabela 1). Nenhum destes compostos apresentam semelhança com qualquer um dos agentes de outras classes mecanicistas, tais como inibidores de topoisomerase, agentes alquilantes de ADN e de ARN /antimetabolitos (dados não mostrados). Nenhum dos compostos apresentam forte correlação com taxol, que é um agente anti-mitótico que age através da estabilização dos microtúbulos.

atividade antitubulina paralelo citotoxicidade seletiva

A fim de identificar o papel da atividade antitubulina na geração de citotoxicidade selectiva, foram identificados doze compostos adicionais DTP (Figura 4) que estão estruturalmente relacionados com alguns dos nove compostos que identificamos na nossa análise de correlação, mas que falta actividade antitubulina [11] – [15]. Se a atividade antitubulina confere citotoxicidade selectiva, estes compostos sem atividade antitubulina deve demonstrar nenhuma citotoxicidade seletiva. A dispersão comparando a associação entre a citotoxicidade e a taxa para tomar estas doze compostos indica que nenhum destes compostos apresentam citotoxicidade selectiva (Figura 5), ​​e eles são, em grande parte inactiva no ensaio de inibição do crescimento celular.

A expressão gênica análise

Uma série de estudos anteriores identificaram CD44, CD24 e CD133 (PROML1) como sendo marcadores para características potenciais ou células-tronco semelhantes tumorigênicos, com CD44 e CD133 sendo relativamente alta expresso em linhas tumorigénicas, CD24 e sendo expressos em baixos níveis. Assim, temos procurado por genes específicos cuja expressão pode estar relacionada com a actividade citotóxica selectiva dos compostos identificados. Para este efeito, os dados de perfil de transcrição foi extraído para os genes cuja expressão através das linhas celulares está correlacionada com o potencial tumorigénico. Neste conjunto de dados, descobrimos que taxa de adesão é independente da PROML1, CD44, ea relação log CD44-CD24 nas linhas celulares NCI60. Analisamos também a expressão de uma vintena de diferentes isotipos de tubulina (alfa, beta e gama) e não encontrou nenhuma correlação com a taxa de adesão.

Apesar de genes tumorigenicidade candidato marcador PROML1, CD44 e CD44-CD24 não foram associados com taxa de take, nós identificar genes expressos em níveis substancialmente mais elevados nas linhas celulares mais tumorigênicos. Na plataforma matriz U95A, um factor de transcrição (PAD), uma integrina (ITGA6, dois conjuntos de sondas), e uma proteína de membrana do esqueleto (ADD3, dois conjuntos de sondas) seguido este padrão de expressão. Seis genes identificados e dois genes não identificados são expressos em níveis substancialmente mais elevados no menos tumorigénico em comparação com as linhas de células tumorigénicas mais sobre a plataforma matriz U95A: PTGIS, JAK1, MGC5560, XPC, NRG1, e SULF1. Na plataforma U133A /B TMEM18, ACACB e GMCL1 foram positivamente associado com potencial tumorigénico, juntamente com duas sondas unnanotated (229930_at e 230312_at). Há associações negativas cumprir os nossos critérios de seleção foram identificados na plataforma série U133A /B. O significado funcional de genes marcadores de células-tronco putativos em relação à tumorigenicidade ou aumento da sensibilidade aos inibidores de microtúbulos não é clara.

Discussão

a partir da mineração do arquivo DTP, somos capazes de identificar compostos que são preferencialmente tóxica contra a maioria tumorigénico das linhas celulares NCI60, com base na taxa de absorção das linhas de células em um modelo de murganho de xenoenxerto. Nós também estabelecido que a actividade destes compostos não foi correlacionada com a expressão de marcadores de células estaminais da superfície celular relatados na literatura. No entanto, o potencial tumorigénico é a relação funcional mais importante entre as células tumorais mais agressivas e

in vitro

modelo para a seleção da droga. Portanto, os agentes anticancerígenos identificados com base na sua actividade contra as linhas de células tumorigénicas mais podem ser considerados como agentes anti-cancerígenos candidata que são especificamente dirigidos contra subpopulações de células cancerosas que dirigem o crescimento de tumores.

Um desses agentes ( 384634) foi encontrado para inibir a polimerização de microtúbulos. Da mesma forma, isósteros de três dos nossos agentes (385177, 5468780, 5468781) também têm sido mostrados para inibir a polimerização dos microtúbulos, o que sugere um mecanismo único de acção. Curiosamente, o Composto 5388755 está estruturalmente relacionado com o agente antitubulina potente combretastatina A-4. É também possível que o composto 379512 actua inibindo a polimerização da tubulina, porque vários agentes diferentes que contêm a estrutura do anel de quinolona têm demonstrado actividade antitubulina. análise COMPARAR corrobora as semelhanças entre os agentes anticancerígenos aqui identificados e vários inibidores de microtúbulos diferentes. Com a excepção do composto 319428, todos os nossos compostos mostram forte semelhança com colchicina, maitansina, vinblastina e vincristina. Nenhum dos nossos compostos apresentam relação significativa com o taxol, o qual actua através da estabilização de microtúbulos.

A partir da nossa análise, a actividade antitubulina é provável que seja responsável pela citotoxicidade selectiva contra linhas de células tumorigénicas. Um número seleccionado de compostos estruturalmente relacionados com qualquer actividade antitubulina foram analisados ​​para o seu padrão de citotoxicidade para linhas de células NCI60. Nenhum destes compostos demonstraram citotoxicidade selectiva. Na verdade, a maioria destes compostos foram inactivos. Juntamente com a sua actividade antitubulina, a selectividade dos compostos para com os nossos linhas de células altamente tumorigénicas sugere que os microtúbulos de linhas de células tumorigénicas e não tumorigénicas pode ser diferente. Curiosamente, não foi observada diferença no nível de expressão do gene da tubulina entre linhas de células altamente tumorigénicas e não tumorigénicas. É plausível que a citotoxicidade selectiva observada não é devida à diferença na expressão do gene da tubulina, mas sim um resultado de diferenças em modificações pós-traducionais (PTMs) [20]. Recentemente, vários resultados experimentais têm apoiado a noção de que PTMs tubulina levar à diversidade funcional dos microtúbulos. Muitos PTMs tubulina foram identificadas incluindo detrysosination, glutamylation, glycylation, acetilação e fosforilação palmitoilação [20] – [22]. As diferenças na expressão isotipo tubulina e PTMs foram associados à diferenciação celular e transições de desenvolvimento [23] – [25]. Porque microtúbulos são a chave para mitótica montagem do fuso e a divisão celular, as diferenças na estrutura e a função do fuso mitótico entre linhas de células tumorigénicas e não tumorigénica pode estar associada com a selectividade destes compostos.

Em conclusão, nós identificaram uma família de inibidores de microtúbulos que são principalmente tóxica contra linhas de células tumorigénicas. linhas celulares de cancro estabelecidos demonstrando alta tumorigenicidade em modelos de xenotransplante pode capturar algumas propriedades de subpopulações de células cancerosas que são responsáveis ​​por iniciar e propagação dos tumores. Por isso, propomos que esta família de inibidores de microtúbulos, ou compostos relacionados com características de selectividade semelhantes, devem ser considerados como os principais candidatos para uma avaliação posterior como agentes anticancerígenos.

Materiais e Métodos

Os dados primários

os dados de inibição de crescimento composto foi obtido a partir da tela antitumoral linha de células do NCI 60. A actividade inibidora do crescimento de cada composto corresponde à concentração de droga molar necessária para causar inibição do crescimento de 50% (GI50). A maioria dos ensaios usar uma concentração máxima de 0,0001 M (linha celular do ecrã e o parâmetro GI 50 são descritos em [7]). Para análise de expressão gênica por microarrays, usamos cinco conjuntos de dados publicamente disponíveis para as linhas de células NCI60: ensaios em triplicado utilizando a plataforma U95A Affymetrix fornecido pela Novartis, um único conjunto de dados U95A fornecida por GeneLogic, e um único conjunto de dados /B Affymetrix U133A fornecida por GeneLogic. Os dados foram obtidos a partir GI50 https://dtp.nci.nih.gov/docs/cancer/cancer_data.html e todos os dados de expressão de genes foram obtidos a partir de https://dtp.nci.nih.gov/mtargets/download.html . Todos os dados de expressão de genes e do ensaio GI50 são analisados ​​na escala logarítmica.

Classificação do potencial tumorigénico

As linhas celulares NCI60 foram avaliadas experimentalmente para potencial tumorigénico por transplantação de linhas celulares em imuno- ratinhos comprometidos. As experiências e os resultados são fornecidos no Guia de Desenvolvimento de Drogas da Anticancer [6]. Para linhas de células diferentes, estes dados são dados quer quantitativamente quer qualitativamente, ou, por vezes, como gamas, como o “índice de pega,” ou percentagem de tentativas de implantes que originou um tumor. Convertemos os dados de taxa de take em quatro categorias ordenadas por analisar: 0 para nenhum crescimento, 1 para 1-60% taxa de adesão, 2 para 60-80% taxa de adesão e 3 para 80-100% taxa de adesão. As linhas celulares que se sobrepõem duas categorias são classificados em categoria inferior. Por exemplo, uma linha celular com 70-90% taxa de adesão é classificado como categoria 3. Estas avaliações de potencial tumorigénico são denotados “TP”.

selecção Composto

Os compostos ativos contra alta take- linhas celulares de taxa foram identificados por comparação a medição de inibição de crescimento (GI50 -log) para a classificação de quatro níveis de-taxa de absorção, utilizando-se a correlação de Pearson. Limiares de 0,4 e 0,5 foram utilizados para definir correlações moderadas e fortes. A significância estatística foi avaliada calculando o número esperado de compostos fora de todos os compostos testados que seriam esperados para têm uma correlação superior a um dado limiar por acaso (baseado na aplicação de Z-transformação de Fisher e com uma distribuição normal padrão de referência).

A expressão gênica análise

Os compostos ativos contra linhas de células que expressam níveis relativamente altos de PROML1 ou CD44-CD24 foram identificados utilizando coeficientes de correlação de Pearson entre -log

10GI50 e quer log expressão escala de PROML1, ou a diferença entre os níveis de expressão de escala log de CD44 e CD24. PROML1 é representado por um conjunto de sondas única em ambas as plataformas, de CD44 é representado por dois conjuntos de sondas U95A e por seis U133A /conjuntos de sondas B, CD24 e está representada por um conjunto de sondas U95A e por conjuntos de sondas seis U133A /B. Quando vários conjuntos de sondas estão disponíveis, todos são analisadas separadamente, e as diferenças entre todos os pares de sondas CD44 /CD24 são analisados ​​separadamente. Para todas as análises, compostos para os quais menos de 50 linhas celulares tiveram um valor GI50, ou que não tinha variabilidade nos seus valores GI50, foram excluídos da nossa análise.

agentes anticancerígenos padrão

Um conjunto de 168 compostos com actividade anti-cancro foi compilado, e um subconjunto de 121 deles foi anotada de acordo com o seu mecanismo de acção presumível [8] – [10]. Os dados utilizados foram obtidos a partir de https://dtp.nci.nih.gov/docs/cancer/searches/standard_mechanism_list.html, e incluem o seguinte mecanismo de classes de ação e números de estruturas únicas: agentes alquilantes (35), antimitotic os agentes (13), de topoisomerase 1 inibidores (24), inibidores de topoisomerase II (15), de ADN anti-metabolitos (16), e de ARN /ADN anti-metabolitos (18).

comparações estrutura química

Todos os compostos discutidos aqui são parte de PubChem, e as comparações estruturais relatados são baseados em coeficientes Tanimoto usando os 881 impressões digitais principais CACTVS. Cálculos de coeficientes Tanimoto e agrupamento hierárquico de estruturas químicas com base em coeficientes Tanimoto foi feito usando o portal NCBI para PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov). Convertemos todos os identificadores compostos a partir de identificador NSC do DTP para identificador CID do PubChem para análise estrutural.

COMPARAR análise

COMPARAR cálculos para todos os compostos potentes contra agentes anticancerígenos padrão de várias classes mecanicistas são realizadas . coeficientes de correlação de Pearson correspondentes a uma elevada concentração de 0,0001 M são relatados para a maioria dos compostos. Para compostos que são testados com uma alta concentração de alternativa, os coeficientes de correlação de Pearson são obtidos a partir de pares com a concentração mais próximo alta.

janela Seletividade

A janela de seletividade foi calculada tomando-se a diferença entre o média -logGI50 das linhas mais tumorigênicos celulares (categoria de taxa de levar 3) e as linhas de células menos tumorigênicos (take-rate categoria 0).