Abstract

Purpose

MAGE-A3 é um alvo potencial para imunoterapia devido à sua natureza específica do tumor e de expressão em vários tipos de tumor. dados clínicos sobre imunoterapia MAGE-A3 têm levantado muitas questões que só podem ser resolvidos usando modelos animais. No presente estudo, foram investigados diferentes aspectos das respostas imunes anti-tumores de murinos induzidos por uma proteína recombinante de MAGE-A3 (recMAGE-A3) em combinação com diferentes imunoestimulantes (AS01, AS02, AS15 ou CpG7909).

desenho experimental e os resultados

com base no perfil de citocinas e análise de protecção contra o desafio com MAGE-A3-expressando tumor, a combinação recMAGE-A3 + AS15 foi seleccionado para posterior trabalho experimental, em particular para estudar os mecanismos de anti respostas -tumor. Usando MHC Classe I, MHC classe II-, perforina, B-células e IFN-y- knock-out ratinhos e CD4

+ T cell-, CD8

+ T células e NK cell- camundongos depletados, foi demonstrado que células T +

CD4 e células NK são os principais efectores anti-tumorais, e que o IFN-γ é uma molécula efectora principal. Este modelo de tumor mouse também estabelecida a necessidade de repetir injeções AS15 recMAGE-A3 + para sustentar as respostas anti-tumorais eficientes. Além disso, os nossos resultados indicam que a eficácia da rejeição de tumores induzidos pelas respostas anti-MAGE-A3 depende da proporção de células de tumor que expressam MAGE-A3.

Conclusões

O recMAGE-A3 + imunoterapia do cancro AS15 eficientemente induzida uma resposta imune, e funcional específica para o antigénio de longa duração capazes de reconhecer e eliminar células tumorais MAGE-A3-expressam até vários meses após a última imunização em ratinhos. Os dados destacou a importância da imuno-estimulante para induzir uma resposta imune do tipo Th1, bem como o papel fundamental desempenhado pelo IFN-γ, CD4

+ células T e células NK no efeito anti-tumoral.

Citation: Gérard C, Baudson N, Ory T, Louahed J (2014) Tumor Modelo rato Confirma MAGE-A3 Cancer imunoterápicos como indutor eficiente de Long-Lasting respostas anti-tumorais. PLoS ONE 9 (5): e94883. doi: 10.1371 /journal.pone.0094883

editor: Ramon Arens, Leiden University Medical Center, Holanda

Recebido: 21 Janeiro, 2014; Aceito: 20 de março de 2014; Publicado em: 15 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Gérard et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os financiadores teve papel na concepção do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. GlaxoSmithKline Biologicals SA foi a fonte de financiamento e foi envolvido em todas as etapas da execução do estudo e análise. GlaxoSmithKline Biologicals SA também financiou todos os custos associados com o desenvolvimento e publicação da presente manuscrito. JL estava envolvido na supervisão de estudo em todas as fases. Todos os autores foram envolvidos no desenho do estudo, revisão de relatórios de estudos, análise de dados e interpretação. NB e TO conduziu o estudo e foram envolvidos na geração de dados. Todos os autores foram envolvidos na elaboração e aprovação do manuscrito

Conflito de interesses:. Eu li a política da revista e tem as seguintes conflitos: CG, NB, TO, JL são funcionários da GlaxoSmithKline Vacinas. CG e JL declarar a propriedade de ações no grupo de empresas GlaxoSmithKline. CG e JL também são inventor em patentes detidas por grupo de empresas GlaxoSmithKline (WO /2013/096430). Isto não altera a nossa adesão a PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Desde as observações de William Coley no século 19 que o câncer podem ser tratados através da mobilização próprio sistema imunológico do paciente , o objetivo final para imunologistas de cancro tem sido a de conseguir isso reprodutível em pacientes. As proteínas mutadas aberrantes, re-activadas ou sobre-expressas em células tumorais, representam potenciais “antigénios tumorais”, que podem ser visados ​​pelo sistema imune [1] -. [3]

génica aberrante promotor é uma desmetilação mecanismo importante através do qual a expressão de genes normalmente silenciosos é re-activada em células de tumor. Este é o caso para o

MAGEA

família de genes que são normalmente expressas durante a vida embrionária [4] e na placenta [5], [6], mas são silenciosas em tecidos adultos normais, excepto na linha germinativa células do testículo [5].

MAGE-A3, um membro desta família MAGE-a, é um antigénio tumoral atraente, como i) é expressa quase exclusivamente em tumores, eliminando o risco de uma montagem resposta imunitária activa contra tecidos normais (células germinativas dos testículos são as únicas células normais que expressam MAGE-A3, mas que são desprovidas de HLA de classe clássica moléculas I-II e, portanto, não têm capacidade de apresentação de antigénios, que excluem o desenvolvimento de imuno-relacionada toxicidade por MAGE-A3 imunoterapia), ii) que é expressa em muitos tipos de cancro diferentes, e iii) é, naturalmente, imunogénica, como CD8

+ linfócitos T específicos para MAGE-A3 foram encontrados para infiltrar locais tumorais em pacientes com melanoma [ ,,,0],. 7]

os dados clínicos gerados na última década usando diferentes abordagens de imunoterapia mostraram que entregar MAGE-A3 como uma proteína recombinante purificada formulada com um imunoestimulante pode ser uma abordagem promissora [8] – [11]. No entanto, apesar dos resultados encorajadores, muitas questões ainda precisam ser resolvidos para melhorar ainda mais a imunoterapia A3-específicas do mago. Em particular, a melhoria da combinação de MAGE-A3-imunoestimulante para induzir respostas imunes anti-tumor de longa duração permanece essencial. Além disso, os mecanismos efectores imunitários precisos e chave que levam à rejeição tumoral não são conhecidos, e há correlato imune clara para eficácia clínica ainda não foi determinada. Tampouco se sabe até que ponto o padrão focal de expressão MAGE-A3 dentro de um tumor pode limitar a eficácia clínica. Tais questões e hipóteses não pode ser razoavelmente avaliado em ensaios clínicos, devido à longa duração e número limitado de pacientes. Portanto, os estudos pré-clínicos continuam a ser essenciais para orientar o desenvolvimento clínico da imunoterapia específica MAGE-A3-.

Foram abordadas algumas dessas questões no presente estudo. Numa primeira série de experiências, os ratinhos foram imunizados com proteína recombinante de MAGE-A3 (recMAGE-A3), formulado com diferentes imunoestimulantes: AS01, AS02, AS15 ou CpG7909. AS15 foi seleccionada a partir deste painel para posterior investigação, devido à sua capacidade para dirigir o sistema imune para uma resposta imune do tipo Th1 e a actividade anti-tumor contra células de tumor, resultante de MAGE-A3-expressam. Os ratinhos foram imunizados por conseguinte, com a formulação AS15 recMAGE-A3 + seleccionado em outra série de experiências para avaliar i) os efectores principais envolvidos na actividade anti-tumor, ii) a influência das injecções de reforço e iii) o impacto da heterogeneidade do tumor -i.e. a proporção de células tumorais expressando MAGE-A3 nesta actividade anti-tumoral.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Os experimentos foram realizados em laboratórios GlaxoSmithKline vacinas ou por equipe GlaxoSmithKline na Armand Frappier Institute (IAF – Canadá). Estudos em animais divulgados neste manuscrito foram eticamente revisado e aprovado pelo Comitê de Ética belga as Vacinas GlaxoSmithKline ‘para Experimentação Animal ou pelo Comité do IAF Ética. Eles foram conduzidos de acordo com a Directiva Europeia 2010/63 /UE, as normas do CCAC (Conselho Canadense para o cuidado de animais) e da Política Vacinas GlaxoSmithKline sobre o cuidado, Bem-estar e tratamento dos animais. Ambos instalação GlaxoSmithKline Vaccine e IAF são AAALAC (Associação para a Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care) acreditado. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento: tumores superior a um tamanho máximo permitido de 17 mm x 17 mm, de ulceração, necrose tumoral, convulsão, morbidade e circulando comportamento foram as condições que requerem a eutanásia por injecção intra-peritoneal com derivado de ácido barbitúrico (overdose)

Antigen Descrição, Produção e purificação

A proteína de fusão ProtD-MAGE-A3-Sua, também abreviado recMAGE-A3, contém os primeiros 127 resíduos de proteínas D derivados de

Haemophilus influenzae

na sua extremidade N-terminal para melhorar a expressão da proteína num sistema bacteriano, e uma sequência de resíduos de histidina na sua extremidade C-terminal para facilitar a purificação da proteína de fusão.

a produção de recMAGE-A3 foi realizada em

Escherichia coli

AR58 tensão, como descrito anteriormente [11]. Outra proteína de MAGE-A3 recombinante, que consiste nos primeiros 314 aminoácidos de MAGE-A3 seguido de 6 resíduos de histidina, foi produzida em baculovírus [11]. Esta proteína, denominada bacMAGE-A3, foi usada no controlo das respostas imunes.

Descrição dos Imunoestimulantes

AS02 consiste de uma emulsão de óleo-em-água contendo 3-

O

-desacyl-4′-monofosforil lido a (MPL, GlaxoSmithKline Vacinas, Rixensart, Bélgica), um receptor Toll-like (TLR) -4 agonista e QS-21 (

Quillaja saponaria

Molina fracção 21, Antigenics Inc, uma subsidiária integral da Agenus Inc., Lexington, MA, EUA), que é uma molécula da família saponina [12]. AS01 é um sistema adjuvante contendo MPL, QS-21 e lipossomas. AS15 contém MPL, QS-21, lipossomas, ea TLR-9 ligando CpG7909 (oligodesoxirribonucle�idos sintéticos [ODNs] contendo motivos CpG não metiladas; aqui referidos como CPG).

Mouse Cepas e Imunizações

C57BL /6 ou CB6F1 (híbrido entre C57BL /6 e BALB /c) ratinhos fêmea (6-8 semanas de idade) foram comprados na Harlan (Horst, Holanda) e mantidos em condições específicas isentas de patogénios.

Os ratinhos foram injectados normalmente 2 ou 4 vezes intramuscularmente, em intervalos de 2 semanas com 1 ou 10 ug de recMAGE-A3 em 50 ul de imunoestimulante.

Para estudar a protecção a longo prazo, os ratinhos receberam 2 injecções de qualquer recMAGE-A3 + AS15 ou solução (PBS) tamponada com fosfato, a intervalos de 2 semanas. Oito semanas após a segunda imunização, os animais foram desafiados com um tumor TC1-MAGE-A3 (ver a descrição das células tumorais abaixo;

modelos de tumor e desafios

). No Dia 150, 80 dias após a inoculação do tumor, os animais livres de tumor do grupo recMAGE-A3 + AS15 foram randomizados e divididos em dois grupos. Um grupo recebeu quatro injecções de reforço de recMAGE-A3 + AS15 em um intervalo de 4 semanas e o outro grupo recebeu injecções de PBS seguindo o mesmo esquema. Trinta dias após a última injecção, os ratinhos foram submetidos a um desafio do tumor no mesmo flanco, e o crescimento do tumor foi monitorizado durante 46 dias (até ao dia 319). Além disso, as células tumorais foram injectadas num grupo de dez murganhos imunizados com PBS, como um controlo positivo para o crescimento do tumor.

Para avaliar o papel do IFN-γ, perforina e MHC de classe I ou II em moléculas protecção tumoral sequência de MAGE-A3 imunoterapia, ratinhos imunodeficientes foram usados ​​com os mesmos esquemas de vacinação tal como descrito acima. As seguintes estirpes foram adquiridas pelo Instituto Jackson: IFN-y-nocauteado (KO) (B6.129S7-Ifngtm1Ts /J), MHC Classe I-KO (B6.129P2-b2mtm1Unc), MHC classe II-KO (B6.129S2 H2-dIAb1-Ea00451), B cell-KO (B6.129S2.IgHmTm1Cgn) e camundongos perforina-KO (C57BL /6-PRF1 tm1Sdz /J).

Para avaliar o papel potencial das células T, recMAGE-A3-imunizados ratinhos C57BL /6 foram depletados de CD4

+ ou CD8

+ células T por injecção de anticorpos anti-ratinho de rato de 0,5 mg (GK1.5 [TIB-207 a partir de ATCC] e 2,43 [TIB- 210 a partir de ATCC], respectivamente), uma semana antes do desafio do tumor e depois semanalmente durante o decurso da experiência. A depleção de células NK foi alcançada através da injecção do anticorpo anti-asialo GM1 (Cedarlane) duas vezes por semana, com início no dia 49 (i.e. 7 dias antes da inoculação do tumor) e até ao fim da experiência (0,1 ml por injecção). Depleções foram verificadas por citometria de fluxo (dados não apresentados). anticorpos de controlo com isotipos semelhantes aos anticorpos que destroem foram usadas como controlos negativos.

modelos de tumor e desafios

células

TC1-MAGE-A3 são células tumorais de murino geneticamente modificados para expressar humano MAGE-A3. células tumorais TC1 (obtidos a partir de Dr T. Wu, John Hopkins University) são interessantes como eles recapitular as diferentes etapas que conduzem a uma linha celular tumorigénico. Originalmente, a linha de células de tumor TC1 foi gerado a partir de células epiteliais /6 primário de pulmão C57BL imortalizadas por transfecção do

HPV-16 e6

e

e7

genes, e transformada com um activada

Ras

oncogene [13]. Estas células foram transf ectadas com um plasmídeo pcDNA3 contendo

MAGEA3

ADNc e o

zeocina

gene de selecção. Os clones resistentes a zeocina foram testados para o tratamento

MAGEA3

expressão por RT-PCR e para a expressão de MHC de classe I por citometria de fluxo (dados não apresentados). foi escolhido o melhor clone mostrando tumorigenicidade reprodutível em camundongos.

Para cada desafio, os animais receberam uma injecção subcutânea de 2 x 10

6 células TC1-MAGE-A3 (200 mL no flanco). crescimento do tumor indivíduo foi registado duas vezes por semana, medindo o produto das 2 principais diâmetros do tumor durante a fase de monitorização, começando 7 dias após o dia de desafio. Os ratos foram sacrificados durante o estudo quando o tamanho do tumor atingiu 289 mm

2. Em tal caso, o valor da última medição obtida antes do sacrifício foi transportado para o ponto (s) da próxima vez.

Para determinar se um limiar percentual de células tumorais MAGE-A3-expressam é necessária para provocar rejeição tumoral pelo sistema imunitário, os ratinhos e ratos PBS-falsamente imunizados imunizados com recMAGE-A3 + AS15 foram desafiados com células parentais TC1 (100% de células de MAGE-A3-negativas), células TC1-MAGE-A3 (100% MAGE- A3 células expressando), ou diferentes rácios de TC1 /TC1-MAGE-A3:. ou seja, 10/90, 50/50 ou 90/10%, respectivamente

produção de citocinas

esplenócitos de rato isolados foram cultivadas na presença de 1 ug /ml bacMAGE-A3. Após 72 h, as concentrações de IL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ e TNF-α nos sobrenadantes foram medidos por matriz de citometria de talão (CBA, gato Pharmingen N ° 551287), de acordo com as instruções do fabricante .

intracelular de citocinas coloração e Citometria de Fluxo

células mononucleares do sangue periférico isoladas de animais imunizados foram estimuladas

in vitro

em 96 redondos placas de poços de fundo com qualquer meio (sem estimulação ) ou um grupo de cinquenta e sete 15 péptidos meros sobrepostos por 10 aminoácidos, que cobrem toda a sequência de MAGE-A3 (1 ug /ml para cada péptido), em um volume final de 200 ul de RPMI, 5% de soro fetal de vitelo (FCS) contendo de coelho anti-ratinho de anticorpos anti-CD49d e anti-CD28 (Becton Dickinson, BD n ° 553154 e N ° 553295, respectivamente; concentração final: 1 fig /ml cada). Após 2 h de incubação a 37 ° C, a secreção de citocinas foi bloqueada pela adição de 50 ul de brefeldina (plug de Golgi, BD n ° 555029: 1/1000 em RPMI 5% de FCS). As células foram transferidas para uma placa de 96 cavidades de fundo cónico, centrifugado e lavado com 250 ul de PBS contendo 1% de FCS (FACS tampão). Os sedimentos de células foram incubadas durante 10 min a 4 ° C na presença de rato anti-CD16 /CD32 (2.4G2, BD n ° 553142; 0,5 mg /ml) para bloquear os receptores Fcy. CD4

+ e CD8

+ células T foram coradas durante 30 min a 4 ° C pela adição de anticorpo monoclonal anti-rato CD4 50 ul marcado com ficoeritrina ratazana (BD n ° 556616) ou peridinina clorofila marcado com proteína anti rato anticorpo monoclonal -mouse CD8 (BD n ° 553.036). Após um passo de lavagem, as células foram fixadas em 200 ul de solução-Cytoperm Cytofix (BD n ° 554722) durante 20 min a 4 ° C e permeabilizadas através da adição de solução permWASH (BD n ° 554723). Após centrifugação, as células foram incubadas 2 horas a 4 ° C com 50 ul de uma mistura de aloficocianina marcada com anti-IFN-γ (BD n ° 554413). As células foram lavadas, centrifugadas e ressuspensas em tampão de SCAF antes de análise de citometria de fluxo (BD de LSR2). Gating foi feito em células T, e um total de aproximadamente 20000 células CD4

+ células T foram adquiridos. Os dados foram expressos como percentagens de MAGE-A3-específicas IFN-γ produção de CD4

+ ou CD8

+ células entre a população total de CD4

+ ou CD8

+ células T T, respectivamente , após a dedução do controle de valor médio.

análises estatísticas

análises de citocinas foram realizadas utilizando uma análise de variância com grupo como fator após o log-transformação dos dados. Para outras análises, o modelo estatístico foi um ANOVA repetido com grupo, tempo e interação do grupo-por-tempo como fatores; a correlação entre as duas medições dos mesmos ratinhos é assumido como sendo auto-regressivo, isto é, correlações diminuir exponencialmente com o tempo. Variâncias foram assumidos para ser diferente entre os grupos, mas idênticos em pontos de tempo. Comparações dos tamanhos médios de tumor foram feitas no último ponto de tempo.

Resultados

imunológico e anti-tumorais respostas em ratinhos imunizados com recMAGE-A3 combinados com diferentes Imunoestimulantes

após quatro imunizações de ratinhos C57BL /6 com recMAGE-A3, sozinho ou formulado com um imunoestimulante (AS01, AS02, AS15 ou CpG), ambas as respostas imunitárias humorais e celulares foram avaliadas. A resposta de anticorpos foi baixa após a imunização apenas com recMAGE-A3, em comparação com a imunização com recMAGE A3-formulado com um imunoestimulante (Figura S1). As respostas humorais induzidas por recMAGE-A3 formuladas com vários imunoestimulantes foram consideradas equivalentes, independentemente da imunoestimulante. Da mesma forma, não foram observadas grandes diferenças entre as imunoestimulantes na sua capacidade de induzir respostas de células T, tal como avaliado por experimentos linfo-proliferação (figura S2).

Por outro lado, foram observadas diferenças relevantes entre os imunoestimulantes quando o

in vitro

produção de citocina por esplenócitos isolados a partir de animais imunizados foi medida pela CBA nos sobrenadantes da cultura (Figura 1). Apesar do baixo número de ratinhos (n = 2 ou 3), em cada grupo, os nossos resultados mostraram que AS15 induz uma tendência clara para um perfil Th1, caracterizada por uma maior de IFN-y /IL-5 e TNF-a /IL-5 rácios , comparativamente a AS01, AS02 e CpG. Esta observação foi associada a uma maior produção de IL-2 induzida por AS15 comparativamente aos outros imunoestimulantes.

Os ratinhos foram imunizados nos dias 0, 14, 28 e 42 com recMAGE-A3 (10 ug de antigénio) sozinho ou recMAGE-A3 formulado com diferentes imunoestimulantes, e re-estimulado

in vitro

por bacMAGE-A3. A produção de citocinas foi medida por citometria de matriz talão (CBA) após 72 h de cultura. Cada ponto representa um rato, e bares estão geomeans. N, não feito.

Depois de 4 imunizações com PBS ou recMAGE-A3 formuladas com diferentes imunoestimulantes, os ratos foram desafiados por via subcutânea com células tumorais TC1-MAGE-A3 e

in vivo

crescimento tumoral foi seguido durante 4 semanas. Em ratinhos tratados com PBS, um crescimento progressivo do tumor foi observada (Figura 2). Diferentes resultados foram observados para os ratos imunizados com recMAGE-A3, dependendo do imuno-associados. Os ratos não foram protegidos contra o crescimento do tumor quando AS02 foi usado e foram mal protegido com AS01 ou CpG. No entanto, o crescimento do tumor foi controlado nos ratinhos imunizados com recMAGE-A3 + AS15. Não só foi reduzido o tamanho do tumor neste grupo, mas 3/5 ratinhos eram quando os tumores foram avaliados quatro semanas após a inoculação do tumor livre de tumor.

Os ratinhos (n = 5) foram imunizados com recMAGE-A3 ( 10 ug de antigénio), formulado com diferentes imunoestimulantes e desafiado com células TC1-MAGE-A3. No dia 84, os erros padrão da média são mostrados e o número de ratinhos livres de tumor remanescentes é indicado para cada grupo. No dia 84, o grupo AS15 recMAGE-A3 + foi encontrado diferente de qualquer outro grupo (P 0,01). Além disso, a taxa de crescimento do tumor foi diminuído no grupo recMAGE-A3 + AS15, em comparação com os outros grupos (p 0,01).

A especificidade desta resposta anti-tumoral foi estabelecida, mostrando que os ratinhos imunizados com recMAGE + AS15 não foram capazes de erradicar as células TC1 transfectadas com um antigénio irrelevante (TC1-Her2 /neu) injectado nas mesmas condições que as células TC1-MAGE-A3 (dados não mostrados). Observou-se também que AS15 tinham de estar presentes em cada injecção para estimular eficientemente MAGE-A3 anti-imunidade (dados não mostrados).

com base em todo o conjunto de dados que comparam os diferentes imunoestimulantes, foi selecionado para todos AS15 experiências subsequentes com recMAGE-A3, uma vez que induziu uma resposta imunitária Th1 inclinado e foi o mais eficaz contra o crescimento de MAGE-A3-expressando células tumorais.

a imunização com recMAGE-A3 + AS15 Esclarece longo prazo protecção

um aspecto importante na geração de uma resposta imunitária anti-tumoral é a indução de memória imunológica de longo prazo que é capaz de proporcionar protecção a longo prazo contra a recorrência de tumor. Em experiências preliminares em ratos, observou-se que o aumento do número de + injecções AS15 recMAGE-A3 foi necessário para melhor proteger os ratinhos contra o desafio tumoral, sugerindo que a continuação da resposta imunitária após injecções repetidas podem ser necessários para melhorar a eficácia (dados não mostrados) .

Montamos um experimento para avaliar se a imunização com recMAGE-A3 + AS15 foi capaz de induzir memória imunológica tais longo prazo e se reforços eram necessários (Figura 3A). Para este fim, os ratinhos foram imunizados nos dias 0 e 14 com PBS ou recMAGE-A3 + AS15. A imunização com recMAGE-A3 + AS15 induzida CD4 específica de antigénio de IFN-produzindo-γ

+ e CD8

+ células T (Figura 4). Após o desafio com células tumorais TC1-MAGE-A3, todos os ratos PBS-imunizados desenvolveram um tumor e foram sacrificados, enquanto 52 de 60 ratos recMAGE-A3 + AS15-imunizados rejeitou o tumor e permaneceram livres de tumor, pelo menos, dois meses ( Figura 3A).

A. Desenho do estudo e tamanho da amostra (ratos CB6F1) nas diferentes etapas são mostradas. As imunizações foram feitas com 1 ug de antigénio. B. Depois do segundo desafio tumoral, crescimento tumoral foi seguido durante 46 dias. No final da experiência (dia 319), os erros padrão da média são mostrados e o número de ratinhos livres de tumores está indicado para cada grupo.

Ratos CB6F1 foram tratados como se mostra na Figura 3A . Resumidamente, os ratos foram depois de duas imunizações com recMAGE-A3 + AS15 ou PBS (controle 1) desafiou-tumor. Os ratos do grupo de MAGE-A3 + AS15 restantes ou boosters PBS receberam livres de tumor ou recMAGE-A3 + AS15 boosters. Um novo grupo de controlo recebeu PBS (Control 2). As amostras de sangue foram recolhidas no dia 21 (7 dias após a segunda imunização) e no dia 166 (7 dias após a primeira injecção de reforço). As amostras de sangue foram reunidas e as quantidades de IFN- γ-CD4 produtoras A3-específicos de MAGE

+ e CD8

+ células T foram determinadas por coloração intra-celular e citometria de fluxo. Os dados são expressos como a percentagem do total de CD4

+ total e CD8

+ T células após a subtração dos valores médios de controle, que representaram cerca de 0,02% na medição CD4

+ células T e 0,1% na medição CD8

+ células T, respectivamente; Cada ponto é um conjunto de 3 amostras no dia 21 e cada ponto é uma piscina de 5 amostras no Dia 166. *** = p . 0.001

Nesta fase, 50 do tumor 52 camundongos -free foram alocados aleatoriamente em dois grupos. Um grupo recebeu PBS e o outro grupo recMAGE-A3 + AS15. As respostas imunes foram avaliados no dia 166, 7 dias após o primeiro reforço. No grupo ter recebido um reforço PBS, o CD4

+ e CD8 respostas

+ de células T no dia 166 (5 meses após as duas primeiras imunizações com recMAGE-A3 + AS15) foram menores do que as respostas em Dia 21 (uma semana depois de as duas primeiras imunizações com recMAGE-A3 + AS15) (Figura 4). Isto ilustra a diminuição em respostas imunes ao longo do tempo. Em contraste, uma única injecção de reforço AS15 recMAGE-A3 + foi suficiente para aumentar os níveis de produção de citocina-CD4

+ células T até pelo menos os níveis medidos no Dia 21. Além disso, os níveis de CD8

+ células T foram aumentados até cinco vezes em comparação com os níveis medidos uma semana após as duas primeiras imunizações (Figura 4) e as MAGE-A3-specific CD8

+ células T produtoras de IFN-γ representada até 20% de o CD8

+ pool de células T.

Depois de quatro reforços mensais, os 50 ratos foram desafiados com tumor. Nesta fase, um terceiro grupo de 10 ratinhos que receberam apenas PBS foi introduzido como um controlo para o crescimento do tumor. Nenhum IFN-γ produção de células CD4 específicas de antigénio

+ e CD8 +

T foram detectados neste grupo de controlo.

No grupo que recebeu reforços de PBS, apenas níveis baixos de IFN- γ produtoras de antígeno-específica CD4

foram observadas células + T (residual das duas primeiras injecções de MAGE-A3 + AS15 dadas 9 meses antes). No entanto, 19 destes 25 ratinhos permaneceram livres de tumor após o desafio, o que indica que uma memória imunológica de longo prazo tinham sido colocadas e que os ratinhos foram ainda protegido quase um ano após a última imunização. No grupo de ratinhos impulsionado mensal com recMAGE-A3 + AS15 todos os 25 ratinhos permaneceram livres de tumor (Figura 3B). Estes dados sugerem que houve um benefício de dar injecções de reforço com recMAGE-A3 + AS15, mesmo se uma resposta imunitária de longa duração e eficiente foi induzida pela primeira imunização.

Numa experiência subsequente a longo prazo, determinou-se que era necessário AS15 em cada reforço para optimamente proteger os animais contra o crescimento do tumor (dados não apresentados).

CD4

+ células T, células NK, IFN-γ e MHC de Classe II são a célula subpopulações e Effectors moleculares envolvidos na recMAGE-A3 + induzida por AS15 protecção tumor

na tentativa de identificar as células ou os mecanismos efetoras que podem ser responsáveis ​​para a proteção contra o tumor, uma série de experimentos foi realizado em ratinhos KO tanto ou empobrecido de tipos de células específicos. Os diferentes grupos de ratinhos deficientes recebeu duas ou quatro imunizações de recMAGE-A3 + AS15 com um intervalo de duas semanas antes de serem desafiados com células TC1-MAGE-A3. Como mostrado na Figura 5, células B-KO, MHC Classe I-KO e perforina-KO ratinhos permaneceram protegidos por recMAGE-A3 + AS15 imunizações. Em contraste, a protecção do tumor foi impactado em NK e CD4 ratos com depleção de células

+ T, e em classe ratos II-KO MHC IFN-γ-KO e. Estes resultados identificaram a células CD4 +

T e células NK como populações de células-chave no mecanismo de rejeição do tumor. IFN-γ também foi identificado como um efector molecular crítico. Embora a exacta fonte de IFN-γ não é conhecido, sublinha ainda mais a importância de induzir uma resposta imunitária anti-tumoral Th1 tendenciosa.

Em experiências de depleção de células, isoptypes de controlo (Ig) semelhante ao do anticorpo usado para esgotar células T ou células NK foram usadas. O número de animais em cada grupo está indicado em cada gráfico do título. A seta vermelha indica o tempo de desafio tumor. No último ponto de tempo, os erros padrão da média são mostrados e o número de ratinhos livres de tumores está indicado para cada grupo. O tamanho médio do tumor de cada grupo foi estatisticamente em comparação com o do grupo AS15 + recMAGE-A3 no último ponto de tempo (* = p 0,01; ** = p 0,001; NS = não significativo).

a inibição do crescimento do tumor depende da proporção de MAGE-A3-expressando células no tumor

a expressão de antigénios MAGE não é necessariamente homogénea em um tumor, que mostra a coloração imuno-histoquímica focal em [14], provavelmente porque nem todas as células expressam MAGE-A3, ao mesmo tempo e ao mesmo nível. Como se espera que este fenómeno a ter um impacto sobre a eficácia do recMAGE-A3 + imunização AS15, nós avaliamos se recMAGE-A3 + AS15 foi capaz de proteger os ratinhos contra um tumor que não é composto por 100% de células de MAGE-A3-expressam.

Após a imunização com PBS ou recMAGE-A3 + AS15, os ratinhos foram desafiados com diferentes rácios de tumores parentais TC1 e células TC1-MAGE-A3-expressam (0-10-50-90 e 100%) (Figura 6). Os resultados mostraram que todas as misturas de tumor cresceu uniformemente em ratos sham-imunizados com PBS. Da mesma forma, o crescimento de um tumor MAGE-A3-negativo não foi impactado por recMAGE-A3 + imunização AS15. Em contraste, recMAGE-A3 + AS15 imunização protegidos contra o crescimento do tumor durante os 25 dias após a inoculação do tumor, mesmo quando apenas 10% das células TC1 expresso de MAGE-A3. O mesmo se aplica quando 50% das células, e para além dela, expresso de MAGE-A3. No entanto, enquanto que todos os ratinhos desafiados com 100% de células de MAGE-A3-expressam manteve-se até 57 dias livre de tumor após o desafio, foram observadas recaídas nos ratinhos desafiados com tumores que continham células de MAGE-A3-negativas. A intensidade do fenómeno era dependente da percentagem de células de MAGE-A3-negativo no tumor desafiador. No grupo desafiado com células 90% de MAGE-A3-expressam, 2/9 ratinhos mostraram uma recaída. O tamanho médio do tumor neste grupo não foi estatisticamente diferente do que a do grupo que recebeu 100% de células TC1 MAGE-A3-expressam. Em contraste, no grupo desafiado com 50% de células de MAGE-A3-expressam, 6/9 ratinhos tiveram uma recaída no dia 112, e no grupo desafiado com 10% de células de MAGE-A3-expressar, recidivas foram observadas em 7 /9 ratinhos no dia 112. o tamanho médio do tumor nestes grupos foi estatisticamente diferente do que a do grupo que recebeu 100% de células TC1 MAGE-A3-expressam, com o maior tamanho médio de tumor em todos os animais recaíram observados em ratinhos desafiados com 10% células MAGE-A3-expressar.

os ratos imunizados com recMAGE-A3 + AS15 (1 ug de antigénio) foram acompanhados ao Dia 112. Nos Dias 77 e 112, erros padrão da média são mostrados eo número de ratinhos livres de tumores está indicado para cada grupo. As comparações estatísticas do tamanho médio do tumor de cada grupo com o grupo do TC1-MAGE-A3 (100%) nos dias 77 e 112 são mostradas (* = p 0,01; ** = p 0,001; NS = não significativo). seta vermelha:. dia do desafio

Discussão

No presente estudo, avaliou-se o potencial de recMAGE-A3 formulado com diferentes imunoestimulantes. Ambas as respostas imunitárias induzidas e a sua capacidade para inibir o crescimento de tumor foram analisados. Para as experiências funcionais, o potencial anti-tumor de vacinas de MAGE-A3 foi avaliada em um ambiente profilático com ratinhos não portadores de tumor, em vez de um ambiente terapêutico, a fim de imitar mais de perto a situação clínica de tratamento adjuvante para pacientes com cancro. Na verdade, no cenário adjuvante, os pacientes em primeiro lugar submeter à cirurgia, e são considerados livres de tumor quando recebem o calendário de imunização. Embora os modelos de ratinho podem não inteiramente reflectir a situação humana, parcialmente devido a diferenças intrínsecas entre os dois sistemas imunitários [15] e porque os ratos não foram preparado por um tumor primário, a injecção de células TC1-MAGE-A3 foi seleccionada como um modelo de tumor para caracterizar o impacto das respostas imunológicas que tenham sido induzidas por imunização baseada em recMAGE-A3. Com este modelo, os diferentes imunoestimulantes pode ser avaliada e, pelo menos, parte dos mecanismos de rejeição tumoral pode ser desvendado.

A primeira e reprodutível observação foi que a injecção de recMAGE-A3 por si só não foi capaz de induzir respostas imunitárias protectoras , recMAGE-A3 sendo fracamente imunogénico por si só.