Abstract

Embora os médicos podem prever quais pacientes estão em risco de desenvolver metástases, terapias tradicionais muitas vezes revelar doença ineficaz e metastático é a principal causa de câncer morte do paciente; Portanto, existe uma necessidade de desenvolver terapias anti-metastáticos que podem ser administrados ao longo de grandes durações para inibir especificamente a motilidade das células cancerosas.

Withania

somnifera

extratos de raiz (WRE) têm actividade anti-proliferativa e o componente ativo, Withaferin A, inibe a proteína pró-metastático, vimentina. Vimentina é uma proteína de filamento intermédia e é parte do programa epitelial para mesenquimal (EMT) para promover metástases. Aqui, nós determinamos se ERH padronizado para Withaferin A (sWRE) possui actividade anti-metastática e se ele inibe a motilidade do cancro através da inibição da vimentina e o programa de EMT. Várias formulações de sWRE foram criados para enriquecer para Withaferin A e uma solução de estoque de sWRE em EtOH pode recuperar mais de 90% do Withaferin A encontrada no extracto original em pó. Esta formulação sWRE motilidade das células do cancro da mama e inibiu a invasão em concentrações menores do que 1 uM, tendo citotoxicidade desprezável a esta dose. tratamento sWRE interrompido morfologia vimentina em linhagens de células, confirmando a sua actividade inibidora vimentina. Para determinar se sWRE EMT inibida, o TGF-β foi usada para induzir EMT em células epiteliais mamárias humanas MCF10A. Neste caso, a indução sWRE impedido EMT e inibida 3-D esferóide invasão. Estes estudos foram levados a um modelo de xenoenxerto de carcinoma mamar io de ratinho e humano. Em ambos os modelos, sWRE e Withaferin Um mostraram inibição dependente da dose do crescimento do tumor e formação de nódulos metastático pulmonar com a toxicidade sistémica mínima. Tomados em conjunto, estes dados suportam a hipótese de que baixas concentrações de sWRE inibir a metástase do câncer potencialmente através da inibição EMT. Além disso, estas doses de sWRE têm quase nenhuma toxicidade nos órgãos de camundongos normais, sugerindo o potencial para uso clínico de cápsulas WRE administrados por via oral

Citation:. Yang Z, Garcia A, Xu S, Powell DR, Vertino PM, Singh S et ai. (2013)

Withania

somnifera

extrato de raiz Inibe mamária metástase de câncer e epitelial para mesenquimal Transição. PLoS ONE 8 (9): e75069. doi: 10.1371 /journal.pone.0075069

Autor: Michael Klymkowsky, Universidade do Colorado, Boulder, Estados Unidos da América

Recebido: 01 de março de 2013; Aceito: 09 de agosto de 2013; Publicação: 12 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por um R21 a partir do Centro Nacional para Medicina Complementar e Alternativa (1R21AT005231) atribuído à AIM, Charitable Trust Godfrey, e contra o cancro do jogador de golfe. Este trabalho também foi apoiado por uma CCSG P30 concedido ao Instituto do Câncer Winship (3P30CA138292). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro da mama é um dos cânceres mais comuns entre as mulheres nos Estados Unidos e a segunda principal causa de morte por câncer do sexo feminino [1]. Mais de 90% do cancro da mama mortes de pacientes são atribuídos à doença metastática onde o tumor primário invadiu locais distantes. Uma vez que estas células metastáticas são muitas vezes altamente agressivo, difícil de detectar, e resistente à quimioterapia, [2], uma estratégia terapêutica pode ser para prevenir a doença metastática, em vez de tratar, uma vez que ocorre.

O processo metastático podem ser categorizados em três invasão stages- célula tumoral no tecido circundante, intravasation em vasos sanguíneos ou linfáticos, e extravasamento em um ambiente de host novo [3-5]. Em muitos casos, as células metastáticas submeter epitelial-mesenquimal-a transição (EMT), em que os acontecimentos genéticos e ambientais causar uma célula epitelial polarizada para se tornar migratório e [6] invasivo. Ao nível molecular, EMT provoca um ganho de vimentina e expressão de fibronectina, e perda de E-caderina na membrana celular [7,8]. Evidências acumuladas mostram que EMT é um importante mecanismo de condução progressão e metástase [9-13] câncer de mama.

Withania

somnifera

(Ashwagandha) plantas são amplamente utilizados em East medicina indiana. O extracto de raiz somnifera W. (ERH) é composto de 14 compostos conhecidos como withanolides, com Withaferin A sendo a mais importante [14-16]. Withaferin A é um esteróide lactona que induz apoptose e inibe o crescimento do tumor por segmentação proteínas de sinalização, tais como p53, FOXO3a, Notch-1, Hsp90 e STAT3 [17-22]. Withaferin Um tratamento conduz a paragem do ciclo celular, aumento do stress oxidativo reactivo [23-26], a inibição da via de JAK /STAT [27], a inibição da angiogénese [28], e a forma da célula modificado e comportamento [29]. Um Withaferin também possui actividade anti-invasiva potente, o que poderia, potencialmente, ser devida à sua interacção com a proteína pró-vimentina migratório.

vimentina é tipo III filamento intermediário e marcador de proteína EMT clássica [30]. Embora funções vimentina em manter a estrutura da célula, também é um polímero altamente dinâmico que monta e dissimula numa célula móveis. Quando as células sofrem EMT, vimentina expressão é aumentada e este é pensado para proporcionar células mesenquimais com um mais, fenótipo pró-móveis [31]. O papel preciso de vimentina durante EMT e desenvolvimento não é clara, uma vez que um modelo knockout rato vimentina não mostraram defeitos de desenvolvimento graves [32]. Estudos adicionais no entanto fez ir para mostrar que esses ratos tinham prejudicado fibroblastos cicatrização de feridas, e uma reduzida capacidade de contrair uma rede de colágeno [33].

Withaferin A é proposto para se ligar a vimentina através de uma modificação covalente de cisteína 328 [34], levando a alterações na morfologia e vimentina fosforilação [29]; No entanto, outros dados mostram que a mutação da cisteína 328 não tem impacto sobre a inibição induzida por vimentina Um Withaferin [29]. Quando administrado intraperitonealmente (IP), Withaferin A inibe eficazmente a metástase do câncer de mama e tem quase nenhuma toxicidade observável [35].

Menos é sabido sobre a actividade anti-tumoral do Withaferin Um extrato da raiz pai, WRE . Efeitos similares são observados no crescimento do tumor, do ciclo celular, angiogénese e tratamento com ERH [36-40], juntamente com efeitos imunomoduladores em cólon e cancro do pulmão [41,42]. No entanto, estudos comparando diretamente WRE para Withaferin A não foram realizados, e a sua actividade anti-metastático não tem sido bem estudada. Além disso, ERH possui várias vantagens sobre Withaferin A, uma vez que pode ser dada por via oral em uma cápsula e as withanolides activas pode ter sinergia farmacológica; portanto, queríamos determinar a eficácia anti-metastático do WRE padronizado (sWRE) para o componente activa pura, Withaferin A, no cancro da mama. Mostrámos que sWRE pode inibir a invasão de células de cancro da mama humano

In vitro

e metástase em ambos os modelos de rato de aloenxerto e xenoenxerto de cancro da mama, semelhante à molécula pequena puro Withaferin A. sWRE induz reorganização vimentina e alterações morfológicas celulares em humanos células de câncer de mama e, mais importante, inibe a indução de EMT em células epiteliais mamárias humanas normais. Nossos resultados lançar luz sobre o potencial de sWRE como um romance medicina alternativa complementar usado como uma terapia preventiva anti-metastático em pacientes com câncer de mama de alto risco.

Métodos

Reagentes e anticorpos

WFA foi comprado de ChromaDex (Irvine, CA) e WRE foi fornecida por Ciências do Verdure (Noblesville, IN) com o certificado de análise afirmando que é livre de metais pesados, bactérias e fungos. O anticorpo contra vimentina foi adquirido a partir de Sigma (St. Louis, MO), a E-caderina da BD Biosciences (Bedford, MA), fibronectina de Abcam (Cambridge, MA), e GAPDH a partir de Cell Signaling (Beverly, MA).

preparação sWRE

100% de etanol foi aquecida a 60 ° C e, em seguida, misturado com ERH à concentração de 250 mg /mL durante 30 minutos num copo de vidro. H destilada

2O foi então adicionado lentamente para diminuir a concentração de etanol a 90%, e a agitação continuou durante mais 30 minutos. A mistura foi então centrifugada a 4000 rpm numa centrífuga durante 15 minutos à temperatura ambiente e o sobrenadante foi recolhido. O sobrenadante foi, em seguida, passou por um filtro de 0,22, dividido em alíquotas e mantido a -80 ° C para uso futuro.

linhas de células e condições de cultura

Humano MDA-MB-231 (ATCC # HTB -26), MCF-7 (# HTB-22) e T47D (# HTB-133), linhas celulares de cancro da mama foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Hs578-T, HCC1806 e MDA-MB-468 linhas de células de cancro da mama humano foram fornecidas pelo Dr. O, Regan (Universidade de Emory [45]). MCF10A humano linha celular epitelial mamaria foi fornecida pelo Dr. Vertino (Universidade de Emory [45]). carcinoma de mama murino 4T1 células foram fornecidos pelo Dr. Dewhirst (Duke University [35,45]). T47D e HCC1806 foram cultivadas em meio RPMI 1640 com 10% de FBS. MDA-MB-231, MCF-7, T-Hs578, MDA-MB-468 e 4T1 foram cultivadas em DMEM 10% FBS. MCF10A células foram cultivadas em DMEM /F12 suplementado com 5% de FBS, 20 ng /mL de EGF, 0,5? g /ml de hidrocortisona, de 100 ng /ml de toxina da cólera, e 10 ug /ml de insulina. Todas as linhas celulares foram mantidas num incubador humidificado a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO

2 atmosfera.

Ensaio de citotoxicidade

O Promega CellTiter 96

® Aqueous Non-Radioactive Proliferação celular Assay (MTS) foi realizada para determinar a

in vitro

citotoxicidade de sWRE. Resumidamente, as células foram cultivadas em placas de 96 poços durante a noite e, em seguida, tratados com sWRE na concentração indicada durante 72 horas. A viabilidade celular foi avaliada através da determinação da absorvância a 490 nm, tal como descrito pelo fabricante (Promega, Madison, WI). A viabilidade celular foi expressa como: Um

grupo exp /Um

X controlo 100.

in vitro de ensaio de cicatrização da ferida

A migração celular ferindo ensaio foi realizado como descrito anteriormente [43 ]. As células foram cultivadas em poços de placas de 6 a 100% de confluência. Após o ferimento com uma ponta de pipeta, as células foram lavadas com PBS e adicionou-se novos meios de comunicação com a respectiva concentração de sWRE. As células foram então deixadas migrar durante 24 horas a 37 ° C. Imagens de células foram tomadas no tempo 0 e 24 horas com um microscópio widefield Olympus IX51 (Center Valley, PA) a 5X com uma câmera CCD Hamamatsu Orca ER.

Matrigel ensaio de invasão

celular invasão foi ensaiada utilizando o Roche xCelligence RTCA DP (Cell real-Time Analyzer dupla Plate) Instrumento (Indianapolis, IN). DMEM com FBS a 10% foi adicionado para dentro da câmara inferior de uma placa 16. CIM-250 ug /ml de Matrigel (BD Biosciences) foi polimerizado nas cavidades da câmara de cima durante 1 hora a 37 ° C. meio livre de soro foi adicionado à câmara de topo, incubadas durante 30 minutos a 37 ° C, e uma medição de fundo foi recolhida. As células foram pré-tratadas com diferentes concentrações de sWRE em meio livre de soro durante a noite. Estas células foram então adicionadas à câmara superior e a placa foi incubada em 37 ° C, com o leitor de placas xCelligence. As medições de impedância foram feitas no poço inferior e o aumento da impedância se correlaciona com o aumento do número de células que migraram. Mudanças na impedância, o que se reflete pelos valores de índice de invasão celular, foram monitorados por pelo menos 24 horas.

Western blot

Os níveis de proteína em lisados ​​celulares foram medidos usando um ensaio BCA padrão. Os lisados ​​celulares em tampão de amostra foram separadas num gel a 10% de SDS-PAGE e foram transferidas para membranas de PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA). Após bloqueio com 5% TBST contendo leite isento de gordura, as membranas foram incubadas separadamente com anticorpos contra vimentina, E-caderina, fibronectina, e GAPDH à temperatura ambiente durante 2 horas. As membranas foram então lavadas e incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano durante 1 hora. As bandas foram detectadas utilizando Amersham ECL Além disso reagentes e depois exposto a película.

imagem confocal

As células foram cultivadas em lamelas de vidro e tratadas com sWRE por 24 horas. As células foram então fixados e processados ​​para a microscopia de imunofluorescência tal como anteriormente descrito [35]. As células foram coradas utilizando um anticorpo anti-vimentina de cabra primário e Alexa 488-secundário conjugado com IgG anti-ratinho. As lamelas foram montadas em lâminas e fotografada usando Zeiss LSM510 META microscópio confocal com um objectivo óleo 40X Plano-Neofluar (NA 1.3).

-PCR em tempo real

O ARN total foi isolado a partir de células usando o RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA) e pré-tratado com ADNase I. ADNc foi então sintetizada utilizando iniciadores de hexâmeros ao acaso e transcriptase reversa MMLV-. iniciadores específicos para o alvo foram utilizados para amplificar o ADNc, em triplicado, utilizando uma mistura de reacção que continha 1 ul da amostra de ADNc apropriadamente diluído, 0.2μmol /l iniciadores e 12.5μl de QI de SYBR Verde Supermix (Bio-Rad). ARNr 18S foi amplificado a partir das mesmas amostras como controlo interno. A reacção foi sujeita a um início a quente durante 3 min a 95 ° C e 40 ciclos de 95 ° C, 10 s; 55 ° C (18S) ou 63 ° C (vimentina), 30 seg. Primers para análise de PCR em tempo real foram para vimentina: 5 ‘AATGGCTCGTCACCTTCGTGAA3’ e 5 ‘CAGATTAGTTTCCCTCAGGTTCAG3’ e para 18S, 5 ‘GAGGGAGCCTGAGAAACG G3’ e 5

ensaio de invasão ‘GTCGGGAGTGGGTAATTT GC3’

tridimensional esferóide

placas de agarose revestidas foram feitas através do carregamento de cada poço com 0,75% de agarose em DMEM com FBS a 10%. Depois de a gelificação, células MCF10A foram adicionados aos poços e incubados a 37 ° C. esferóides de células formado dentro de 3-5 dias. 5-10 esferóides foram misturados com Matrigel em DMEM ou DMEM mais sWRE. A mistura foi colocada no meio de uma placa de petri de imagem 35 milímetros com uma lamela # 1.5 (MatTek Corporation) e, em seguida, colada na parte superior com uma lamela de cobertura adicional. O prato foi, então, colocado num banho a 37 ° C incubadora durante 30 min para permitir a polimerização de Matrigel, em seguida foi adicionado 2 ml de DMEM com 10% de FBS. O prato foi transferido para a célula viva PerkinElmer UltraView ERS disco giratório microscópio confocal [44] e as imagens foram adquiridas utilizando objetiva de 20x Zeiss (NA 0,75) a cada 20 minutos durante 24 horas com uma câmera de Hamamatsu Orca ER.

Em vivo sWRE estudo de toxicidade

oito semanas de idade do sexo feminino camundongos Balb /c foram adquiridos de Harlan e alojados nos modelos Winship Cancer animal instalação de acordo com nosso protocolo IACUC aprovado. Os ratos foram mantidos em grupos de cinco por gaiola e alimentados com dieta controle AIN76A e água

ad libitum

. Os ratos foram distribuídos aleatoriamente em 3 grupos de 3 ratinhos por grupo e tratados por cânula oral com veículo (9% de etanol) ou um veículo contendo sWRE a 4, e 8 mg /kg de peso corporal, 3 vezes por semana durante 4 semanas. Ratos peso corporal foi registado cada tempo após gavagem oral. Após 4 semanas de tratamento, os ratinhos foram sacrificados e os órgãos (coração, pulmão, fígado, baço e rim) foram recolhidas e enviadas para análise patológica. Os efeitos tóxicos foram avaliadas por um patologista veterinário cegado com base na presença de inflamação, fibrose e necrose utilizando uma escala de normal (1+) a moderada (3+).

modelo de carcinoma mamário

Todos os estudos com ratos foram realizados de acordo com nosso protocolo do Comitê Cuidado e Uso Emory University Institucional animal aprovado. Oito semanas de idade do sexo feminino ratinhos Balb /c foram divididos aleatoriamente em 4 grupos de 10 ratinhos em cada grupo. 10

6 4T1 células em PBS foram injectados subcutaneamente na almofada de gordura mamaria de cada ratinho. Uma semana após a injecção, sWRE foram administrados por gavagem oral com quer veículo ou veículo contendo sWRE em 1, 4, e 8 mg /kg de peso corporal, 3 vezes por semana durante 4 semanas. Withaferin A foi intraperitonealmente injectada por dissolução em 10% de DMSO, 20% de Cremophor-EL a 50% e PBS a 1, 4, e 8 mg /kg, 3 vezes por semana durante 4 semanas. O volume do tumor foi gravado antes da sonda esofágica, utilizando pinças com volume = (largura)

2 x comprimento /2. Os ratinhos foram sacrificados após 4 semanas de tratamento e nódulos metastáticos pulmonares foram contadas sob um microscópio de dissecação. Para a H E de coloração, do pulmão e tumor primário do veículo e ratos tratados com sWRE foram fixados em formalina a 10% neutra tamponada, processadas, embebidas em parafina e seccionados a 5 um de espessura. secções tumorais representativas de controle do veículo, sWRE-tratados, e os ratos Withaferin A-tratados foram processadas para H E coloração

Xenoenxerto rato cancro da mama modelo

Todos os estudos com ratos foram realizados de acordo com. o nosso protocolo aprovado Comitê Cuidado e Uso Emory University Institucional animal. Oito semanas feminina rato Foxn1nu atímicos de idade foram adquiridos de Harlan e alojados nos modelos Winship Cancer animal facilidade. Os ratinhos foram mantidos em grupos de cinco por gaiola e alimentados com dieta de controlo AIN76A e água ad libitum. Os ratinhos foram divididos ao acaso em 7 grupos com 10 murganhos em cada grupo e 10

6 MDA-MB-231 células em PBS foram injectados subcutaneamente na almofada de gordura mamaria de cada ratinho. Uma semana após a injecção, os murganhos foram tratados com veículo (9% de etanol), veículo contendo sWRE em 1, 4, e 8 mg /kg por sonda oral ou intraperitonealmente injectados com Withaferin A dissolvido em 10% de DMSO, 20% de Cremophor-EL e 50% PBS a 1, 4, e 8 mg /kg, 3 vezes por semana durante 4 semanas. O volume do tumor foi registado antes da administração por sonda. Os ratinhos foram sacrificados após 4 semanas de tratamento e nódulos metastáticos pulmonares foram contadas sob um microscópio de dissecação. Para a H E de coloração, do pulmão e tumor do veículo e ratos tratados com sWRE foram fixados em formalina a 10% neutra tamponada, processadas, embebidas em parafina e seccionados a 5 um de espessura. secções tumorais representativas de controle e ratos tratados com sWRE foram processados ​​para a H . E coloração

Análise Estatística

Os dados foram analisados ​​estatisticamente utilizando GraphPad Prism para Windows (versão 5). One-way ANOVA foi realizada para comparar a média de nódulos pulmonares entre os grupos experimentais. Linear modelo de efeitos mistos foi utilizado para comparar os volumes médios de tumor entre os grupos. Os valores de p . 0,05 foram considerados significativos

Resultados

WRE Normalização, solubilidade e citotoxicidade

WRE pó foi solubilizado em H

2O ou 90% de etanol ( EtOH) em diferentes concentrações para determinar as condições óptimas para padronizar ERH (sWRE) à molécula pequena puro Withaferin A. a concentração de Withaferin Um em cada formulação sWRE foi medida por HPLC (Figura 1A) e a taxa de recuperação de Withaferin Um depois foi solubulization calculada para cada amostra (Figura 1B). O teor de Withaferin Uma comparação com outras withanolides utilizando HPLC é mostrada na Tabela 1. Quando sWRE a 250 mg /mL foi dissolvido em água, o Withaferin uma taxa de recuperação foi de 4%. A maior percentagem de recuperação de Withaferin A em água foi de 16%, observada a uma concentração inicial de 10 mg /ml sWRE. Em contraste, quando o pó ERH foi dissolvido em EtOH a 90% a uma taxa de recuperação Withaferin variou 80-92%. Estes resultados mostram que a re-solubilização da sWRE em EtOH a 90% é nitidamente superior àquela em H

2O. Para estimar a estabilidade a longo prazo da solução-mãe ERH em EtOH a 90%, análise por HPLC foi realizada em ERH após 6 e 12 meses de armazenamento a -80 ° C. Os resultados mostram que cerca de 90% do inicial Withaferin A pode ser detectado após 6 meses, e cerca de 80% após 12 meses (Figura 1C, D).

sWRE pó foi dissolvido em diferentes solventes e a concentração ( a) taxa de recuperação e (B) de Withaferin a em sWRE foi medida por HPLC. A estabilidade da Withaferin A em sWRE (90% solução de EtOH) ao longo do tempo é mostrado em um gráfico de barras com o absoluto (C) e relativo (D) Withaferin Uma concentração.

Withanolides

Concentração (mg /ml)

Percentual (%)

Withaferin A5.8879.03Withanoside V0.3564.7812-Deoxywithastramonolide1.0614.25Withanolide A0.1361.83Withanolne0.01370.18Total Withanolides7.44100.00Table 1. withanolides em WRE por HPLC.

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para avaliar a citotoxicidade, as linhas celulares de cancro da mama foram tratadas com concentrações crescentes de Withaferin ERH a-padronizado (sWRE) durante 24 e 72 horas (Figura 2A, B). Entre as seis linhas celulares testadas, quatro (MDA-MB-468, carcinoma hepatocelular 1806, Hs587-T, e MDA-MB-231) são linhas celulares de cancro da mama negativas triplas [45]. Desde Withaferin A é um agente de direccionamento vimentina [30,34], expressão de vimentina, juntamente com outros marcadores EMT foram avaliados nas linhas celulares. Duas das quatro linhas celulares negativas triplas, (Hs578-T e MDA-MB-231) foram vimentina-positiva e todas as outras linhas celulares foram vimentina-negativo. Estas linhas de células positivas vimentina também exibiram uma indução de EMT uma vez que eles mostraram perda de E-caderina e fibronectina foram positivos (Figura 2C). Curiosamente, foi observada diferente sensibilidade para sWRE entre as seis linhas celulares, onde as duas linhas de células mais sensíveis, Hs578-T e MDA-MB 231, estavam vimentina-positivo com uma IC 72 horas

50 de 0,5 uM e 0.4μM respectivamente (Figura 2B). As linhas de células vimentina negativa teve IC

50 anos que variaram de 1.2μM para 4.0μM. Para investigar isto, os ensaios de citotoxicidade foram realizados em controlo isogénico e vimentina siARN empobrecido MDA-MB 231 células. Neste caso, as células vimentina empobrecido mostram uma redução menor na sWRE citotoxicidade em comparação com células de controlo isogénicas (Figura 2D).

(A e B) gráficos mostrando a% de sobrevivência das linhas celulares de cancro da mama tratadas com seis aumentando concentrações de sWRE para 24 (A) e 72 horas (B). (C) Western blot mostrando marcadores EMT em diferentes linhas de cancro da mama. linhas celulares de cancro da mama negativas triplos estão indicados com um asterisco. (D) (à esquerda) Western blot mostrando bem sucedida esgotamento vimentina siRNA (direita) ensaio Cytotoxciity usando sWRE no controle isogênico e vimentina siRNA células esgotado.

sWRE inibe a motilidade celular do cancro da mama e da invasão, e interrompe vimentina morfologia

Temos demonstrado anteriormente o Withaferin a inibe a motilidade celular do cancro da mama e metástases [35]; por isso, procurou-se determinar se sWRE mostra eficácia anti-invasivo. O efeito de sWRE sobre a motilidade celular de células de cancro da mama negativas triplos (humano MDA-MB-231 e 4T1 de rato) foi testada utilizando um ensaio de ferida cura. ERH inibe a motilidade celular de um modo dependente da dose depois de 24 horas de tratamento com 0,5 uM em ambas as linhas celulares (Figura 3A, B). Um experimento expandida em doses mais baixas em 231 células MDA-MB mostra a inibição da motilidade celular a 0,25 uM, bem como (Figura S1). Em seguida, queriam determinar a motilidade celular impactos como sWRE quando vimentina proteína está ausente. Este experimento foi tentada em primeiro lugar em células de carcinoma de mama MCF7 468 e MDA MB, os quais não têm vimentina detectável por transferência Western; No entanto, nestes casos, as células também não eram móveis para que a experiência não pôde ser executada (dados não mostrados). Em vez disso, utilizou-se a linha celular epitelial pulmonar, BEAS-2B, que carece de vimentina (Figura S1-B) e alguns mostra motilidade. sWRE tinha um IC 24 h anti-proliferativa

50 de 2.9μM e um IC 48 h

50 de 1,9 uM (Figura S1-C). Num ensaio ferindo, doses mais baixas de sWRE (0,125 a 1 ^ M) abaixo do IC

50 tiveram quase nenhum impacto sobre a motilidade celular (Figura S1-D). Não foi até o tratamento com 2 mM sWRE que está perto do IC 24 hr anti-proliferativa

50, se observamos a inibição apreciável de motilidade celular (Figura S1-D).

(A e B) ferindo ensaio em (a) MDA-MB-231 e (B) 4T1 células tratadas com concentrações crescentes de sWRE durante 24 horas. (C e D) gráfico linear mostrando a taxa de invasão celular através de Matrigel incorporado numa câmara de Boyden em (C) MDA-MB-231 e 4T1 células tratadas com concentrações crescentes de sWRE (D). células-231 MDA-MB (E) confocal de imagens de imunofluorescência de vimentina (verde), actina (vermelho) e DAPI (azul) no tratado com o controle EtOH 9%, 0,5 uM ou 1.0μM sWRE.

A actividade anti-invasiva de sWRE foi testada utilizando um ensaio de invasão de Matrigel em tempo real numa câmara de Boyden. sWRE foi novamente capaz de inibir significativamente a invasão de células em ambas as linhas celulares, com doses tão baixas como 0.25μM em 4T1 e 0,5 uM em células MDA-MB-231 (Figura 3C e D). Estes resultados mostram que sWRE inibe a motilidade celular e é anti-invasivo em células de câncer de mama triplo negativo.

Desde Withaferin A inibe a vimentina [30,34], exploramos se sWRE tem capacidade de desregulação vimentina similar. Vimentina imunofluorescência em células de controlo MDA-MB-231 mostram que vimentina está ligado em rede por todo o citoplasma em forma de fuso; No entanto, após tratamento sWRE (0,5 uM e 1.0μM) durante 16 horas, as células não foram tão alongado e a rede vimentina foi abolida (Figura 3E). Em vez disso, vimentina acumulado como um feixe perinuclear na maioria das células, o que é semelhante ao efeito de puro Withaferin A [35]. Além disso, sWRE não diminuiu os níveis totais de proteína celular até 48 horas de tratamento (Figura S2), o que sugere que isto não é devido a um defeito na síntese de proteína total. Portanto, com base nestas observações, concluímos que sWRE também possui atividade inibitória vimentina em doses baixas.

sWRE impede induzida por TGF EMT

Desde vimentina desempenha um papel fundamental na EMT, quisemos testar se sWRE poderia inibir EMT e motilidade no cancro da mama EMT-induzido. Para testar isto, utilizou-se células MCF10A, em que o tratamento com 4 ng /ml de TGF-p faz com que estas células se submeter EMT, tal como avaliado por um aumento no vimentina marcadores mesenychmal e fibronectina, e perda do marcador epitelial, E-caderina [8,9 ]. Estes dados mostram que inibe sWRE MCF10A motilidade em um ensaio de cicatrização da ferida com TGFp (Figura 4C), em doses semelhantes às utilizadas em 4T1 e linhas de células MDA-MB-231cell (Figura 3). Para avaliar como impactos sWRE EMT, células MCF10A foram tratados com TGF-p na presença de sWRE ou Withaferin A. TGFp sozinho induziu vimentina e proteína fibronectina expressão e diminuição dos níveis de proteína E-caderina, indicando a indução bem sucedida de EMT. Em contraste, o tratamento com 500 nM ou 500 nM sWRE Withaferin Um potentemente inibida EMT induzida por TGF-p, mantendo-vimentina e fibronectina em níveis pré-indução e o aumento dos níveis de E-caderina (Figura 4A, B). Para determinar se isto ocorre ao nível da transcrição, PCR em tempo real da transcrição vimentina foi realizada e estes resultados mostraram que o TGF-p aumentou ARNm vimentina como esperado, mas sWRE não impacto níveis vimentina de ARNm (Figura 4D), semelhante à observada usando Um Withaferin [30]. Por conseguinte, os resultados mostram que sWRE não inibir a expressão de vimentina no nível de ARNm, mas sim ao nível da proteína.

(A) Western blot da vimentina em células de TGF-p1-MCF10A estimuladas tratadas com concentrações crescentes de sWRE. (B) Western blot de vimentina, fibronectina e E-caderina em TGF-p1 estimulado células MCF10A tratadas com 500 nM sWRE ou Withaferin A. (C) A migração celular no ensaio de cicatrização com concentrações crescentes de WRE. (D) os níveis de ARNm vimentina relativas detectadas por PCR em tempo real em células estimuladas MCF10A TGF-p1-tratadas com 500 nM ou sWRE FPA. (E) imagens de lapso de tempo de células vivas de MCF10A 3D esferóides incorporado em Matrigel e estimuladas com TGF-p1. Células foram tratadas com 9% de controle EtOH, ou 100 nM ou 500 nM sWRE.

Estes estudos foram, em seguida, mudou-se para um modelo esferóide de invasão para determinar se sWRE inibe a invasão induzida por EMT. Neste modelo, o TGF-p induzida potente invasão em Matrigel a matriz extracelular utilizando imagem de células vivas para visualizar invasão (Figura 4E, Filme S1); No entanto, após tratamento com doses tão baixas como 100 nM sWRE, invasão foi inibida de forma potente (Figura 4E, Filme S2). Tomados em conjunto, estes resultados mostram que sWRE pode inibir EMT e induzida EMT motilidade e invasão.

sWRE in vivo toxicidade

Para estudar a eficácia anti-metastático de sWRE

In vivo

, toxicidade sWRE foi avaliada pela primeira vez em BALB /c fêmea de ratinho normal. Os ratinhos receberam ou 4 ou 8 mg /kg sWRE em 9% de EtOH e o ganho de peso corporal médio após 35 dias em ratinhos tratados não foram significativamente diferentes do grupo de controlo dado 9% de EtOH sozinha (Figura 5A). Depois de quatro semanas de tratamento, a histologia do coração, pulmão, fígado, baço e rim foram classificados para a fibrose, necrose e inflamação. dados histológicos mostram nenhuma diferença significativa entre sWRE-tratados e grupos de controlo de veículo (Figura 5B, C).

(A) Peso relativo do corpo em ratos tratados com veículo, ou no sWRE 4 mg /kg e 8 mg /kg. (B) de classificação histológica de inflamação, fibrose e necrose em órgãos de ratos tratados com veículo (9% de EtOH) ou sWRE a 8 mg /kg. (C) Imagens representativas de H E manchado cortes histológicos

sWRE anti-metastático eficácia

Para determinar a eficácia anti-metastático de sWRE e compará-lo com Withaferin A em um. modelo de rato, foi utilizado o modelo metastático carcinoma mamário de ratinho 4T1. Este modelo desenvolve lesões metastáticas no pulmão, fígado, baço e 4-6 semanas após a injecção das células em almofada de gordura mamaria. Os ratinhos foram divididos aleatoriamente em 4 grupos de 10 ratinhos em cada grupo, e sWRE foi dada por gavagem oral e por injecção i.p. Um Withaferin injecção em 1, 4, e 8 mg /kg, 3 vezes por semana durante 4 semanas. O intervalo de dose foi seleccionada com base na experiência anterior sWRE toxicidade no ratinho BALB /C (Figura 5). Em todas as doses, o volume do tumor primário foi diminuída após 36 dias de tratamento com sWRE ou Withaferin A (Figura 6A, B). amostras brutas representativos de tumores primários mostram que tanto sWRE e Withaferin A tumores tratados eram menores (Figura 6C). Mais importante, o número de nódulos metastáticos pulmonares diminuíram significativamente em ambos os 4 e 8 mg /kg em grupos sWRE e Withaferin Um ratinhos tratados (Figura 6d, e, e exemplos na Figura 6G). H . E coloração confirmou a presença de lesões micro-metastáticas do pulmão (Figura 6F)

(A e B) o volume do tumor em ratos tratados com uma média de 1, 4, 8 mg /kg de (A) sWRE ou (B) Um Withaferin (FMA) (* P 0,05 comparado com o controlo). (C) Imagens representativas do tumor primário em sWRE ou FPA ratinhos tratados. (D e E) Gráfico de barras que mostra o número médio de nódulos metastáticos pulmonares em (D) sWRE ou ratinhos tratados com FMA (E) (* P 0,05 comparado com o controlo). (F) Representante H imagens de coloração E mostrando a histologia de nódulos metastáticos no pulmão do rato; dois exemplos mostrados. (G) Imagens representativas de nódulos metastáticos do pulmão (setas pretas) em ratos tratados com veículo de controlo (9% EtOH) ou sWRE ou WFA a 8 mg /kg.

Para testar ainda mais a eficácia anti-metastático de sWRE, foi realizada uma experiência semelhante utilizando um modelo de xenoenxerto humano com cancro da mama metastático de células MDA-MB-231. As células foram injectados subcutaneamente na almofada de gordura mamaria de ratinhos nus atímicos fêmeas. Os ratinhos foram administrados por sonda oral sWRE e Withaferin A por via i.p. injecção com uma concentração de 1, 4, e 8 mg /kg, 3 vezes por semana durante 4 semanas. volume do tumor primário foi inibida por sWRE em 4 e 8 mg /kg doses.