Abstract
fenilbutil isoselenocyanate (ISC-4) é um inibidor da Akt com eficácia pré-clínica demonstrou contra o melanoma e câncer de cólon. Neste estudo, procurou-se melhorar a utilidade clínica do ISC-4 através da identificação de uma combinação sinergética com terapias aprovadas pela FDA anti-cancro, uma configuração de doença em causa e adequado para o teste, e biomarcadores de resposta. Foi testada a actividade de ISC-4 e 19 agentes anti-cancerígenos aprovados pela FDA, por si só ou em combinação, contra as linhas celulares de cancro de cólon humano SW480 e RKO. A interacção sinérgica com o cetuximab foi identificado e validado num painel de linhas celulares de cancro do cólon adicionais, assim como a cinética de sinergia. ISC-4 em combinação com cetuximab sinergicamente reduziu a viabilidade das células cancerígenas do cólon humano com o tipo selvagem, mas não mutante
KRAS
genes. Outras análises revelaram que a terapia de combinação cooperativamente redução da progressão do ciclo celular, o aumento da apoptose dependente da caspase, e diminuição da fosfo-Akt em células tumorais responsivas. O sinergismo entre ISC-4 e o cetuximab foi mantida independentemente da resistência adquirida ao 5-FU em células de cancro do cólon humano. A combinação demonstrou efeitos anti-tumorais sinérgicos
in vivo
sem toxicidade e em face da resistência ao 5-FU. Estes resultados sugerem que a combinação de ISC-4 e cetuximab deve ser explorada em pacientes com câncer de cólon resistente ao 5-FU abrigar do tipo selvagem
KRAS
Citation:. Allen JE, Gallant JN, Dicker DT, Amin S, Irby RB, Sharma AK, et ai. (2013) As Akt Inhibitor ISC-4 synergizes com Cetuximab no cancro do cólon 5-FU-resistente. PLoS ONE 8 (3): e59380. doi: 10.1371 /journal.pone.0059380
editor: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 21 de novembro de 2012; Aceito: 13 de fevereiro de 2013; Publicação: 12 de março de 2013
Direitos de autor: © 2013 Allen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações para WSE-D. e recursos do Instituto Penn State Hershey Cancer, NIH National Cancer Institute subvenção R03-CA143999 a A.K.S., eo subsídio da Fundação de Pesquisa do Câncer de pulmão para A.K.S. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Os autores reconhecem o interesse concorrente que Dr. El-Diery faz parte do conselho editorial para PLOS e, conforme solicitado, confirmar que isso não altera a sua adesão a todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
isoselenocyanates fenilalquilo (ISC), os análogos de selênio isostérico da classe que ocorrem naturalmente isotiocianato de compostos [1], [2], foram desenvolvidos recentemente nos nossos laboratórios e têm sido mostrados para inibir a actividade de Akt [3], [4], [5], [6]. Entre os ISC investigados, ISC-4 mostrou a melhor atividade anti-tumoral em modelos pré-clínicos, tanto
in vitro
e
in vivo
, com a segurança promissora [4]. ISC-4 demonstrou eficácia pré-clínica modesta contra muitos tipos de tumores
in vitro
, e efeitos anti-tumorais foram relatados no contexto de melanoma quando ISC-4 é utilizado um mono-agente
In vivo
[4], [5], [6]. ISC-4 também demonstrou efeitos significativos anti-tumorais, por meio da inibição da Akt, em xenoenxertos de cancro do cólon, quando utilizado como um mono-agente e, quando usado em combinação com 5-fluorouracilo (5-FU) -embora a utilidade clínica do combinação ficou claro [5].
o PI3K /Akt é sobre-activada ou alterada na maioria dos cânceres colorretais, que é o terceiro cancro mais frequentemente diagnosticado e mortal nos Estados Unidos [7]. A quimioterapia padrão de cuidados para a doença avançada inclui o FOLFOX, ou regimes Folfiri, que são compostos de 5-FU, leucovorina, oxaliplatina, e irinotecano em adição a outras opções de tratamento, incluindo o bevacizumab, anticorpo monoclonal anti-VEGF e o anticorpo anti -EGFR cetuximab anticorpo monoclonal. Embora essas opções de combinação de tratamento têm aumentado a sobrevida dos pacientes, não tóxicos opções de tratamento específicas adicionais são necessários no ambiente de terapia refratário de câncer de cólon avançado.
Embora a atividade mono-agente pré-clínica de ISC-4 é , terapia significativa combinação não foi totalmente explorado. Por isso, procurou combinações sinérgicas com ISC-4 utilizando um painel de medicamentos aprovados pela FDA. Aqui, nós relatamos a identificação de ISC-4 e cetuximab como uma terapia de combinação promissora que tem actividade anti-tumoral sinérgica
in vitro
e
in vivo
contra cancros do cólon humanos abrigam um tipo selvagem
gene KRAS
.
Materiais e Métodos
cultura de células, ensaios de viabilidade celular e reagentes
As linhas celulares foram obtidas a partir de ATCC e cultivadas em ATCC- meios recomendados numa incubadora humidificada a 5% de CO
2 e 37 ° C. As linhas de células utilizadas neste estudo não foram autenticado. Para os ensaios de viabilidade celular, as células foram semeadas em placas de paredes negras de 96 poços, a uma concentração de 1 × 10
5 células por ml em meio fresco e em um volume de 100 ul por poço. As células foram deixadas aderir durante a noite e foram tratados no dia seguinte, conforme indicado. No ponto final, os ensaios CellTiter-Glo (Promega) foram realizadas de acordo com o protocolo do fabricante, e a leitura bioluminescente foi registado no sistema de imagiologia IVIS um (Xenogen). Para a sincronização da célula, as células foram incubadas com 200 ng de nocodazole /mL durante 16 horas antes do tratamento. A cloroquina foi obtido a partir de Sigma. zVAD-fmk foi obtido a partir de Promega e utilizados a uma concentração de trabalho de 25 uM. ISC-4 foi sintetizada tal como previamente descrito [6].
A citometria de fluxo
para a sub-G1 análise do conteúdo de ADN, as células foram tripsinizadas, nos pontos de tempo indicados e fixadas em 80% de etanol a 4 ° C durante um mínimo de 30 minutos. As células fixadas foram então coradas com iodeto de propidio na presença de RNase e analisadas num citómetro de fluxo Epics Elite (Beckman Coulter). Para a expressão de Ki-67, as células foram fixadas etanol, como descrito acima, e imunocoradas com um anticorpo anti-Ki-67 (Sigma) a 1:500 durante 30 minutos. As células foram subsequentemente incubadas com 488 anticorpo conjugado AlexaFluor em 1:500 em PBS durante 30 minutos e ressuspensas em PBS para análise.
análise Western blot
As células foram tratadas em crescimento de fase log, colhidas por raspagem células, centrifugou-se, e lisadas em gelo durante 2 horas com tampão de lise de células-. O sobrenadante foi recolhido após centrifugação, e a concentração de proteína foi determinada utilizando o ensaio de proteína Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories). As amostras foram sujeitas a electroforese sob condições redutoras em geles NuPAGE 4-12% Bis-Tris (Invitrogen), transferidas para PVDF, e bloqueada em leite a 10% não-gordo em TBST durante 1 hora. As membranas foram depois incubadas com anticorpos primários obtidos a partir de Cell Signaling no leite não gordo 1:1000 em 2% em TBST durante a noite a 4 ° C. As membranas foram lavadas em TBST, incubados com o anticorpo apropriado conjugado com HRP secundário (Thermo-Scientific) durante 1 hora, lavadas em TBST, e visualizadas utilizando ECL-Plus (Amersham) e a película de Raios-X (Thermo-Scientific).
In vivo
estudos
ratinhos nu feminino atímicos (Charles River Laboratories) foram inoculados com 1 × 10
6 de 5-Fu RKO resistentes ou HT-29 células em cada flanco traseiro como uma suspensão de 200 mL de 01:01 Matrigel (BD): PBS. O tratamento foi iniciado quando os tumores atingiram um volume médio de ~1650 mm
3, intraperitoneal ou injecções intravenosas foram dadas em um volume total de 200 mL em DMSO. Para a análise do tecido, o tecido foi colhida a partir de ratinhos sacrificados e fixados em paraformaldeído a 4% em PBS durante 48 horas. O tecido foi parafina embebida e seccionada pela Facilidade Histologia Núcleo da Penn State Hershey Medical Center. H E de coloração (Daiko) e coloração TUNEL (Millipore) foram realizadas de acordo com os protocolos do fabricante. Para os ensaios de química de soro, 1 mL de sangue foi colhida a partir de ratinhos anestesiados por punção cardíaca terminal do ventrículo esquerdo. Para química do soro, 500 ul foi colocada num tubo de microcentrífuga e deixou-se coagular durante 30 minutos à temperatura ambiente seguido por centrifugação. O soro foi retirado, centrifugado novamente para remover qualquer resíduo adicional, e submetidos à análise do Diagnostic Lab Medicina Comparativa na Universidade Penn State Hershey Medical Center. Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal (IACUC) na Penn State Hershey Medical Center.
Estatísticas
Comparações pareadas foram avaliados pelo Estudante de dois t-teste -tailed no Microsoft Excel. índices combinados foram calculados com o software CalcuSyn (Biosoft) usando o método de Chou-Talalay [8].
Resultados
Definir o ISC-4
in vitro
perfil de atividade
testou-se o mono-agente
in vitro
actividade de ISC-4 em um painel de linhas celulares de cancro humano, para caracterizar o seu espectro de actividade. Entre as linhas celulares testadas, as linhas de células de linfoma humano de Daudi e Granta foram os mais sensíveis, e o cancro da próstata PC3 linhas celulares DU145 e humano foram as menos sensíveis em termos de CE
50 valores (Fig. 1A). Com exceção do HT-29, linhas celulares de cancro do cólon humano foram moderadamente sensíveis ao tratamento ISC-4. As linhas de células HCT116 isog�nicas indicam que ISC-4 atividade é provável p53 e Bax-independente. A fim de melhor caracterizar os efeitos terapêuticos da ISC-4 e, potencialmente, melhorar a sua actividade combinatória, enfocamos o estudo da ISC-4 em câncer de cólon por causa da atividade mono-agente moderada [5].
( A) Os ensaios de viabilidade celular e calculado CE
50 valores para linhas celulares indicadas tratados com ISC-4 ou DMSO (72 h, n = 3). Efeito do tratamento ISC-4 sobre os perfis do ciclo celular de (B) HCT116 síncronas e assíncronas e linhas (C), HT-29 de células. células assíncronos são indicadas por A na figura. (D) o conteúdo Sub-G1 de linhas celulares de cancro do cólon indicados a seguir ISC-4 tratamento (0, 1, 2, 4, 8 ou 16 mM).
Análise
ciclo celular da ISC-4 tenha sido tratada com HCT116 sincronizado e HT-29 linhas celulares de cancro do cólon humano revelou um modesto aumento no teor de sub-G1 e uma diminuição na taxa de progressão do ciclo celular (Fig. 1B-C). Induzida ISC-4 conteúdo sub-G1 é dose-dependente e geralmente se torna aparente at 8 mM (Fig. 1D). Assim, ISC-4 tem a atividade do agente único modesto contra as células cancerígenas do cólon humano, causando a morte celular e uma diminuição na proliferação.
Identificar uma combinação sinérgica com ISC-4
Temos procurado por combinações sinérgicas de ISC-4 com terapias aprovadas pela FDA para melhorar a eficácia da ISC-4 contra o câncer de cólon. Nós selecionamos as linhas celulares de cancro de cólon humano SW480 e RKO para avaliação inicial com base em suas alterações genéticas oncogênicos heterogêneos. SW480 tem mutante
p53
, mutante
KRAS
, e do tipo selvagem
BRAF
enquanto RKO tem de tipo selvagem
p53
, do tipo selvagem
KRAS
e mutante
BRAF
genes [9]. Entre o painel de teste de quimioterapias e agentes específicos, actividades combinatória foi observada em, pelo menos, uma linha de células quando ISC-4 foi combinado com sorafenib, gefitinib, gemcitabina, cisplatina, bortezomib, imatinib, ou cetuximab (Figura 2; Tabelas S1, S2) . No entanto, a combinação de ISC-4 e cetuximab foi a única terapia combinatória sinérgica observada sob as condições testadas. Por outro lado, essa sinergia foi observada apenas na linha de células RKO, que abriga de tipo selvagem
KRAS
, e não na linha de células SW480 que abriga
KRAS
G12V
. Esta observação está de acordo com a exigência de tipo selvagem
KRAS
para a eficácia clínica do cetuximab no câncer de cólon [10], [11].
ensaios de viabilidade celular em SW480 e RKO cólon linhas celulares de cancro tratados com ISC-4 (1, 2, ou 4 mM) e indicado terapias no putativo CE
12,5, CE
25, e CE
50 sozinho e em combinação (n = 3). As doses são fornecidas na Tabela S1.
ISC-4 e cetuximab inibem sinergicamente KRAS tipo selvagem proliferação de células tumorais
Foram avaliadas a atividade sinérgica de ISC-4 e cetuximab em vários humana linhas celulares de cancro do cólon. Em linha com nossa observação anterior, a atividade sinérgica foi observada apenas no HT 29 e linhas de células RKO, que têm de tipo selvagem
KRAS
genes, e não em HCT116, DLD-1 e outras linhas celulares de cancro do cólon com mutante
KRAS
genes (Fig 3A;. Tabela S3; dados não mostrados). Curiosamente, a interacção sinérgica entre ISC-4 e cetuximab parece ser relativamente à concentração de ISC-4, mas independente da concentração cetuximab dependente da dose. Para avaliar esta actividade combinatória num ambiente clinicamente relevante, foi testada a eficácia sinérgica de ISC-4 e cetuximab em clones RKO com resistência desenvolvida em 5-FU. Porque 5-FU é uma terapia padrão de cuidados para o tratamento de câncer de cólon, terapias que oferecem benefícios em câncer de cólon resistente a 5-FU são necessários na clínica. A actividade sinérgica de ISC-4 e o cetuximab foi mantido apesar adquirida 5-FU-resistência nas células de cancro do cólon testados (Fig. 3B-C). Juntos, estes dados identificar o cancro do cólon resistente a 5-FU com o tipo selvagem
KRAS
genes como um ambiente clínico adequado que podem beneficiar de ISC-4 e terapia combinatória cetuximab.
(A) Os ensaios de viabilidade celular de linhas celulares de cancro do cólon humanos tratados com ISC-4 e cetuximab em doses indicadas, durante 72 horas (n = 3). (B) ensaio de viabilidade celular de tipo selvagem e células RKO-resistentes a 5-FU tratada com 5-FU, conforme indicado, durante 24 horas (n = 3). (C) As células RKO-resistentes a 5-FU tratados com ISC-4 (2 ^ M) e cetuximab (1 ug /ml) durante 24 horas (n = 3).
Determinou-se a cinética de a eficácia sinérgica observada e encontrou essa actividade tão cedo quanto 8 horas após o tratamento, com uma maior sinergia a 12 horas (Fig. 4A). Esta observação sugere que a actividade sinérgica de ISC-4 e cetuximab é, talvez, em vez de citotóxico citostático. As alterações na morfologia celular, bem como marcação fluorescente de ADN, das células cancerosas tratadas revelou que o tratamento ISC-4 e a combinação cetuximab causa aparente a fragmentação de ADN (Fig 4B;. A Fig. S1A). Outras análises revelaram que a combinação de ISC-4 e cetuximab cooperativamente e aumentar significativamente o conteúdo sub-G1 em comparação com os mono-agentes, mas o teor de sub-G1 combinatória não foi suficiente para explicar completamente a sinergia observada (Fig. 4C). -ISC-4 induzida conteúdo sub-G1 foi significativamente inibida por co-incubação com o inibidor da pan-caspase zVAD-fmk, indicando que a combinação induz apoptose dependente da caspase-. Em apoio a esta observação, a combinação de ISC-4 e cetuximab induzidos sinergicamente a activação de caspase-3 (Fig. 4D).
(A) os ensaios de viabilidade celular de células RKO tratados com ISC-4 (2 ^ M ) e cetuximab (1 ug /mL) isoladamente ou em combinação para o período de tempo indicado (n = 3). (B) coloração DAPI de células RKO tratados como em (A) durante 12 horas. As setas brancas indicam células com ADN fragmentado. (C) o conteúdo Sub-G1 de células RKO tratados com ISC-4 (2 ^ M) e cetuximab (1 ug /mL) isoladamente ou em combinação, durante 12 horas (n = 3). *
P Art 0,05 em comparação com todos os grupos de tratamento por bicaudal
t
teste de Student. (D) Ensaio de Caspase-Glo de células RKO tratados com ISC-4 (2 uM) em combinação com cetuximab (0, 0,25, 0,5, ou 1 ug /mL) às 24 horas pós-tratamento. O painel inferior mostra a quantificação do ISC-4 (2 uM) e cetuximab (1 ug /mL) (n = 3).
análise de Western blot revelou que o ISC-4 em combinação com cetuximab cooperativamente reduz fosfo níveis -Akt, mas não fosfo-ERK, a um nível muito modesto em 24 horas após o tratamento (Fig. 5A). No entanto, uma análise de curso de tempo revelaram que a combinação cooperativamente ablated níveis phosho-Akt como logo que 4 horas após o tratamento (Fig. 5b). linhas celulares de cancro de cólon humano que exibiram uma resposta sinergística a ISC-4 e cetuximab também responderam com uma diminuição significativa na fosfo-Akt (Fig. 5C). No entanto, as linhas celulares de cancro do cólon humano abrigando KRAS mutantes que não responderam de forma sinérgica para a terapia de combinação também não exibiram quaisquer mudanças nos níveis de fosfo-Akt em resposta ao tratamento. Assim, os níveis de fosfo-Akt parecem estar correlacionados com a resposta anti-tumoral para ISC-4 e cetuximab. Nenhum efeito sobre Ki-67 ou clivagem LC3B, um marcador de autofagia, foi observado com a combinação (Fig. S1B-D). Estas observações indicam que pentear ISC-4 com cetuximab leva a uma diminuição cooperativa em fosfo-Akt e a viabilidade das células, que são acompanhadas por um aumento da apoptose.
(A) análise de transferência de Western de células RKO tratados com ISC-4 (2 uM) e cetuximab (1 ug /mL) isoladamente ou em combinação, durante 24 horas. Densitometria de níveis de fosfo-Akt são mostrados acima da blot, conforme normalizado para Ran como em relação à área não tratada. (B) Análise de transferência de Western de células RKO tratados com ISC-4 (2 ^ M) e cetuximab (1 ug /mL) isoladamente ou em combinação para os períodos de tempo indicados. Ran é mostrado como um controlo de carga. (C) análise Western blot de linhas celulares de cancro de cólon humano indicadas a seguir ao tratamento com a combinação (Rx) de ISC-4 (2 ^ M) e cetuximab (1 ug /ml) durante 8 horas. *
P
. 0,05 em relação ao controle
ISC-4 e cetuximab exercem efeitos anti-tumorais sinérgicos sem toxicidade
in vivo
a fim de imitar o seu ambiente clínico provável e utilidade, testou-se a eficácia anti-tumor de ISC-4 em combinação com cetuximab em xenoenxertos subcutâneos avançados-resistente a 5-FU RKO. Nesta configuração, verificou-se que a terapia de combinação tem um efeito sinérgico inicial na progressão do tumor e causou estase do tumor para a primeira semana de tratamento (Fig. 6A). análise de tecido revelou que xenotransplantes que receberam a terapia combinada tiveram níveis maiores de necrose por histologia e apoptose por coloração TUNEL do que xenotransplantes recebendo isoladamente agente (Fig 6B;. A Fig. S2A). O regime de dosagem terapêutica utilizada nestes estudos foi bem tolerada e não altera o peso corporal do rato ou alteração na histologia do fígado (Fig. S2B-C).
(a) Os tamanhos relativos dos tumores de RKO resistentes a 5-FU xenoenxertos em 4 dias após o tratamento com uma dose única de ISC-4 (3 mg /kg, ip), cetuximab (10 mg /kg, iv), ou a combinação (n≥5). tumores individuais foram normalizados com o seu tamanho medido de linha de base no dia 0. * P 0,05 comparado com todos os grupos tratados, utilizando-atados dois de Student
t
teste. (B) hematoxilina e eosina (H E) e coloração TUNEL de tumores de xenoenxerto colhidas 24 horas após o tratamento. (C) ratos nus fêmeas atímicos abrigando estabelecida HT-29 tumores de xenoenxerto foram tratados com ISC-4 (3 mg /kg, iv), cetuximab (10 mg /kg, iv), a combinação, ou cetuximab, e 5-FU (25 mg /kg, iv) uma vez por semana, com início no dia 0 (n≥8). As barras de erro indicam SEM de réplicas. *
P
0,05 comparado com o controlo
próxima explorou a combinação de ISC-4 e cetuximab em xenoenxertos de HT-29 em camundongos, em comparação com monoagents e a combinação de. cetuximab e 5-FU. Descobrimos que ISC-4 e cetuximab reduziu fortemente a progressão do tumor, ao contrário dos monoagents, quando administrada em doses intravenosas semanais que foi grosseiramente aparentes em volume do tumor e medições de peso do tumor (Fig 6C;. A Fig. S2D). Além disso, a combinação exibiram uma actividade antitumoral superior em comparação com a combinação de 5-FU e cetuximab sob estas condições experimentais. Esta combinação foi novamente bem tolerada (Fig. S2E) e, além disso, a análise química do soro não revelaram alterações significativas nos eletrólitos, função hepática, ou outros marcadores moleculares relacionados à doença renal ou toxicidade cardíaca com a administração crónica (Tabela S4). Cumulativamente, estes dados de eficácia e segurança indicam que a atividade combinatória de cetuximab e ISC-4 devem ser avaliados em ensaios clínicos futuros com câncer de cólon 5-FU-refratário abrigar do tipo selvagem
KRAS
genes.
Discussão
ISC-4 é um inibidor da Akt promissor que demonstrou actividade anti-tumoral em vários estudos pré-clínicos [3], [4], [5]. A sinergia observada entre ISC-4 e cetuximab como uma terapia de combinação permite ISC-4 para exercer citotoxicidade em baixas doses micromolares contra células de cancro do cólon humano, o que pode ser uma dose mais viável
In vivo
. A combinação parece induzir um aumento dos níveis de apoptose tanto
In vitro
e
In vivo
, embora outros mecanismos anti-tumorais podem contribuir para a sinergia. Esta observação está de acordo com a verificação anterior de que perifosine, um inibidor de PI3K /Akt, sinergia com agentes que inibem a EGFR, tal como cetuximab [12]. Estudos futuros devem comparar ISC-4 apenas com perifosine e em combinação com cetuximab para determinar sua potência relativa e potencial como novos tratamentos para o cancro humano.
Estudos futuros devem examinar os mecanismos subjacentes da sinergia entre os dois agentes. Especial atenção deve ser dada para o efeito combinatório em fosfo-Akt, que serve como marcador de resposta terapêutica à combinação e pode ser utilizado em ensaios clínicos futuros. Curiosamente, foi observada a sinergia entre estes dois agentes em células HT29 e RKO, que possuem genes BRAF e PIK3CA mutantes que devem ter impacto positivo sobre a actividade de Akt. Combinatória
foi observada in vitro
atividade para a ISC-4 com vários outros agentes direcionados aprovados e quimioterapias, embora não sinérgico, e merece uma investigação mais aprofundada. A atividade da ISC-4 contra o linfoma deve ser mais explorado dado o
in vitro
atividade relativamente potente para o agente único ISC-4 que observamos contra linhas de células do linfoma. A atividade independente de p53 da ISC-4 e a conservação da sinergia com cetuximab na doença 5-FU-refratário bode bem para a utilidade clínica do ISC-4. Vários quimioterapias, incluindo 5-FU, têm efeitos citotóxicos de p53 dependente de célula tumoral, e, portanto, a doença resistente a quimioterapia geralmente surge durante a progressão da doença devido à inactivação frequente do gene supressor tumoral p53 [13].
Além do estase do tumor induzida pela ISC-4 e cetuximab terapia de combinação em tumores resistentes a 5-FU, deve notar-se que o regime de dosagem terapêutica foi muito bem tolerado. Este é um bom augúrio para a sua utilização em pacientes com doença avançada, muitos dos quais são incapazes de tolerar os tratamentos agressivos. A actividade terapêutica em resistentes a 5-FU do cancro do cólon avançado é promissora e pode beneficiar da adição de outras terapias comumente utilizados no contexto da gestão do cancro do cólon, tais como oxaliplatina. Cetuximab foi mostrado para restaurar a sensibilidade de oxaliplatina em células cancerígenas do cólon refractários e pode representar uma oportunidade terapêutica promissora [14]. Os dados clínicos também suportam a associação de cetuximab com irinotecano na doença irinotecan refratário [15].
Dada a eficácia demonstrada e segurança desta associação, a investigação clínica de ISC-4 em combinação com cetuximab se justifica em pacientes com do tipo selvagem
KRAS
genes, como é necessário para a terapêutica com cetuximab padrão [11]. Evidências recentes sugerem que uma biópsia deve ser feita imediatamente antes do início do tratamento para assegurar KRAS é de tipo selvagem como os pacientes com cancro do cólon pode evoluir mutações KRAS durante o tratamento com cetuximab que faz com que a resistência [16]. Além disso, a implementação de fosfo-Akt como um biomarcador da resposta pode revelar-se útil no ensaio futuro através de biópsias de tumores ou análise de células tumorais circulantes [17], [18]. Este estudo pré-clínico argumenta que a combinação pode oferecer um benefício terapêutico seguro em face da resistência 5-FU para pacientes com câncer de cólon que precisam de mais opções de tratamento.
Informações de Apoio
Figura S1. O
ISC-4 e terapia de combinação cetuximab não diminuir Ki-67 ou induzir a autofagia. (A) A microscopia de contraste de fase de células RKO tratados com ISC-4 (2 ^ M) e cetuximab (1 ug /ml) sozinha ou em combinação, durante 12 horas. (B) (B) e citometria de fluxo (C) análise ocidental bot de Ki-67 em células RKO tratados com ISC-4 (2 ^ M) e cetuximab (1 ug /mL) isoladamente ou em combinação, tal como determinado por. (D) Análise de transferência de Western de células RKO tratados com ISC-4 (2 ^ M) e cetuximab (1 ug /mL) isoladamente ou em combinação, durante 24 horas. A cloroquina (C; 10? M) é incluído como um controlo positivo para autofagia. actina Beta é mostrado como um controlo de carga
doi:. 10.1371 /journal.pone.0059380.s001
(TIF)
Figura S2.
ISC-4 e combinação de cetuximab terapia é segura e exerce uma actividade antitumoral cooperativa. (A) Quantificação da coloração TUNEL em xenoenxertos de tumores descrito na Figura 6B (n = 10). (B) alteração no peso corporal de ratinhos que receberam ISC-4 (3 mg /kg, i.p.), cetuximab (10 mg /kg, i.v.), ou a combinação (n≥5) duas vezes por semana durante 2 semanas. Alterações do peso corporal são expressos em relação ao peso do corpo de cada ratinho individual antes do tratamento no dia 0 (n≥3). (C) H E de coloração de tecido de fígado recolhidas a partir de ratos às 24 horas pós-tratamento com ISC-4 (3 mg /kg, i.p.), cetuximab (10 mg /kg, i.v.), ou a combinação. (D) o volume do tumor e peso do tumor Terminal para HT-29 xenoenxerto descrito na Figura 6C. coortes de tratamento incluíram ISC-4 (3 mg /kg, iv), cetuximab (10 mg /kg, iv), a combinação, ou cetuximab, e 5-FU (25 mg /kg, iv) uma vez por semana (n≥8) . peso corporal (E) do rato no ponto final, que foi três dias após a última dose (n≥8). As barras de erro indicam SEM de repetições
doi:. 10.1371 /journal.pone.0059380.s002
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Tabela S1.
Doses seleccionadas para agentes antitumorais aprovados em combinação com ISC-4. CE
12,5, CE
25, e CE
50 foram estimados os valores a partir da literatura e as doses foram utilizados em experiências descritas na Fig. 2.
doi: 10.1371 /journal.pone.0059380.s003
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Tabela S2.
Resumo dos efeitos combinatórias de TIC10 com agentes antitumorais aprovados. actividade combinatória foram comparadas às actividades monoagent por ensaios de viabilidade celular e determinada como sendo não cooperante (-) (?), cooperativa (+), sinérgico (*), ou ambígua. Combinações exibiram actividade de cooperação em pelo menos uma linha de células são realçados em amarelo enquanto o destaque verde indica sinergia
doi:. 10.1371 /journal.pone.0059380.s004
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Tabela S3.
índices de combinação para o cetuximab ISC-4 e no KRAS tipo selvagem linhas celulares de cancro do cólon humano. atividade combinatória na RKO e HT-29 linhas celulares quantificado na Figura 3A foi avaliada pelo método de Chou-Talalay
doi:. 10.1371 /journal.pone.0059380.s005
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Tabela S4.
perfis química do soro de ratinhos que receberam a terapia ISC-4 e combinação de cetuximab. Atímicos, ratinhos nus de 8 semanas de idade do sexo feminino receberam ISC-4 (3 mg /kg, i.p.), cetuximab (10 mg /kg, i.v.), ou a combinação (n≥5) duas vezes por semana durante 2 semanas. O soro foi colhido 2 dias após a última dose
doi:. 10.1371 /journal.pone.0059380.s006
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Reconhecimentos
W.S. El-Deiry é um professor da pesquisa da American Cancer Society.