Abstract

xenotransplante endobrônquica Ultrasound-Guided derivados do Paciente (PDX) modelos gerados a partir de espécimes cirúrgicos estão ganhando popularidade como modelos pré-clínicos de câncer. No entanto, o estabelecimento de linhas de PDX por câncer de pulmão de pequenas células doentes (SCLC) é difícil devido à quantidade muito limitada de material de biópsia disponíveis. Pedimos se as células SCLC obtidos a partir endobrônquica aspiração com agulha transbrônquica guiada por ultra-som (EBUS-TBNA) poderia gerar linhas PDX que mantiveram as características fenotípicas e genéticas do tumor primário. Seguindo bem sucedida amostragem EBUS-TBNA para fins de diagnóstico, obteve-se uma amostra adicional para análise citológica e implantação nos flancos de ratinhos imunodeficientes. Os animais foram monitorizados para o enxerto de até 6 meses. Histopatológicos e análise imuno-histoquímica, e direcionadas a próxima geração de re-seqüenciamento, foram então realizadas tanto na amostra primária ea linha PDX derivado. Um total de 12 pacientes foram incluídos no estudo. aspirados EBUS-TBNA originou um grande número de células tumorais viáveis ​​suficientes para injectar entre 18.750 e 1,487,000 células por flanco, e para se obter quantidades de micrograma de ADN de alta qualidade. Destes, amostras de 10 pacientes gerado xenoenxertos (taxa de enxertamento 83%) com uma latência média de 104 dias (intervalo 63-188). Todos, exceto um manteve um fenótipo típico SCLC que combinava perto a amostra original. Mutações idênticas que são característicos de SCLC foram identificados tanto na amostra de partida e a linha de xenoenxerto. EBUS-TBNA tem o potencial de ser uma ferramenta poderosa no desenvolvimento de novas estratégias de segmentação para doentes com CPPC, fornecendo um grande número de células tumorais viáveis ​​adequados tanto para xeno e análise genômica complexo

Citation:. Leong TL, Marini KD, Rossello FJ, Jayasekara SN, Russell PA, Prodanovic Z, et al. (2014) Genomic Caracterização de pequenas células do cancro do pulmão xenoenxertos Paciente-Derived gerada a partir endobrônquica Ultrasound-Guided transbrônquicas aspirativa por agulha espécimes. PLoS ONE 9 (9): e106862. doi: 10.1371 /journal.pone.0106862

editor: Prasad S. Adusumilli, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 10 de junho de 2014; Aceito: 02 de agosto de 2014; Publicação: 05 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Leong et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados e metadados estão disponíveis no NIH Curto Lê Arquivo, (www.ncbi.nlm.nih.gov/sra), número de acesso SRP044662

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Agência Cancer Victorian (www .victoriancanceragency.org.au), o Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa médica da Austrália (www.nhmrc.gov.au) e do Programa de Apoio Infra-estrutura Operacional Governo de Victoria (www.business.vic.gov.au/grants-and-assistance/programs/medical-research-operational-infrastructure-program). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) é responsável por aproximadamente 15% de todas as malignidades torácicas [1]. Os pacientes com doença confinados ao peito são tratados com quimio-radioterapia, enquanto que os doentes com doença avançada são tratados com quimioterapia [2]. Em doença avançada, a quimioterapia baseada em platina dupleto induz respostas completas em até 20%, ao passo que combinada quimio-radioterapia em doença limitada ao peito produz respostas completas em até 50% dos pacientes [3]. No entanto, as recorrências letais dentro de 12 meses ocorrem em quase todos os casos. Além disso, os ensaios de vários agentes citotóxicos, a intensificação da dose, ou novas terapias direcionadas não conseguiram melhorar os resultados ao longo das últimas três décadas [3].

modelos pré-clínicos precisos e amostras de tecidos de alta qualidade são essenciais para o desenvolvimento de novas terapias contra o câncer. Desde a ressecção cirúrgica de SCLC é incomum, diagnóstico e biomarcadores estudos dependem fortemente de amostras obtidas por percutânea aspirativa por agulha fina ou fórceps broncoscópicas biópsia [1]. Ambas as técnicas fornecer material muito pouco para os pesquisadores, levando a uma forte dependência de linhas celulares convencionais que podem não refletir com precisão a heterogeneidade biológica e genómica complexa da doença humana [4]. Mais recentemente, os modelos PDX ganharam popularidade entre os pesquisadores de câncer. Aqui, o tecido obtido a partir de espécimens cirúrgicos frescas podem ser implantadas em ratinhos imunodeficientes e mantidas como uma fonte ilimitada de material tumoral, que se assemelha ao tumor primário [4] – [7]. Além disso, os ensaios “co-clínica” são agora possíveis, onde o paciente e rato receber a mesma terapia [8]. No entanto, a limitada disponibilidade de tecido SCLC de alta qualidade faz com que uma tal abordagem extremamente desafiador [4].

EBUS-TBNA é um novo desenvolvimento na broncoscopia diagnóstica que permite a amostragem aspiração altamente precisos de tumores e gânglios linfáticos adjacentes ao as vias aéreas que não são visíveis pela broncoscopia convencional [9]. Desde SCLC é comumente associada com linfadenopatia mediastinal [1], EBUS-TBNA é uma maneira ideal de obter material para diagnóstico e estadiamento. Portanto, foi testada a viabilidade do uso de células vivas obtidas a partir de EBUS-TBNA amostragem para gerar linhas de PDX de doentes com CPPC.

Materiais e Métodos

Ética

Experimentação humana foi realizada com o consentimento informado, por escrito, de acordo com as políticas do Nacional de Saúde e Pesquisa médica do Conselho da Austrália, Monash saúde, Saúde Melbourne e da Declaração de Helsinki. Os protocolos clínicos e de pesquisa foram aprovados pelo Comitê de Ética um australiano Multisite Pesquisa com Seres Humanos (Protocolo # HREC /12 /SHA /8). A experimentação animal foi aprovado pelo Comité de Monash University animal Ética (Protocolo # 09072A), e foi realizada de acordo com o National Health and Medical Research Council of Australia e National Research Council. o sacrifício dos ratos foi realizada com anestesia dióxido de carbono inalado em conformidade com as diretrizes institucionais e nacionais.

Pacientes e desenho do estudo

Os pacientes com suspeita de câncer de pulmão submetidos a EBUS-TBNA como parte do atendimento clínico de rotina deu consentimento informado por uma biópsia extra a ser feita para fins de pesquisa. Aqueles que foram encontrados para ter SCLC foram então incluídos para a análise apresentada abaixo.

EBUS-TBNA

Todos os procedimentos foram realizados como procedimentos ambulatoriais como descrito anteriormente [10], de acordo com a British diretrizes da Sociedade torácica [11], sob sedação consciente juntamente com anestesia tópica das vias aéreas utilizando lidocaína 2%. Todos os procedimentos foram realizados utilizando um broncoscópio dedicado matriz linear (BF-UC180F-OL8, Olympus, Tóquio, Japão). imagens de ultra-som foram processados ​​por um scanner de ultra-som modo Doppler dedicado (EU-ME1, Olympus, Tóquio, Japão).

O primeiro espécime foi obtido de acordo com protocolos clínicos padronizados. As iniciais 3 gotas do aspirado foi recuperado numa lâmina carregada positivamente, seco ao ar, e, em seguida, fixo ao mesmo tempo e coradas utilizando o protocolo Diff-Quik e avaliada no local por um citopatologista. O restante da amostra foi então colocada numa solução estéril e transportadas para o laboratório de patologia de diagnóstico onde é centrifugado, fixados em formalina, embebidos em parafina e seccionados para histopatologia de rotina e análise imuno-histoquímica. Uma vez que o diagnóstico no local foi confirmada, um segundo espécime foi então levado para fins de pesquisa.

Processamento de pesquisas EBUS-TBNA espécime

Todo o espécime pesquisa foi recuperado em um estéril 1,5 ml Eppendorf tubo, colocados em gelo molhado, e, em seguida, imediatamente transportadas para o laboratório. Arrefecido com gelo, fosfato estéril tamponado salino (PBS) foi adicionado às amostras a fim de fazer um volume total de 500 ul, e, em seguida, centrifugada a 1000 g durante 5 segundos. A amostra foi, em seguida, misturou-se suavemente com uma pipeta de 1 ml e colocadas em gelo. A amostra é, em seguida, divididos da seguinte forma: (i) 200 ul foi transferida para um criotubo Nunc e armazenado a -80 ° C para subsequente purificação de ADN; (Ii) 50 ul foi manchada sobre uma lâmina carregada positivamente, seco ao ar e, em seguida, coradas utilizando o protocolo Diff Quik para determinar a pureza de células de tumor; (Iii) 50 ul foi transferida para um novo tubo Eppendorf, e triturou-se vigorosamente com uma pipeta de 200 uL de desagregar mecanicamente as células, seguido por contagem utilizando um hemocitómetro para determinar o número total de células; (Iv) a 200 ul remanescente foi utilizado para gerar a PDX. O número total de células de tumor injectadas foi estimada através da determinação das células tumorais número visto nas lâminas Diff-Quick coradas como percentagem de todas as células nucleadas através da média das contagens de campos aleatórios de 10 a 40X.

Geração de linhas PDX

a amostra EBUS-TBNA foi misturado com um volume igual de gelo frio de Matrigel (BD Biosciences), colocado numa seringa de 1 ml estéril tapado com uma agulha G 26, e imediatamente transportados para a instalação para animais. Sob condições assépticas, a suspensão de células foi injectada subcutaneamente no flanco direito de um rato NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SZJ). Estes animais imunodeficientes profundamente são derivadas da estirpe NOD /SCID com a adição de um homozigoto A interleucina-2 knockout da cadeia gama do receptor, e são maximamente eficaz no estabelecimento de tumores de xenoenxerto de um pequeno número de células dadoras [12]. Uma vez que o enxerto primário foi atingida, PDX linhas foram então passados ​​em ratinhos nus como descrito anteriormente [4].

A imuno-histoquímica

A coloração foi realizada em 5 uM fixadas com formalina, parafina secções embebidas como descrito [13 ], utilizando o Kit Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories; PK-6101) eo rato no rato do Kit Básico (Vector Laboratories; BMK-2202). Os anticorpos e as diluições foram como se segue: anticorpo policlonal de coelho anti-MACN (CD56) um marcador neural e neuroendócrino, (H-300) (Santa Cruz Biotechnology; SC-10735), 1:200; monoclonal de coelho anti-TTF1 (EP1584Y, Novus Biologicals; NB100-8006), 1:400; monoclonal de ratinho anti-sinaptofisina (Ventana Clone SP11, pré-diluída).

Targeted re-sequenciação

Encaixar EBUS congelado e as amostras foram PDX utilizada para gerar o ADN purificado utilizando o kit Qiagen DNeasy (# 69504), com a opção de tratamento de ARNase a de Qiagen (# 19101) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA foi ensaiado e qualidade controlada utilizando o Fluorímetro Qubit 2.0 (Invitrogen # Q32866) de acordo com as instruções do fabricante.

Targeted re-sequenciação foi realizada utilizando o Ion AmpliSeq abrangente V2 painel cancro (Life Technologies # 4477685), que tem como alvo os exões de genes supressores tumorais 409 e oncogenes. a construção da biblioteca foi realizada usando o kit de biblioteca de iões AmpliSeq 2,0 (Life Technologies, # 4478379) e modelos de biblioteca foram preparadas e com código de barras para sequenciação utilizando o sistema OneTouch Ion conforme as instruções do fabricante. Quatro amostras com código de barras foram multiplexados por Ion PI Chip (Life Technologies) e sequenciados na Proton Sequencer Sistema Ion (Life Technologies). Sequenciamento leituras foram processadas utilizando Ion Torrent conjunto de software v 4.0.2 (Life Technologies). amostras de-multiplexados foram avaliados para a qualidade de sequenciação e sequenciamento de alta qualidade lê foram mapeados para o completo genoma humano hg19 (versão UCSC, fevereiro de 2009). Variante descoberta foi realizada utilizando Torrent variante chamador v 4.0 (Life Technologies), uma ficha do software no software para o Ion Torrent Suite. variantes de amostra identificados foram reunidos e comparados usando VcfTools [14] e SnpSift [15]. anotação funcional variante foi realizada utilizando SnpEff [15], e com SnpSift dbNSFP [16], uma base de dados para anotação funcional de variantes não sinónimas. Todos os dados e metadados estão disponíveis no NIH Curto Lê Arquivo, (www.ncbi.nlm.nih.gov/sra), número de acesso SRP044662.

Resultados

pacientes e amostras características

um total de 12 pacientes com diagnóstico confirmado de SCLC foram inseridos no estudo, e estão resumidos na tabela 1. as amostras de EBUS foram tomadas a partir de estações nodais definidos, ou de grandes massas no paratraqueal, hilar ou regiões do mediastino. Todas as amostras foram avaliadas de acordo com critérios citopatológicos de rotina como sendo consistente com um diagnóstico de SCLC. Quando disponíveis, blocos de células foram seccionados e H E seções manchadas confirmou o diagnóstico. coloração imuno-histoquímica de secções de blocos celulares foi realizada para sinaptofisina, CD56 e Thyroid Fator de Transcrição 1 (TTF1) em 8, 2 e 1 casos respectivamente.

Geração de PDX linhas

células tumorais recuperou-se na amostra de investigação em 12 casos consecutivos, e foram analisados ​​e foram implantadas no flanco de ratinhos NSG, como descrito acima. O número de células tumorais injectadas variou de entre 18,750 e 1,487,000 células por flanco. extracção de ADN foi então realizada retrospectivamente sobre as 10 amostras que xenoenxertos gerado com êxito utilizando alíquotas congelados do mesmo número de células que foram utilizadas para estabelecer a PDX. Isto rendeu entre 0.31μg e 11,12 g de alta qualidade DNA genómico adequada para análise de próxima geração seqüenciamento.

primeira passagem tumores PDX apareceu entre 63 e 188 dias após a implantação (média de 104 dias). Seguindo o enxerto e crescimento a um tamanho de 800 mm

3, o mouse destinatário primeira passagem foi sacrificado, o tumor dissecada da pele associada e músculo, e uma necropsia formal de ratos realizadas. Sem lesões metastáticas foram identificadas em qualquer um dos animais. amostras de tumor fresco (4-5 mm

3) foram tomadas e congeladas rapidamente para extração de DNA posterior, e uma outra amostra foi fixado em formalina e seccionados para análise histopatológica e imuno-histoquímica. O tumor remanescente foi, então, mecanicamente desagregada e 1 × 10

6 células re-implantado nos flancos de ratinhos atímicos nus 5 novos beneficiários. Uma vez que estes tumores atingiram um tamanho de 800 mm

3, o tumor foi amostrado de modo idêntico, e 1 × 10

6 alíquotas foram então criopreservadas.

Dos 10 enxertos bem sucedidos, 9 retidos um fenótipo típico SCLC, bem como a expressão de marcadores imuno-histoquímicos típicos de um tumor neuroendócrino maligna em passagem 1 e 2. imagens representativas de todo o conjunto de amostras são apresentados nas Figuras 1 e 2, e um exemplo detalhado é mostrado na Figura 3. uma PDX linha, LX109, exibiu características consistentes com um tumor neuroendócrino de grandes células, incluindo núcleos maiores, com nucléolo distinto, citoplasma eosinofílico proeminente, e coloração irregular para CD56 (Figura S1). Com limitado material de diagnóstico disponíveis para rever, somos incapazes de determinar se este representar conseqüência de uma subpopulação de células tumorais de células grandes do espécime experimentais. Um resumo destes dados é mostrada na Tabela 2.

Barra de escala = 30 um. H E = haemotoxylin e eosina. quadrados em branco indicam que a amostra não estava disponível. bar

Escala = 30 mm. quadrados em branco indicam que a amostra não estava disponível.

A. esfregaço de citologia Diff-Quick manchado de amostra EBUS-TBNA diagnóstico. Barra de escala = 15 mm. B. Diff-Quick manchado esfregaço de citologia da amostra experimental EBUS-TBNA. Barra de escala = 15 mm. C. hematoxilina e eosina, do bloco de células de diagnóstico. Barra de escala = 30 mm. bloco de celas D. Diagnóstico coradas para CD56. Barra de escala = 30 mm. E. hematoxilina e eosina, do xenoenxerto derivado. Barra de escala = 300 pm. F. hematoxilina e eosina, do xenoenxerto derivado. Barra de escala = 30 mm. G. Secção do xenoenxerto derivado coradas para CD56. Barra de escala = 30 mm. H. Seção do xenoenxerto derivado coradas para TTF1. Barra de escala = 30 mm.

alvejado re-sequenciação

A fim de determinar os efeitos do enxerto e passagem sobre a integridade genômica dos nossos modelos PDX, empregamos um alvo, a estratégia de sequenciamento de última geração para identificar mutações ex�icas na amostra EBUS primária e seu derivado passagem-2 xenotransplante. DNA genômico de ambas as amostras foram analisadas usando o Ampliseq Painel Ion Comprehensive Cancer sequenciados na plataforma Ion Torrent (Life Technologies). Este sistema amplifica e sequências os exons de codificação de 409 genes em que foram identificadas mutações driver.

O número de sequenciamento mapeados lê variou de 16 a 26 milhões, a maioria deles no alvo (mais de 97% em todas as amostras ), com uma profundidade mínima sequência de cobertura em regiões-alvo de 1000 vezes (Tabela S1). Alta uniformidade de cobertura foi observada para todas as amostras, variando de 85 a 92% (Tabela S1). O número total de variantes detectadas para cada amostra primária é mostrado na Tabela 3, juntamente com o número total de variantes de codificação da região. O número de variantes de codificação da região em cada amostra partilhada com cada xenoenxerto correspondente variou 55-92% (média 81,4%). todo o conjunto de variante chama para cada amostra é incluído como uma planilha do Excel em S1 Arquivo

variantes significativas foram identificados como aqueles previstos para (i) resultam em frameshift, absurdo ou mutações no local emenda essenciais.; ou (ii) variantes missense previsto para prejudicar a função da proteína com um SIFT [17] pontuação ≤0.05. Compartilhados de codificação variantes região foram então filtradas usando os seguintes critérios de exclusão: (i) SNPs germinativas conhecidos (ii) as mutações provavelmente incidentais (https://mutagenetix.utsouthwestern.edu); e (iii) as variantes em genes comumente mutado no cancro que são susceptíveis de ser de nenhum significado funcional [18]. Estas variantes estão listados na Tabela S2. A seguir, classificou os genes afetados de acordo com a sua frequência de mutação no banco de dados COSMIC (https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic) com uma incidência ≥5%. Como mostrado na Figura 4, quando as mutações comuns de driver estavam presentes na amostra de partida, que foram conservadas no xenoenxerto correspondente. As mutações presentes apenas na amostra primária (

IGFR1

,

TET1

,

mTOR) e somente no xenotransplante (

RB1 ​​

,

NTRK1

) foram observados em sete pares de amostras-xenotransplante primárias (Figura 4). Mutações no

KRAS

, mais típico de adenocarcinoma de pulmão, não foram detectados.

Os genes são classificados por% de acordo com a sua prevalência no banco de dados cósmica. Mutações detectadas, tanto na amostra primário eo xenotransplante são mostrados

Discussão

modelos PDX surgiram recentemente como uma forma de mais de modelagem com precisão respostas terapêuticas [5] – [7]. resultado [12], [19] e como fonte de material de alta qualidade para a próxima geração seqüenciamento [20]. Tipicamente, a geração de linhas de cancro do pulmão PDX foi limitada à utilização de material cirurgicamente ressecado como a fonte de células tumorais viáveis ​​[19], [21], [22]. Uma vez que menos de 20% dos pacientes com câncer de pulmão submetido a uma cirurgia, esta abordagem limita o estabelecimento de linhas de PDX a cânceres estágio pulmonar precoce. Além disso, SCLC quase nunca é ressecado cirurgicamente, como enfatizado por estudos recentes inteiras do genoma [23], [24]. Em nossa descrição inicial de três linhas SCLC PDX, nós proveniente de material de biópsias broncoscópicas em casos raros em que as lesões endobrônquicas poderia ser facilmente identificados [4], [20]. Recentemente, Hodgkinson

et al

[25] descreveu a geração bem-sucedida de 4 linhas SCLC PDX de circular células tumorais a partir de 6 pacientes, enfatizando a natureza agressiva destes tumores, bem como o potencial de geração de modelos tratáveis ​​de minimamente invasiva técnicas.

para o nosso conhecimento, esta é a primeira descrição de amostras EBUS-TBNA como uma plataforma para a geração de linhas PDX. Desde SCLC muito mais comumente se apresenta como linfadenopatia intra-torácica ou massa mediastinal, EBUS-TBNA pode potencialmente fornecer amostras engraftable de quase todos os pacientes, assim expandindo dramaticamente o potencial de modelagem pré-clínico desta doença. As deficiências dos modelos PDX, principalmente a falta de um sistema imune do hospedeiro, são bem descritas [5] – [7]. No entanto, o uso cada vez maior destes modelos é impulsionado pela evidência de que linhas PDX mantêm as características principais do tumor primário que estão irreversivelmente perdidos em cultura de tecidos convencional [4] – [7]. Por exemplo, linhas SCLC PDX não respondem à terapia com um único agente com a ABT737 antagonista BCL2 em contraste com os modelos de xenoenxerto de derivados de linhas de células SCLC convencional [26]. Os nossos dados mostram agora que as linhas SCLC PDX derivados de EBUS-TBNA reter as características do tumor primário.

Uma preocupação constante em relação aos modelos de PDX é a sua capacidade para manter o genótipo do tumor primário. Tendo em conta os números relativamente pequenos de células obtidas a partir de amostras EBUS-TBNA, somos incapazes de determinar se o genótipo PDX representa expansão de um subclone mais agressiva com base no modelo heterogeneidade genômico [27], [28]. Embora os nossos dados mostram claramente que as mutações do controlador bem descritos são preservadas nas nossas linhas EBUS-TBNA PDX durante pelo menos 2 passagens, discordância na detecção de várias mutações sugere que o processo de xeno-enxerto pode seleccionar para subclones geneticamente distintas derivadas de amostras primários altamente heterogéneos . Em caso uma vez (LX105), uma mutação no

RB1 ​​

foi observado apenas na linha de PDX, indicando que algumas linhas de xenoenxerto podem ser mais úteis como modelos estar sozinho, em vez de como cópias idênticas do tumor original do paciente.

a quantidade e qualidade de DNA disponíveis a partir da amostra EBUS permite, alta profundidade análise de sequenciação detalhada em contraste as comparações mais limitados que podem ser feitas entre as células tumorais circulantes e linhas derivado PDX [25]. Curiosamente, a amostra que gerou a linha PDX LX109, que cresceu como um tumor LCNEC, faltava mutações comumente visto em SCLC, sugerindo que a análise molecular de amostras EBUS-TBNA pode aumentar a precisão dos critérios patológicos e citológicas convencionais. Desde variantes estruturais em genes tais como

MYC

,

MYCN

e

SOX2

estão bem descritos na SCLC [23], [24], a nossa abordagem para gerar linhas de PDX de espécimes EBUS-TBNA poderia também servir como uma plataforma para interrogatório mais intensiva por meio de análise WGS para determinar os efeitos de xeno em instabilidade cromossómica em SCLC.

Nossos resultados também destacam o potencial de amostras EBUS-TBNA como fonte de DNA de alta qualidade para análise de patologia molecular. Vários grupos têm mostrado a análise retrospectiva de amostras EBUS-TBNA fixo pode ser utilizado para identificar mutações clinicamente viáveis ​​no cancro do pulmão [29] – [33], e que o ADN de alta qualidade, o RNA e a proteína pode ser obtida a partir destas amostras [34] , [35]. Nossos dados estender esses estudos demonstrando que recentemente isoladas amostras EBUS-TBNA pode gerar DNA de alta qualidade adequado para massivamente paralelo re-sequenciação alvejado que evita formalina artefacto, e que pode ser cuidadosamente controlada para artefacto estromal.

demonstraram que em CPPC, EBUS-TBNA é uma técnica prática e minimamente invasiva, que pode gerar ADN de alta qualidade para sequenciação da próxima geração, e pode ser usado como uma fonte de células tumorais viáveis ​​que enxertar em ratos imunodeficientes com uma eficiência extremamente alta. Além disso, estes enxertos mantêm as características importantes do tumor primário, incluindo as mutações que são característicos de SCLC. Estes dados sugerem que EBUS-TBNA é uma técnica através da qual os médicos respiratórias e cirurgiões torácicos pode gerar amostras que podem formar a base para a nova pesquisa pré-clínica e, finalmente, o diagnóstico molecular acionável em SCLC e outros tumores malignos intra-torácica.

Informações de Apoio

Figura S1.

Características do LX109 espécime e sua xenoenxerto derivado. A. Diff-Quick manchado esfregaço citológico da amostra de EBUS-TBNA diagnóstico. Barra de escala = 15 mm. B. Diff-Quick manchado esfregaço de citologia da amostra experimental EBUS-TBNA. Barra de escala = 15 mm. C. hematoxilina e eosina, do bloco de células de diagnóstico. Barra de escala = 30 mm. bloco de celas D. Diagnóstico coradas para CD56. Barra de escala = 30 mm. E. hematoxilina e eosina, do xenoenxerto derivado. Barra de escala = 300 pm. F. hematoxilina e eosina, do xenoenxerto derivado. Barra de escala = 30 mm. G. Secção do xenoenxerto derivado coradas para CD56. Barra de escala = 30 mm. H. Seção do xenoenxerto derivado coradas para TTF1. Barra de escala = 30 mm

doi:. 10.1371 /journal.pone.0106862.s001

(TIF)

Tabela S1.

Resumo das estatísticas de mapeamento de experiências NGS

doi:. 10.1371 /journal.pone.0106862.s002

(DOC)

Tabela S2.

variantes funcionalmente significativos compartilhada entre a amostra primária e xenoenxerto

doi:. 10.1371 /journal.pone.0106862.s003

(DOC)

S1 arquivo.

variante não filtrado chama em todas as amostras

doi:. 10.1371 /journal.pone.0106862.s004

(XLS)

Agradecimentos

Os autores agradecem a Pesquisa do Câncer da Austrália Fundação Centro de Câncer medicina genômica para o seu apoio e assistência técnica.