Abstract

Fundo

A angiogénese pode desempenhar um papel na patogênese da Non-Small O cancro do pulmão de células (NSCLC). O CXC (ELR

+) da família das quimiocinas são fortes promotores da resposta angiogênico.

Métodos

A expressão dos membros da família CXC (ELR

+) (

CXCL1-3 /GROa-γ

,

CXCL8 /IL-8

,

CXCR1 /2

) foi examinada em uma série de tumores NSCLC congelados frescos ressecados. Além disso, a regulamentação destas quimiocinas expressão e epigenética foi examinada em epitelial brônquica normal e linhas celulares de NSCLC.

Resultados

No geral, a expressão dos ligantes de quimiocinas (

CXCL1, 2

,

8

) e os seus receptores (

CXCR1 /2

) foram regulados em amostras de tumor em comparação com o normal, com a excepção de

CXCL3

.

CXCL8

e

CXCR1 /2

foram encontrados para ser epigenetically regulada por modificações pós-traducionais de histonas. CXCL8 recombinante não estimulou o crescimento de células em qualquer um epiteliais brônquicas normais ou uma linha celular de carcinoma escamoso (SKMES-1). No entanto, foi observado um aumento em 72 horas após o tratamento em uma linha de células de adenocarcinoma.

Conclusões

CXC (ELR

+) quimiocinas são desregulada em NSCLC. O saldo dessas quimiocinas pode ser crucial no microambiente tumoral e requer elucidação. Ele continua a ser visto se segmentação epigenética destas vias é uma opção terapêutica viável no tratamento do câncer de pulmão

Citation:. Baird AM, cinza SG, O’Byrne KJ (2011) Epigenética subjacentes ao Regulamento do CXC ( ELR

+) quimiocinas em Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 6 (1): e14593. doi: 10.1371 /journal.pone.0014593

editor: Kelvin Yuen Kwong Chan, da Universidade de Hong Kong, China

Recebido: 14 de junho de 2010; Aceito: 02 de janeiro de 2011; Publicação: 27 de janeiro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Baird et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma concessão educacional irrestrita da Pfizer. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. O financiamento para este projeto foi fornecer pela Pfizer sob a forma de um salário para Anne- Marie Baird. Nenhum financiamento foi fornecido para consumíveis. O financiamento concedido foi um grant-in-aid, e como tal, não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A angiogênese é importante no crescimento e propagação do câncer e também influencia alterações inflamatórias que podem predispor à doença [1]. O CXC (ELR

+) quimiocinas induzir angiogénese e pode ser importante em cancros que têm um fenótipo angiogénico tal como NSCLC [2].

A expressão de quimiocina refere-se a uma família de baixo peso molecular (8- 10 kDa) citocinas quimiotáticas. As quimioquinas são citoquinas pequenas que são indutíveis, quimio-atractores de leucócitos. As quimiocinas são classificados pela sua composição de aminoácidos, actividade funcional e propriedades de ligação ao receptor e é composta por quatro famílias sub definidos de acordo com os primeiros dois dos quatro resíduos de cisteína conservados (um): C, (b) CC, (c), CXC e (d) CXXXC [3]. A família quimioquina CXC consiste em dois subtipos, ELR

+ e ELR

-, de acordo com um motivo determinado Glu-Leu-Arg (ELR) que precede o primeiro resíduo de cisteína [3]. CXC (ELR

+) promotores conter uma

cis

elemento que reconhece NF-kB, e, portanto, pode fazer com que o trans-ativação de quimiocinas CXC [4].

O receptor angiogénico putativo para CXCL8 eo outro CXC (ELR

+) quimiocinas é CXCR2 [5]. O bloqueio deste receptor conduz a uma diminuição da angiogénese no cancro pancreático [6], e uma inibição significativa do crescimento do tumor de melanoma humano e metástases pulmonares experimentais em CXCR2 – /- ratos, bem como uma redução da angiogénese [7]. Dentro do ambiente do pulmão, cancro crescimento e potencial metastático é regulada em vários CXCR2 mouse – /- modelos [7], [8]. No entanto, CXCL8 pode ligar-se a CXCR1 e CXCL1 /CXCL8 também se pode ligar DARC, embora a ligação a DARC não transduzir um sinal. Actualmente, os estudos com DARC sugerem que actua por “secagem”-se quimiocinas e, portanto, reduzindo a sua capacidade de sinalização. A sobre-expressão de DARC conduz ao crescimento do tumor aumentada, no entanto, isto foi devido à indução de grandes áreas de necrose no interior do tumor [9], [10].

Os receptores das quimiocinas são supra-regulados em células tumorais, permitindo que o tumor para tirar proveito de ambientes ricos de quimiocina, promover o crescimento do tumor e vasculatura. Além disso, as quimiocinas podem recrutar macrófagos, que detectam o ambiente hipóxico no interior do tumor e subsequentemente segregam factores pró-angiogénicos [11], [12]. Inicialmente quimiocinas foram pensados ​​para desempenhar um papel na atração de leucócitos específicos de um local da lesão; No entanto, foi agora demonstrado que eles estão envolvidos na transformação neoplásica de uma célula, promoção de angiogénese, a expansão clonal de tumores e modificações na matriz extracelular, e em particular metástases específicos mediata de órgãos no cancro [13]. pares receptor ligando específico ditar as metástases padrões de mama e câncer de pulmão [14]. Em metástases de cancro da mama para o pulmão, CXCL1 era parte de um gene assinatura que também incluía VCAM1 e MMP1 [15]. Um estudo recente constatou que derivados de tumor CXCL8 actuou como um atractivo para as células de tumor circulante para retornar para o tumor original, levando a um fenótipo tumoral mais agressivo [16].

Uma variedade de quimiocinas CXC foram detectados em neoplásica tecidos, produtos de células tumorais ou elementos estromais [12]. Por exemplo, tumor de células inflamatórias infiltrantes eleva os níveis de células em CXCL8 broncoalveolar, juntamente com os seus dois receptores [17]. Fortes evidências sugerem que CXC (ELR

+) quimiocinas têm um papel na promoção do câncer, como eles podem promover o crescimento e sobrevivência das células cancerosas [18].

O crescimento e progressão do cancro é dependente de angiogénese e CXCL8 foi demonstrado desempenhar um papel no seu potencial angiogénico e tumorigénico. No cancro de células renais os níveis de CXCL1, CXCL3 e CXCL8 foram elevados em comparação com os controles e no receptor negativo (CXCR2 – /-) ratinhos houve uma redução correspondente no crescimento do tumor [19]. Estudos utilizando modelos de tumores de melanoma apoiar o papel de CXCL1, CXCL2, e CXCL3 na mediação da angiogénese de tumores e os níveis de todos os três quimiocinas são altamente expressa em tumores de melanoma. A transfecção de CXCL1-3 em células não tumorigénicas imortalizadas deu-lhes a capacidade para formar tumores [20], [21]. CXCL8 é um dos membros mais estudados da família CXC (ELR

+), particularmente em câncer de pulmão. CXCL8 foi identificada em uma assinatura a expressão do gene que foi predicativa de mau prognóstico em pacientes com cancro da fase I pulmonar [22], enquanto que os níveis de CXCL8 são aumentados significativamente em ambos os efusões pleural maligno [23] e NSCLC [24], em que os níveis aumentam com a fase [25] e se correlacionam com a sobrevivência do paciente /recaída [26]

as quimiocinas encontrado dentro do microambiente do tumor são pensados ​​para jogar, pelo menos, cinco papéis no desenvolvimento de tumores e doença metastática.; (A) Controlo de leucócitos infiltrado, (b) modificar a resposta imune do tumor, (C) regulam a angiogénese, (d) operam como factores de sobrevivência e de crescimento, e (e) dirigir a circulação de células tumorais si [27]. Os ligandos e receptores CXC (ELR

+) são particularmente importantes na mediação de tumores NSCLC angiogénese associada [28] e metástases de órgãos específicos [13], [14]. ligandos CXCR2 também têm sido implicados na progressão do tumor de NSCLC, através do caracol, níveis elevados de que se correlacionam com a diminuição da sobrevivência [29].

regulação epigenética aberrante da expressão do gene é um evento frequente em NSCLC [30], [31] . Segmentação estes mecanismos de regulação epigenética em NSCLC é uma área ativa de pesquisa farmacêutica. Buscou-se examinar a expressão do CXC (ELR

+) quimiocinas e seus receptores de uma série de amostras de tumores NSCLC primária e um painel adicional de linhas celulares de NSCLC, e para analisar directamente se epigenética desempenha um papel na regulação destes genes nesta doença. Os nossos resultados indicam que a expressão destas quimiocinas e seus receptores são frequentemente desregulado no NSCLC, a ser regulado através directa e directamente pelos mecanismos epigenética (histonas modificações pós-traducionais e ADN CpG metilação, respectivamente) e podem ser alvos bons candidatos para a terapia epigenética no tratamento desse tipo de câncer.

Métodos

as linhas celulares

o A549 (adenocarcinoma), SKMES-1 (carcinoma de células escamosas), H460, H647 e H1299 (grande carcinoma de células) e BEAS-2B (bronchoepithelial normal de transformada) linhas de células foram adquiridas a partir do ATCC (LGC Promochem, Teddington, Reino Unido). linhas celulares HBEC [32] eram um presente de Prof. John D Minna (Hamon Centro de Oncologia Therapeutic Research, UTSoutwestern, Dallas, TX, EUA). Todos os reagentes de cultura celular foram adquiridos a partir de Lonza (Walkersville, MD, EUA). As células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2 no seguinte meio; A549 – F-12 (HAM) suplementado com 10% (v /v) de FBS, estreptomicina penicilina (500 U /mL) e 2 mM de L-glutamina. BEAS-2B também foram mantidas em meio F-12 (HAM), sem a adição de FBS. SKMES-1 – EMEM com a adição de 10% (v /v) de FBS, estreptomicina penicilina (500 U /ml), 2 mM de L-glutamina e aminoácidos 0,1 M não essenciais. Todas as grandes linhas de carcinoma de células foram mantidas em RPMI com FBS a 10% e penicilina estreptomicina (500 U /mL). linhas HBEC foram mantidas em queratinócitos meios isentos de soro (SFM), com L-glutamina (GIBCO Invitrogen, Paisley, Escócia) e suplementado com 2,5 ug factor de crescimento epidérmico humano recombinante (RegF), e 25 ug de bovino extracto de pituitária (GIBCO Invitrogen) .

amostras

tumor primário

Uma série de 37 amostras de tumor (14 adenocarcinoma e 23 de carcinoma de células escamosas) foram retirados de pacientes com NSCLC fase inicial no Hospital de St. James, Dublin. tecido normal combinado foi feita em paralelo para cada paciente e as amostras foram avaliadas por um patologista imediatamente a seguir a dissecção.

Reagentes

Tricostatina A (TSA) foi adquirido de Calbiochem (San Diego, CA, EUA ) e dissolveu-se em DMSO a uma concentração de 250 mg /mL. As culturas de células foram tratadas durante um período de 16 h, a uma concentração final de 250 ng /mL.

O fenilbutirato (PB) (tributirato ™) foi um presente da Triple Crown America, Perkasie, PA, EUA. As culturas de células foram tratadas a uma concentração final de 10 mM durante 16 h.

5-aza-2′-desoxicitidina (DAC) foi adquirido da Merck (Darmstadt, Alemanha) e dissolvido em metanol. As culturas celulares foram tratadas com o DAC (concentração final – 1 uM). durante 48 h com DAC e meios substituído a cada 24 h

CXCL8 humana recombinante foi adquirida a PromoKine (PromoCell GmbH, Heidelberg, Alemanha) e reconstituído em estéril água destilada.

SB 225002 foi adquirido a partir de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, EUA) e dissolveu-se em DMSO a uma concentração de 2,2 uM. As linhas de células foram tratadas durante uma hora antes da adição de CXCL8, a uma concentração de 0,022 uM.

isolamento de ARN total e de amplificação por RT-PCR

O ARN total foi extraído utilizando o TRI reagent® ( Molecular Research Center, Montgomery Road, OH, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Antes da síntese da primeira cadeia de cDNA, 10 ug de ARN total foi pré-tratada por digestão com ADNase RQ1 (Promega, Madison, WI, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O ADNc foi gerado utilizando Superscript III (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EUA) e oligo dT (20) iniciadores (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante.

As linhas de células foram examinados quanto a expressão de

CXCL1-3

,

CXCL8

,

CXCR1 /2

e

Beta-actina

por RT-PCR, utilizando iniciadores e temperaturas de recozimento delineado na Tabela 1. condições dos ciclos de PCR consistia em -95 ° C durante 5 min seguido por 35 ciclos de 1 min a 94 ° C, 1 min à temperatura de recozimento do gene alvo e 1 min a 72 ° C, com uma extensão final a 72 ° C durante 10 min.

as experiências foram realizadas em triplicado e os produtos a electroforese num gel de agarose a 1%. Produto quantificação foi realizada usando TINA 2.09c (Raytest, Isotopenmeßgeräte GmbH, Straubenhardt, Alemanha) de software densitometria. A expressão de ARNm foi normalizada para

controlos

da beta-actina, e foi expressa como uma proporção de expressão de mRNA-alvo:.

Beta-actina

expressão

Cromatina imunoprecipitação (X- ChIP)

Cromatina imunoprecipitação foi realizada como se segue: Após os tratamentos, as células foram fixadas com formaldeído (concentração final 1%), suspenso em tampão de lise de SDS (Millipore, Billerica, MA, EUA) e sonicada até o DNA foi fragmentado em comprimentos de 200-1000 pb entre. Alíquotas desta ADN cortado foram subsequentemente imunoprecipitadas utilizando o OneDay ChIP Kit ™ (Diagenode, Liège, Bélgica) de acordo com as instruções do fabricante. Os anticorpos utilizados para imunoprecipitação foram como se segue: Pan-acetil-histona H3 (Millipore Cat # 06-599), H4 pan histona acetil (Millipore Cat # 06-598), H3 acetil-histona (K9 /14Ac) (Cat # Diagenode pAb -ACHBHS-044), H3 acetil-histona (K9ac) (Cat # Diagenode pab-ACHAHS-044), acetilo fosfo – histona H3 (K9pS10) (Sigma Cat # H0788), di-metil H3 histona (K9Me2) (Sigma Cat # D5567), di histona H3 metil (K4Me2) (Sigma Cat # D5692) e H3 metil-histona (K4Me) (Sigma Cat # M4819). Um controle nenhum anticorpo foi incluído para testar a ligação não especifica.

Os iniciadores utilizados para estudar as regiões promotoras de

CXCL8

e

CXCR1 /2

por Chip foram projetados desde o conhecido UTRs 5 ‘contidas dentro das suas sequências de nucleótidos. condições de ciclo de RT-PCR foram as mesmas que as descritas acima. Primers e temperaturas de recozimento para Chip são apresentados na Tabela 2.

A concentração de CXCL8 foi medido em meios condicionados utilizando um Sistema de Desenvolvimento DuoSet® ELISA (R D systems , Minneapolis, MN, EUA), de acordo com as instruções do fabricante, com uma exceção; a solução de substrato utilizado foi feita em tampão de citrato fosfato (contendo ácido cítrico e dissódico Hidrogeno-ortofosfato de dodeca-hidrato, pH 5,0), 10 mg de 1, dicloridrato de 2-f enilenodiamina (OPD) e 18 uL de 1 MH

2O

2 .

CXCL2 foi quantificada utilizando um kit de desenvolvimento de ELISA comprado de Strathmann Biotec (Hamburgo, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante.

ensaios de proliferação celular

a proliferação celular foi medida utilizando uma proliferação celular ELISA, BrdU (Roche Diagnostics Ltd., Sussex, Reino Unido). Resumidamente, as células foram semeadas a 5 x 10

3 /poço numa placa de 96 poços e aderido durante a noite. Subsequentemente, o meio completo foi removido e as células foram lavadas com 100 ul de PBS. meio destituído de soro (0,5% de FBS) foi adicionado a apenas as células de cancro de pulmão, como esta imita mais de perto as condições fisiológicas. Após incubação durante a noite, as células foram tratadas durante 24, 48 ou 72 h com CXCL8 recombinante humano em várias concentrações (0,1-100 ng /mL). Os estudos de inibição foram realizados por pré-tratamento de células com 0,022 uM SB225002 durante 1 h antes da adição de CXCL8. A absorvância foi medida num leitor de placas a 450 nm com um comprimento de onda de referência ajustado para 690 nm e poços em branco e não tratadas foram usadas para fins de normalização. As células não tratadas foram definidos como 100%, e os tratamentos CXCL8 avaliada em relação a este.

A análise estatística

Os dados são expressos como média ± EPM (erro padrão da média). A análise estatística foi realizada com InStat (software Graphpad, La Jolla, CA, EUA), utilizando um emparelhado um Student cauda

t

-teste. As diferenças foram consideradas significativas quando p 0,05

Resultados

A expressão de

CXCL1-3

,

CXCL8

e

CXCR1 /2

no câncer de pulmão primário amostras tumorais

Para avaliar a expressão de um número de CXC (ELR

+) membros da família em um painel de /tumor combinado amostras normais de pacientes de Fase I e II, os doentes, RT- O PCR foi realizado (Figura 1A), e resumidos na Figura 1B. A análise densitométrica da RT-PCR revelou uma diminuição significativa na expressão de

CXCL1

,

CXCL2

(p 0,01) e o

CXCR1

receptor (p 0,05) em NSCLC amostras tumorais em comparação com o normal (Figura 1C)

a) Níveis de

CXCL1 Restaurant -.

3

,

CXCL8

e

CXCR1 /2

foram analisados ​​por RT-PCR num painel de linhas de NSCLC (adenocarcinoma (n = 14), carcinoma de células escamosas (n = 23)) amostras de doentes. Imagens representativas de amostras de cima e para baixo regulados são mostrados.

os níveis de beta actina

foram utilizados para fins de normalização. B) Um resumo das alterações na expressão dos diversos CXC (ELR

+) quimiocinas e seus receptores de um painel de amostras de tumores NSCLC /normais emparelhadas do paciente. C) densitometria geral análises de amostras de tumores NSCLC /normais emparelhadas do paciente. Os dados são representados graficamente como média ± erro padrão da média (n = 37). (N – Normal, T – Tumor)

A expressão de

CXCL1-3

,

CXCL8

e

CXCR1 /2

em um. painel de linhas celulares de cancro do pulmão normal e

Utilizando RT-PCR, as quimiocinas foram examinados num painel de linhas celulares normais e NSCLC (Figura 2). Todas as linhas de células testadas expressa diferentes níveis de

CXCL1-3

e

CXCL8

, com maior expressão basal observada nas linhas de NSCLC. No entanto, a expressão de ambos os receptores robusta (

CXCR1 /2

) foi detectada nas linhas celulares normais (HBEC3-5).

O painel incluía A549 (adenocarcinoma), SKMES-1 (epidermoide carcinoma de células), linhas de células H460, H647 e H1299 (carcinoma de células grandes), BEAS-2B (SV40 transformadas bronchoepithelial normal) e HBEC (linhas celulares normais epiteliais brônquicas imortalizadas, na ausência de oncoproteínas virais).

Beta actina

está incluído para validar a eficiência de carregamento. (M – marcador de DNA tamanho, ve – controle de RT-PCR negativo).

acetilação de histona está envolvido na regulação da

CXCL8

e

CXCR1 /2

expressão

Usando o inibidor da histona deacetilase (HDACi), Trichostatin a (TSA), uma indução de

CXCL8

e

CXCR1 /2

tanto no normal (HBEC4) e linhas celulares de cancro de pulmão (A549 e SKMES-1), com uma diminuição concomitante na

CXCL1-3

(SKMES-1, p 0,05) foi observado (Figura 3A). A indução de

CXCL8

foi significativa em HBEC4 e SKMES-1 (p 0,05), assim como o aumento da

CXCR1

e

CXCR2

tanto a célula de câncer de pulmão linhas (A549 – p 0,05, SKMES-1 – p 0,01) e

CXCR1

em HBEC4 (p 0,05) (Figura 3B). A reactivação da expressão destes receptores em linhas celulares de NSCLC indica que estes genes são epigeneticamente regulada ao nível de acetilação da histona. Tratamento de linhas celulares com um inibidor da histona desacetilase adicional, fenilbutirato (PB), também resultou numa reactivação de

CXCR1 /2

(dados não mostrados), indicando que os resultados são HDACi específica. Foram seleccionados dois quimiocinas, CXCL2 e CXCL8, para a determinação da expressão da proteína por meio de ELISA. O padrão observado reflectida observada ao nível do ARNm em SKMES-1, com uma diminuição na CXCL2 e um aumento na CXCL8 com o tratamento com TSA (p 0,05) (Figura 3C). No entanto, não houve alteração significativa nos níveis de proteína em qualquer A549 ou HBEC4 entre basal e células tratadas com TSA (dados não mostrados).

A) O efeito do tratamento com TSA (250 ng /mL durante 16 horas) em a expressão de

CXCL1 Restaurant –

3

,

CXCL8

e

CXCR1 /2

. B) análise de densitometria de expressão no tratado versus amostras não tratadas quando normalizado para

beta actina

. Os dados são representados graficamente como média ± erro padrão da média (n = 3). C) O tratamento com TSA também afeta a produção de CXCL2 e CXCL8 a nível de proteínas em células SKMES-1. As quimiocinas foram quantificados em meio condicionado removidas da cultura após a exposição a TSA (250 ng /mL durante 16 horas). Os dados são representados graficamente como média ± erro padrão da média (n = 3). (UT – não tratada, TSA – Trichostatin A).

Regulamento do

CXCL8

e

CXCR1 /2

ocorre através da cromatina direta remodelação

para confirmar que os efeitos observados para HDACi foram devido ao aumento da hiperacetilação histona aos promotores do

CXCL8

e

CXCR1 /2

genes, realizou-se a imunoprecipitação da cromatina (ChIP) análise do indivíduo promotores de células A549 tratadas com TSA. Como pode ser visto na Figura 4, o tratamento com TSA resulta em um aumento na quantidade de produto de PCR para

CXCL8

e

CXCR1 /2

indicando hiperacetila�o reforçada em torno da histona, os promotores para estes genes. Mostramos que a lisina e lisina 14 9 são hyperacetylated nesta região após o tratamento com TSA. Esta experiência demonstra claramente que a remodelação da cromatina está diretamente envolvido com a ativação de

CXCL8

(Figura 4A), gene

CXCR1

(Figura 4B) e

CXCR2

(Figura 4C) expressão. Além disso, observamos também um aumento na histona H3 lisina 4 tri-metilação (H3K4me3) no

promotor CXCR1

(dados não apresentados) e a fosforilação de serina 10 (H3K9pS10) no

CXCL8

promotor. Um aumento na diemethylation H3K4 (H3K4Me2) foi detectado com uma redução simultânea da dimetilação H3K9 (H3K9Me2) na região promotora. Estas alterações têm sido associadas com a activação de transcrição de genes e de resposta precoce, respectivamente, e adicionar uma resistência adicional à evidência de que estes genes são regulados dinamicamente pelo histonas modificações pos-translacional.

O ensaio ChIP demonstra que o tratamento com TSA resulta em um aumento na acetilação de histonas H3 e H4. As células A549 foram cultivadas na presença ou ausência de TSA (250 ng /mL) durante um período de 16 h. Subsequentemente, um ensaio de chip foi realizada utilizando os seguintes anticorpos; pan acetilada histona H3 (Ac H3) e H4 (Ac H4), histona H3 acetilada em lisina 9 e 14 (H3K9 /K14Ac), histona H3 acetilada em lisina 9 (H3K9ac), histona H3 acetilada em lisina 9 e fosforilada na serina 10 (H3K9pS10), Histona H3 marcador dimetylation na lisina 9 (H3K9Me2), marcador dimetylation na lisina 4 (H3K4Me2) e marcador de metilação na lisina 4 (H3K4Me). O estado da cromatina na região promotora de (A)

CXCL8

, (B)

CXCR1 Comprar e (C)

CXCR2

é mostrado. ADN de entrada serve como um controlo positivo recomendado pelo fabricante (Diagenode). Um controle nenhum anticorpo foi incluído para testar para o transporte não específico de DNA com histonas. (M – escada tamanho DNA)

A metilação não está directamente envolvida na regulação do CXC (ELR

+) família

Após o tratamento de células com um DNA metiltransferase. inibidor (DAC), os efeitos sobre CXC (ELR +) expressão família foram analisados ​​utilizando RT-PCR (Figura 5). foi observado na linha celular HBEC4 e não em quaisquer linhas celulares de NSCLC (Figura 5B), uma redução significativa de

CXCL3

(0,01 p 0,05, Figura 5B). Os dois receptores

CXCR1

e

CXCR2

foram significativamente induzida pelo DAC em HBEC4 (p 0,01) (Figura 5A, B). DAC demonstraram a capacidade para reactivar

CXCR1

mas não

expressão CXCR2

em SKMES-1 (p 0,01) (Figura 5A, B). DAC poderia induzir

CXCR2

mas não

CXCR1

em A549 (p 0,05) (Figura 5A, B). Embora estes dados sugerem que o ADN CpG metilação está envolvida com a regulação da expressão dos receptores CXC e CXCL8, uma pesquisa da biblioteca de genoma UCSC (https://genome.ucsc.edu/) revelou um certo número de resíduos de CpG escasso em as regiões promotoras destes três genes. Por conseguinte, acreditamos que uma mudança nos níveis de expressão desta família talvez devido a um efeito secundário causada por tratamento de DAC, tais como a sobre-regulação dos factores de transcrição específicos.

a) o efeito de 5-aza 2’desoxicitidina tratamento (DAC) na expressão de

CXCL1 Restaurant –

3

,

CXCL8

e

CXCR1 /2

. As células foram cultivadas em 1 uM DAC durante 48 h com meio e de droga substituído a cada 24 h. mudanças de expressão foram medidos utilizando RT-PCR com Beta-actina utilizado como controle interno para fins de quantificação. B) análise de densitometria de expressão no tratado versus amostras não tratadas quando normalizado para

beta actina

. Os dados são representados graficamente como a média ± erro padrão da média. (N = 3). (DAC – 5-aza-2’deoxycitidine)

A proliferação celular de SKMES-1 é diminuída na presença de CXCL8 recombinante, enquanto aumentou em A549

Quando tratados com várias. concentrações de CXCL8 recombinante (0,1-100 ng /mL) durante um período de 24-72 h, havia uma tendência para uma diminuição da proliferação na linha celular HBEC em relação ao controlo não tratado (dados não mostrados). tratamento CXCL8 (100 ng /mL e 10 ng /mL) causou um aumento da proliferação na linha celular A549 (p 0,01-100 ng /mL, p 0,05-10 ng /ml) em apenas 72 h após o tratamento (figura 6A). No entanto, houve uma diminuição significativa na proliferação em 24 h após tratamento em SKMES-1 (Figura 6B) para todas as concentrações testadas (P 0,01, 100 ng /ml e 10 ng /mL; p 0,05 1 ng /mL e 10 ng /mL), mas não em qualquer outro ponto de tempo (dados não mostrados). Para determinar se o efeito proliferativo em ambas as linhas celulares foi especificamente devido ao tratamento CXCL8, foi realizada uma abordagem CXCR2 neutralizante. As linhas celulares foram tratadas com o SB 225002 em um IC publicado anteriormente

50 valor de 22 nM de [33], durante uma hora antes da adição de CXCL8 a 100 ng /mL durante 72 h (A549) e 24 h (SKMES-1 ) (Figura 6C). O bloqueio do receptor CXCR2 negado o efeito proliferativo em ambos os A549 e linhas celulares SKMES-1, em comparação com o tratamento CXCL8 sozinho.

proliferação A) celular foi examinada pelo ensaio BrdU seguinte 24-72 h tratamento com CXCL8 em A549 ( 72 h pós-tratamento) e SKMES-1 (24 h pós tratamento) linhas celulares. Somente pontos de tempo com dados significativos é mostrado. Os dados são representados como uma percentagem do controlo sem tratamento (UT), o qual foi definido como 100%, e é expressa como média ± SEM. (N = 3) (ε P 0,01 – tratamento CXCL8

vs

UT, ψ p .. 0.05 – tratamento CXCL8

vs

UT) B) As linhas celulares que foram tratadas com um CXCR2 selectiva antagonista (0.022μM) durante 1 h antes da adição de CXCL8 e cultivadas durante um período de 24 (SKMES-1) ou 72 h (A549). Os dados são representados como uma percentagem do controlo sem tratamento (UT), o qual foi definido como 100%, e é expressa como média ± SEM. (N = 3).

Discussão

O CXC (ELR

+) da família das quimiocinas, um potente família pró-angiogénico, foi encontrado para ser regulamentada epigenetically tanto em NSCLC e linhas de células normais epiteliais brônquicas a nível de ambas as histonas pós-translacional modificações.

Em um painel de amostras /tumor combinados normais, as quimiocinas e receptores exibido nenhum padrão expressão alterada entre adenocarcinoma e amostras de carcinoma epidermóide, com exceção de

CXCL3

(valor médio elevado em carcinoma de células escamosas e reduziu em adenocarcinoma). Níveis mais altos de CXCL8 foram detectados pela IHQ em amostras de tecido de câncer de pulmão, quando comparado com o normal [34] e, em nossos níveis de amostras de

CXCL8

mRNA foram elevadas em 37,8% (14/37) das amostras. Embora os valores de densitometria média global (adenocarcinoma n = 14 e carcinoma de células escamosas n = 23) indicam uma redução de quimiocinas nas amostras de tumor (Figura 1C), isso não era verdade para cada amostra individual (Figura 1 A). Devido à heterogeneidade das amostras, é difícil chegar a uma conclusão definitiva com base nestes resultados. Deve-se notar no entanto, que a expressão de muitas das quimiocinas foram mais frequentemente encontradas para ser regulada negativamente nos tumores NSCLC como se segue

CXCL1

(64,9%, p 0,01),

CXCL2

( 81,1%, p 0,01),

CXCL3

(59,5%) (Figura 1B). Além disso, os níveis de

CXCR1

também foram encontrados para ser significativamente reduzido em tumores NSCLC (35,2%, p 0,05).

Num painel de linhas celulares de NSCLC tratados com HDACi houve diminuir em

CXCL1-3

com um aumento concomitante no

CXCL8

e os receptores de

CXCR1

e

2

(Figura 3B). TSA foi anteriormente mostrado para regular CXCL8 em pulmonar [35] e linhas celulares de cancro da mama [36]. A reactivação destes receptores em linhas celulares de cancro de pulmão parece indicar que eles estão sob regulação epigenética no nível de modificação de histona. O dogma geral associada com HDACi é que eles funcionam para induzir a expressão do gene. No entanto, neste estudo, a TSA causada tanto uma regulação acima e para baixo das quimiocinas, um efeito observado por outros em outros estudos. Por exemplo, HDACi foram mostrados para regular negativamente gene do tumor de Wilms 1 (WT1) [37] e EGFR [38]. A disponibilidade limitada de factores de transcrição específicos pode resultar em apenas um certo número de genes regulados positivamente. Como tal, a activação de

CXCL8

podem conduzir à regulação para baixo para

CXCL1-3

, quer através de um interruptor molecular ou através da titulação de factores de transcrição longe das regiões promotoras desses genes. resultados ChIP indicam que TSA atua remodelando diretamente a região promotora do

CXCL8

e

CXCR1 /2

genes (Figura 4). Nossos resultados mostram que ChIP histonas H3 e H4 tornar hyperacetylated nestes genes promotores, envolvendo lisinas 9 e 14 de histona H3 e lisinas 5, 8, 12 e 16 de histona H4. Nós observamos um forte aumento nos níveis de histona H3 lisina 4 dimetilação (H3K4me2) após a ativação da transcrição via HDACi, e também observar uma perda de histona lisina 4 monomethylation (H3K4me), após a ativação de CXCL8 /CXCR1 /CXCR2. De acordo com a literatura atual, observa-se a presença de uma marca repressiva H3K9Me2 no promotor PGIS antes da activação através HDACi, e os níveis desta diminuição modificação da histona seguintes activação [39], [40]. Estes resultados verificar se HDACi faz com que faz com que a cromatina remodelação através de modificações das histonas pós-traducionais em torno da região do promotor dos genes examinados indicando que é elemento ativo na regulação dessas quimiocinas e seus receptores.

DNA CpG metilação é também um componente importante na regulação da expressão do gene epigenético. ADN hipermetilado é frequentemente encontradas nas regiões do promotor de genes de supressão tumoral em cancros, particularmente no cancro do pulmão [30]. Os tratamentos com o DNMTi DAC reativou a expressão de

CXCR1

no A549 de linha (Figura 5B) celular e

CXCR2

em SKMES-1 (Figura 5B).