Abstract

Cancro é frequentemente associada com caquexia, sintomas cardiovasculares e desregulação autonômica. Testamos se o câncer extracardíaco afeta diretamente a inervação do miocárdio ventricular esquerdo. Os ratinhos injectados com células de carcinoma de pulmão de Lewis (grupo do tumor, TG) ou PBS (grupo de controle, GC) foram analisados ​​depois de 21 dias. A função cardíaca (ecocardiograma), os níveis séricos de TNF-α e IL-6 (ELISA), alterações estruturais dos cardiomiócitos e sua inervação (estereologia-base do projecto) e os níveis de ARNm relacionados com a inervação (RT-PCR quantitativa) foram analisados. Os grupos não diferiram em diversos parâmetros funcionais. Os níveis séricos de TNF-α e IL-6 foram elevados em TG. O comprimento total de axônios no ventrículo esquerdo foi reduzido. O número de vesículas núcleo denso por perfil axónio foi reduzida. Diminuição do volume myofibrillar, aumento do volume sarcoplasmático e aumento do volume de gotículas lipídicas eram indicativos de alterações metabólicas de cardiomiócitos TG. No coração, o nível de ARNm do factor de crescimento do nervo foi reduzida enquanto que a do receptor adrenérgico β1-se inalterado em TG. No gânglio estrelado de TG, os níveis de mRNA de factor de crescimento de nervo e o neuropeptídeo Y foram diminuídas e que de tirosina hidroxilase foi aumentada. Em resumo, o cancro induz um estado pró-inflamatória sistémica, uma redução significativa na inervação do miocárdio e um fenótipo catabólico dos cardiomiócitos no rato. redução da expressão de fator de crescimento neural pode ser responsável pela inervação do miocárdio reduziu

Citation:. Mühlfeld C, Das SK, Heinzel FR, Schmidt A, Pós H, Schauer S, et al. (2011) Cancer Induz Cardiomyocyte Remodelação e Hypoinnervation no ventrículo esquerdo do coração Mouse. PLoS ONE 6 (5): e20424. doi: 10.1371 /journal.pone.0020424

editor: Gian Paolo Fadini, Universidade de Pádua, Itália |

Recebido: 10 de fevereiro de 2011; Aceito: 26 de abril de 2011; Publicado em: 26 de maio de 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Mühlfeld et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Cluster cardiopulmonar Sistema de Excelência (WK) e pela Verein zur Förderung der Krebsforschung em Gießen eV (CM). SD foi financiado em parte pelo programa de PhD Medicina Molecular da Universidade de Medicina de Graz. Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

caquexia Câncer é uma síndrome complexa clinicamente se manifesta como perda progressiva de peso corporal com ou sem diminuição da ingestão alimentar, e está correlacionada com um prognóstico pobre [1]. O envolvimento patológico do coração sob estas condições foi descrita como uma nova entidade, Burch et ai. [2] e denominou o “coração caquético”. Além de mudanças no ECG e diminuição do tamanho do coração na radiografia de tórax, o coração caquético é caracterizada pela perda de gordura epicárdica, aumento de grânulos de lipofuscina e diminuição de cardiomiócitos área transversal, apesar de função cardíaca geralmente normais [3], [4] . Além disso, a massa de proteína é diminuída resultante do aumento do catabolismo protéico [5].

Curiosamente, o câncer está associada a alterações funcionais do sistema cardiovascular, tais como a diminuição da variabilidade da frequência cardíaca em pacientes com leucemia aguda [6], o aumento de descanso ritmo cardíaco, diminuição da pressão arterial de repouso e uma maior queda postural na pressão sanguínea em pacientes com carcinoma brônquico [7], e aumento da incidência de insuficiência autonômica cardiovascular tal como avaliado por uma variedade de testes de eletrocardiograma e clínicos em doentes com cancro da mama [8], [9] . Recentemente, um link foi levantada a hipótese entre a síndrome da fadiga câncer (uma combinação de dispnéia, limitação ao exercício e fraqueza muscular) e insuficiência cardíaca clinicamente não-evidente, sugerindo que os sintomas de fadiga surgir de disfunção autonômica [10]. Embora esses estudos apontam claramente para um envolvimento da inervação cardíaca em caquexia associada ao câncer, estudos sistemáticos sobre este tema faltam até agora.

A inervação dos ventrículos predominantemente constituída por axônios simpáticos pós-ganglionares, embora, em menor medida, também axônios parassimpáticos sensoriais e pós-ganglionares estão presentes [11], [12]. No nível microscópico luz, imuno-histoquímica é necessário para visualizar as fibras nervosas cardíacas unmyelinated. Cada fibra do nervo pode ser constituído por um ou mais axónios, o número dos quais apenas pode ser determinado por microscopia electrónica. Além do neurotransmissor noradrenalina clássica, neurónios simpáticos também contêm neuropeptídeos que são produzidos na pericários e armazenados nas estruturas vesiculares que são denominados grandes vesículas núcleo denso (LDCV). LDCV são anterogradamente transportado através do axônio e são liberados pela explosão ou queima de alta frequência [13]. No caso de axónios simpáticos cardíacos, LDCV predominantemente contêm neuropéptido Y (NPY) [14].

Aqui, a hipótese de que a caquexia do cancro está associado com alterações estruturais qualitativos e /ou quantitativos da inervação do miocárdio. Para testar esta hipótese, foi utilizado um modelo de rato com caquexia tumor e examinou suas características no que diz respeito aos níveis de citocinas séricas e função cardíaca. Neste modelo, foi realizada uma luz e eletrônica de análise microscópica detalhada do ventrículo esquerdo e empregou métodos estereológicos baseada em projeto para quantificar várias características de cardiomiócitos e sua inervação. Além disso, os níveis de várias proteínas relacionadas com a inervação cardíaca expressão de mRNA foram quantificados no coração e do gânglio estrelado, um grande gânglio fornecimento de fibras simpáticas para o coração.

Resultados

Animais

a partir do ponto de tempo de implantação do tumor até ao final da experiência ao fim de 21 dias, os ratos TG perdeu 2,32 ± 0,82 g de peso corporal magra enquanto os ratos em CG adquirida 2,11 ± 0,37 g de peso corporal magra (p 0,001) validar o modelo do rato como modelo de caquexia tumoral. Os tumores próprios tinham um peso médio de 3,3 ± 0,57 g. Não houve diferenças significativas no peso do ventrículo esquerdo entre os grupos, no entanto, a relação entre o ventrículo esquerdo e o peso corporal foi significativamente maior em TG devido ao peso corporal diminuiu (Tabela 1).

ecocardiografia

a Tabela 2 apresenta os dados obtidos pela ecocardiografia em ratos anestesiados, normotérmica. Nenhum dos parâmetros diferiram significativamente entre TG e CG indicando uma função cardíaca preservada no grupo tumor em condições de repouso.

TNF-a e IL-6 níveis

Os níveis séricos de TNF-α e IL-6 foram significativamente elevados em comparação com TG GC (Tabela 3).

RT-PCR quantitativo

no coração, a expressão de a-adrenérgico β1 receptor manteve-se inalterada em TG vs. CG. Além disso, a expressão do factor de crescimento do nervo (NGF) foi diminuída em comparação com TG CG. Os níveis de expressão de ambos os receptores do TNF (TNF-R1, TNF-R2) foram aumentados três vezes ou mais, respectivamente, em TG vs CG.

nos gânglios estreladas de TG, a expressão do NPY foi significativamente reduzida Considerando a expressão da tirosina-hidroxilase, a enzima limitante da velocidade para a síntese de noradrenalina, foi aumentado três vezes. O NGF foi significativamente regulada negativamente em ratinhos portadores de tumor, mas as alterações foram menos extensas do que as alterações na expressão do transmissor. Ambos os receptores de TNF foram significativamente reforçada em TG vs GC (Tabela 4).

Cardiomyocyte morfologia

No nível microscópico luz, o miocárdio apareceu normal com cardiomiócitos bem preservados, amplamente capilares abertos devido à fixação de perfusão e do tecido conjuntivo suave no interstício. Não havia sinais de atrofia cardíaca ou a fibrose intersticial. Esta observação foi suportada por o volume total e o número de cardiomiócitos que não foram significativamente diferentes entre os grupos (Figura 1). No nível microscópico de elétrons, os dois grupos mostraram diferenças notáveis ​​no que diz respeito às suas miofibrilas e sua sarcoplasm. Tal como ilustrado pelas micrografias representativas e os dados estereológicos, a fracção de volume de miofibrilas foi significativamente reduzida enquanto que a fracção de volume sarcoplasmático foi significativamente aumentada em TG (Figura 2). O volume absoluto de sarcoplasm foi significativamente melhorada enquanto que a diminuição no volume total miofibrila não atingiu significância estatística (p = 0,06), provavelmente por causa de outros factores como o volume de cardiomiócitos e volume ventricular esquerdo introduzir uma maior variabilidade nos dados. Não foram observadas diferenças na densidade de volume nuclear e mitocondrial ou volume (dados não mostrados). Além disso, em TG um número maior de gotículas de gordura de maior dimensão no sarcoplasma foram notado que é reflectida por um volume total maior de gotículas de gordura no ventrículo esquerdo (Figura 2). Este aumento de gotículas lipídicas, no entanto, é muito baixa para explicar o aumento do volume sarcoplasmic total.

cortes semifinos secções transversais (1 mm de espessura) corado com azul de toluidina não mostraram diferenças nas dimensões de cardiomiócitos entre o controlo (A) e ratos portadores de tumor (B). No entanto, a organização subcelular de cardiomiócitos apareceu menos denso no grupo tumor. secções longitudinais de parafina (espessura de 5-7 um) coradas com tricromo de Masson-Goldner não forneceram evidência para uma deposição aumentada do colagénio nos ratinhos portadores de tumor (D) em comparação com ratinhos de controlo (C). A barra de escala para A e B = 10 ^ m. barra de escala para C e D = 20 mm.

Electron micrografias de miocárdio do controle (A, C, E) e os ratos portadores de tumor (B, D, F). A e B demonstram o aumento do volume de sarcoplasm ea perda de miofibrilas em miócitos mais ou menos longitudinalmente seccionadas. Barra de escala = 5 uM. C e D mostram claramente o aumento na gotícula de lípido (ld) tamanho e o número no grupo de tumores em miócitos diagonalmente seccionados. Escala da barra = 1 uM. E e F mostram fibras nervosas contendo três axónios (asterisco) cada. Não houve diferenças aparentes na morfologia. Os miócitos vizinhos são mais ou menos transversalmente cortar. Abreviaturas:. Cap = capilares, miofibrilas mf, mi = mitocôndrias

lipotoxicidade

As análises bioquímicas do teor de triglicéridos confirmou o aumento da lipídeos em cardiomiócitos. Malondialdeído e outras substâncias reactivas ao ácido tiobarbitúrico são compostos altamente reactivos que são utilizados como marcadores para o stress oxidativo. Usando dois testes para a medição destas substâncias, não encontramos uma diferença significativa entre CG e TG (Tabela 5). O ponto final da ação tóxica dos lípidos no coração é cardiomiócitos apoptose. No entanto, a atividade da caspase não diferiu entre os grupos (Tabela 5). Além disso, não encontramos qualquer evidência morfológica para a apoptose de cardiomiócitos por microscopia eletrônica.

comprimento total e morfologia dos axônios do miocárdio

A Figura 3 mostra a morfologia da inervação do miocárdio ea estereologia dados da caracterização axônio. O comprimento total de axónios ramificados entre os cardiomiócitos foi reduzida para menos de metade em TG quando comparado com CG. No entanto, a frequência relativa de fibras nervosas com um determinado número de axónios não variou entre os grupos. Também não houve diferenças no tamanho do diâmetro das fibras do nervo Embora tenha havido uma tendência para uma ocorrência mais frequente de axônios com diâmetros menores nos ratos tumorais. Curiosamente, o número de neuropéptido armazenar LDCV por perfil axónio foram reduzidas em cerca de 50% em comparação com TG CG.

Nem o volume de cardiomiócitos (A, círculos abertos), nem o volume do espaço intersticial (A, quadrados a cheio) foi diferente entre os grupos. Além disso, o número de cardiomiócitos foi semelhante entre os grupos (B). O volume de sarcoplasm (C, quadrados a cheio) foi significativamente aumentada no grupo do tumor, enquanto o volume de miofibrilas (C, círculos abertos) tendeu a ser menor. Um maior volume de gotículas lipídicas foi encontrado nos cardiomiócitos de portador de tumor do que os ratos de controlo (D). Note-se a escala logarítmica no eixo Y (D). O comprimento total de axónios foi reduzida para aproximadamente metade do tumor no grupo (E), enquanto que a frequência relativa de fibras nervosas com um certo número de axónios não diferiram entre os grupos (F). O número de LDVC por perfil axónio foi reduzida no grupo de tumor (L), enquanto que o diâmetro dos axónios foi semelhante em ambos os grupos (h). Cada círculo ou quadrado representa os dados para um animal individual. As barras horizontais demonstrar a média do grupo.

Discussão

O presente estudo testou a hipótese de que a exposição crônica a um grande tumor extracardíaco provoca alterações estruturais e funcionais da inervação do miocárdio em camundongos. A hipótese foi baseada em vários relatórios sobre alterações funcionais do coração de pacientes que sofrem de uma variedade de formas de cancro [6] – [9] e a observação das lesões degenerativas estruturais dos cardiomiócitos na caquexia do cancro [2]. De acordo com a nossa hipótese, observamos uma redução acentuada do comprimento total de axônios que inervam deixou cardiomiócitos ventriculares e o número de neuropeptídeos organelas armazenamento, LDCV, nestes axônios. Além disso, observou-se uma diminuição do volume myofibrillar mas aumentou sarcoplasm e de gotículas de gordura de volume dentro de cardiomiócitos. As alterações estruturais foram acompanhados por níveis reduzidos de expressão de NGF em coração e gânglio estrelado, reduzida expressão NPY ganglionar, mas reforçada tirosina expressão hidroxilase.

tem sido bem estabelecida O modelo de rato com carcinoma do pulmão de Lewis utilizado neste estudo para muitos anos [15] e é conhecido por causar uma caquexia tumoral significativa [16]. Neste estudo, o tempo entre a implantação de células tumorais e o sacrifício dos animais foi de 21 dias; este tempo foi suficiente para induzir uma carga tumoral de 12-15% do peso total do corpo e uma condição caquéticos simulando o cenário clínico de caquexia do cancro. Apesar das mudanças na massa corporal os corações de ratos TG tinha uma massa úmida semelhante aos de ratos CG que contrasta com outros estudos com tumores sólidos [17]. Estas diferenças podem ser devido à carga de tumor mais baixa, a duração do tipo de célula experimento, estirpe de ratinho ou tumor. Como discutido abaixo, os resultados indicam claramente estereológicos um fenótipo catabólico dos cardiomiócitos embora não ocorrer atrofia cardíaca no sentido de massa reduzida. O desempenho funcional do coração foi avaliada por ecocardiográfica em condições de repouso. No geral, a função cardíaca não diferiu entre GC e GT. Isto está em contraste com um estudo recente em murganhos inoculados com células de cólon 26 adenocarcinoma-por Tian e colaboradores [17], que relataram uma diminuição significativa no encurtamento fraccional em ratinhos portadores de tumor em comparação com ratinhos de controlo. No entanto, o estudo também mostrou uma morfologia do miocárdio diferentes, incluindo fibrose e desorganização das cristas mitocondriais que não foi observado no presente estudo. Portanto, não parecem existir diferenças gerais em modelos animais entre o seu eo nosso estudo. De acordo com outros estudos utilizando o carcinoma de pulmão de Lewis [18], observou-se uma condição pró-inflamatória sistémica caracterizada por níveis séricos elevados de IL-6 e TNF-α. Na caquexia do cancro humano, uma variedade de níveis de citoquina é elevada com TNF-α sendo a citoquina chave [19]. As citocinas em excesso pode ter origem tanto de células tumorais e de células do sistema imunológico que está sendo estimulada por sinais diretos ou indiretos do tumor [19]. As citocinas pró-inflamatórias, especialmente TNF-α, são conhecidos por interagir com o sistema nervoso e, assim, podem influenciar o metabolismo neuronal e sobrevivência [20] – [22], no entanto, os nossos dados não fornecem uma relação de causa-efeito entre a inflamação e a fenótipo neuronal como outros eventos fisiopatológicos estão presentes no modelo de caquexia tumor que pode afetar a inervação do miocárdio (por exemplo, perda de peso).

as principais conclusões do estudo são uma redução na inervação do miocárdio e diminuição da LDCV por perfil axónio para aproximadamente 50% dos valores de controlo. Estes dados morfológicos são bem suportados e complementada pela análise qRT-PCR que demonstra uma diminuição da expressão de NPY em neurónios do gânglio estrelado, enquanto os níveis de mRNA de tirosina-hidroxilase são reforçadas em TG. Além disso, os níveis de expressão de mRNA de NGF foram reduzidos no coração e no gânglio estrelado. A diminuição do comprimento total de axónios ramificados entre cardiomiócitos é indicativo de alterações atróficas do sistema nervoso autónomo do coração. Esta nova descoberta confirma a nossa hipótese e apoia firmemente o envolvimento do sistema nervoso autônomo cardíaco na doença de câncer. A redução do comprimento total de axónios podem ser originários de i) a partir de uma perda de neurónios do gânglio, ii) a partir de uma perda de arborização de cada neurónio ou iii) a partir da perda de comprimento do axónio indivíduo. O nosso estudo mostra que a redução do comprimento total do axónio é principalmente devido a uma redução na densidade de fibras nervosas, não por causa de um número reduzido de axónios por fibras nervosas. No entanto, observou-se a densidade de fibras do nervo diminuiu ao longo de todo o ventrículo sem manchas de desnervação completa. Assim, o resultado pode, quer provenham de um processo degenerativo que começa na periferia das ramificações de axónios ou baseia-se numa alteração estrutural e /ou metabólica do corpo da célula nervosa. Estudos em ratinhos homozigóticos com mutações nulas em o NGF ou o gene da tirosina-cinase do receptor de NGF têm demonstrado que a manutenção dos neurónios e sua arborização no sistema nervoso simpático depende do fornecimento com NGF a partir de tecidos-alvo [23]. A expressão reduzida de NGF no coração e do gânglio estrelado torna muito provável que a falta de NGF desempenha um papel causal na redução da inervação do miocárdio. Curiosamente, também há evidências de que as funções metabólicas dos neurónios são perturbados como indicado pela redução no número de LDCV e a expressão do mRNA de NPY reduzida. Em contraste com as pequenas vesículas contendo catecolamina, estes LDCV contêm neuropeptídeos que são sintetizadas no soma dos neurónios e são anterogradamente transportados para a periferia dos axónios. No coração, LDCV contêm principalmente NPY que tem efeitos vasoconstritores e serve funções tróficas em cardiomiócitos [24]. Ela induz a síntese de proteínas cardiomiócito [25] e estimula a hipertrofia [26]. A redução de LDCV contendo NPY pode ser pelo menos parcialmente responsável pelo teor reduzido de miofibrilas dentro dos cardiomiócitos. Curiosamente, apesar de NPY foi pensada para desempenhar um papel importante na anorexia e caquexia com base na sua redução Central nestas condições [16], as medições dos níveis plasmáticos de NPY em pacientes de controlo e cancerosas humanas não revelou diferenças [27]. No entanto, ainda é debatido se influenciar este sistema pode atenuar a caquexia associada ao câncer [28]. O principal neurotransmissor dos neurónios simpáticos (noradrenalina) é sintetizado a partir de tirosina por meio de vários passos que são catalisadas enzimaticamente. A enzima limitante da velocidade, tirosina hidroxilase, verificou-se ser regulada positivamente no gânglio estrelado em TG que parece ser um mecanismo contra-regulador para a inervação reduzida do miocárdio. A redução das ramificações de axónios no ventrículo esquerdo pode, portanto, ser contrabalançado pela produção de catecolaminas reforçada e, portanto, pode explicar por que não detectou diferenças funcionais sob condições de repouso. Por outro lado, um coração totalmente desnervado apresenta uma frequência de batimento muito constante, mas sem comprometimento funcional nos termos do restante [29] para as mudanças que funcionais associados à perda ou inervação do miocárdio perturbado pode sim tornar-se evidente em condições de estresse ou por análise de parâmetros específicos tais como variabilidade da frequência cardíaca. Infelizmente, devido à complexidade do modelo (atrofia de cardiomiócitos, atrofia muscular, anemia) dificilmente é possível realizar um teste de stress que iria fazer uma distinção clara entre as alterações na inervação do miocárdio e outras facors extracardíacas.

O cardiomiócitos compartimento nos murganhos de tumor foi caracterizado principalmente por uma redução de miofibrilas, e um aumento na sarcoplasm e lípidos gotículas. As investigações sobre a patologia do miocárdio humano, obtido a partir de corações de doentes que morreram de caquexia do cancro, demonstraram diminuição da área da secção transversal de cardiomiócitos e um aumento em grânulos de lipofuscina [2], [3]. Em parte devido a diferenças entre as espécies, estes resultados diferem daqueles obtidos no presente estudo. Por exemplo, em contraste com os seres humanos em que a idade relaciona-se com um volume crescente de lipofuscina, esta não ocorre, em grande medida em cardiomiócitos murinos, provavelmente devido ao curto período de vida de ratinhos. A diminuição da área da secção transversal de cardiomiócitos como descrito por Burch et ai. [2] é indicativo de atrofia cardíaca. No entanto, no nosso modelo não houve redução no volume total ou o número de cardiomiócitos. Isto pode ser devido a um estado de doença mais avançados nos corações humanos, para o curso de tempo entre a doença começar e análise (21 dias em ratinhos contra meses ou anos em humanos) e, naturalmente, devido a diferenças na complexidade da doença (sem metástase no ratinho, apenas a caquexia leve). Em coelhos submetidos a caquexia do cancro, não se verificaram cardiomiócitos apoptóticos em contraste com outros órgãos, onde uma grande quantidade de células sofreram apoptose [30]. Ao nível ultra-estrutural, no entanto, foi observada uma perda de miofibrilas que foi acompanhado por um aumento no volume sarcoplasmático. A diminuição em miofibrilas é indicativo de um desequilíbrio entre a degradação de proteína e síntese favorecendo o catabolismo proteico [5]. Devido ao volume inalterado de cardiomiócitos as alterações no volume miofibrilar /sarcoplasmático não pode ser induzida por edema celular. Uma observação interessante foi a estrutural aumento em gotículas de lípidos, que foi confirmado por meio de medições bioquímicas de triglicéridos. Em caquexia tumoral, os ácidos gordos são libertadas a partir do tecido adiposo e acumulam-se em outros tipos de células, onde eles podem causar efeitos lipotoxic [31], [32]. lipotoxicidade cardíaca envolve a geração de espécies reactivas de oxigénio e o aparecimento de vias apoptóticas [33]. Na presente análise, peroxidação de lípidos foi avaliada através da medição malondialdeído e compostos associados, e a apoptose foi avaliada por um ensaio de actividade da caspase e a avaliação morfológica. Uma vez que nenhum destes parâmetros foi significativamente diferente entre TG e CG, podemos concluir que as observações deste estudo não estão relacionados com lipotoxicidade. Embora o significado funcional exacta das alterações ultra-estruturais observados dos cardiomiócitos continua a ser investigado, é muito provável que estas alterações estão em relação directa com a falta de estímulo do NPY trófico através do receptor Y5 de NPY [34] e podem tornar-se funcionalmente relevante se a demanda metabólica do coração aumenta. Devido à relativamente grande plasticidade cardíaca essas mudanças podem não conduz necessariamente a uma deterioração significativa da função cardíaca [35].

Em resumo, este estudo, pela primeira vez demonstra que a caquexia associada ao câncer está associada a alterações estruturais marcadas de a inervação autonômica do coração, incluindo tanto a disfunção da integridade estrutural do neurónio (comprimento total diminuiu axónio) e perda organelo. Concomitantemente, a quantidade de lípidos e o número e volume de gotículas lipídicas aumentado em cardiomiócitos eo volume myofibrillar diminuiu, o que está em linha com o conceito de um suporte trófico contínua dos cardiomiócitos por neurônios autonômicos.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos os experimentos com animais foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. O protocolo (GZ 66,010 /0085-II /10b /2009) foi aprovado pela comissão austríaca sobre a ética da experimentação animal (Bundesministerium für Wissenschaft und Forschung).

Animais

Fêmea C57BL /6J foram mantidos num ciclo claro-escuro normal (12 h de luz, 12 horas de escuro) e mantidos numa dieta de comida padrão de laboratório (4,5% w /w de gordura). Os ratinhos utilizados para a injecção de células tumorais, bem como os animais de controlo foram de 8-9 semanas de idade. Durante a ingestão de alimentos experiências, bem como o peso corporal foram monitorados diariamente

Tumor implantação

Os ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos:. Controlar ratinhos não tendo-tumorais (CG, n = 18) e os ratos que foram injectados com células de carcinoma de pulmão de Lewis (GT, n = 18). As células de carcinoma foram mantidas em cultura celular em meio rico em glucose DMEM suplementado com 10% (v /v) de FBS, 2 mM de L-glutamina e 1% de penicilina-estreptomicina. Subsequentemente, 2 × 10

6 células LLC, obtidos a partir de uma cultura celular em proliferação exponencial, foram injectados por via subcutânea abaixo do pescoço do animal. ratinhos irmãos foram injectados com PBS no mesmo local para servir como controlos simulados. Ambos os ratos de controlo e portadores de tumor foram sacrificados após 21 dias. Em conjuntos separados de experiências, os ratinhos foram usados ​​(i) para a ecocardiografia (n = 4 no grupo do tumor, n = 5 no grupo de controlo) e estereologia (n = 5 no grupo de tumores, n = 6 para o grupo de controlo), (ii ) para medir o teor cardíaca lípido, a actividade da caspase, peroxidação de lípidos e os níveis de citocinas no soro (n = 6 em cada grupo), e (III) para o corpo, do ventrículo esquerdo e o peso do tumor e para a reacção em cadeia da polimerase do ventrículo esquerdo e gânglio estrelado medição ( n = 6 em cada grupo). Diferenças no número de animais utilizados em ecocardiografia e estereologia são causados ​​pela exclusão de animais que parou de respirar espontaneamente durante a anestesia (ecocardiograma), ou que não foram devidamente fixado por perfusão vascular (estereologia).

Ecocardiografia

2D guiada ecos de modo M (30 MHz) foram obtidos a partir de pontos de vista de curto e longo eixo ao nível do maior LV-diâmetro usando um VS-VEVO 770 alta resolução Imaging System (Visualsonics, Toronto, Canadá) equipado com um MHz RMV 30 (em tempo real microvisualization) cabeça de digitalização. Os ratos foram levemente anestesiados com isoflurano a 2% e foram autorizados a respirar espontaneamente. O peito foi rapada, gel de acoplamento acústico foi aplicada, e uma almofada de aquecimento foi utilizado para manutenção da temperatura. Os ratos foram fotografadas em uma posição de decúbito lateral esquerdo rasa. dimensões diastólica final e final sistólica do ventrículo esquerdo foram medidos a partir traçados originais usando as convenções de ponta da Sociedade Americana de Ecocardiografia. por cento encurtamento do ventrículo esquerdo fraccionada foi calculada como previamente descrito [36].

TNF-α e IL-6 ELISA

As amostras de sangue foram tomadas a partir de controlo anestesiado e ratos portadores de tumor por retro-orbital punção. O soro foi congelado a -20 ° C. Os níveis séricos de TNF-α e IL-6 foram medidos utilizando ELISA ReadySETGo-a TNF (88-7324, eBiosciences, San Diego, EUA) e do rato Il-6 ELISA ReadySETGo (88-7064), eBiosciences, San Diego, EUA) . A placa foi finalmente lido a 450 nm.

medição Triglicéridos

Os triglicéridos foram extraídos a partir de tecidos cardíacos de controlo e portadores de tumor utilizando murganhos hexane:isopropanol e saponificado utilizando 1% de Triton X-dissolvido em clorofórmio. Os solventes orgânicos foram evaporados utilizando N

2 de gás e o teor de triglicéridos foi medida usando o kit de Triglicéridos FS (DiaSys, Alemanha) de acordo com o manual do fornecedor. Os níveis de triglicérides foram normalizados para o peso do tecido.

A medição da peroxidação lipídica e atividade caspase

Para avaliar a presença de efeitos lipotoxic em cardiomiócitos, a peroxidação lipídica foi determinada medindo malondialdeído e apoptose foi determinada medindo a actividade da caspase.

tecido cardíaco foi lavada exaustivamente com uma solução de heparina-PBS contendo EDTA 1 mM e homogeneizado em 500 pi de tampão de homogeneização (sacarose 0,25 M, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, 1 mM de mesilato de deferoxamina , PMSF 1 mM) a 4 ° C. A concentração de proteína foi determinada usando o ensaio de proteína-RC DC (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) a partir do sobrenadante. A peroxidação lipídica foi medida no sobrenadante, utilizando o kit de ELISA Oxiselect MDA aducto (STA-332, Biolabs celular, San Diego, CA, EUA) e o ensaio TBARS (STA-330, celular Biolabs) de acordo com o protocolo do fabricante.

Para a medição da actividade da caspase 3/7, 15 a 25 mg de tecido cardíaco foram homogeneizados em 300 ul de tampão de homogeneização (25 mM de Hepes pH 7,5, 5 mM de EGTA, 1 mM de Pefabloc SC, 1% de mistura de inibidores de protease [v /v ]) (P8340, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) a 4 ° C. O lisado foi centrifugado a 13000 g durante 20 min a 4 ° C. O sobrenadante foi recolhido e o teor de proteínas foi medida utilizando o ensaio de proteína DC (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). actividade de caspase foi determinada através da incubação de proteína de 50 ug em 100 ul de caspase-Glo®3 /7 reagente (Promega, Madison, WI, EUA) durante 1,5 horas a 20 ° C e de luminescência foi determinada utilizando um luminómetro (BMG Optima LUMIstar Labtec, Offenburg, Alemanha).

RT-PCR quantitativo

o ARN total foi extraído a partir do coração e estreladas gânglios de ratinhos portadores de tumores e controlo (n = 6 cada), através do reagente de Trizol (Invitrogen , Carlsbad, Califórnia, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Um micrograma de RNA total foi transcrito reversamente em ADNc utilizando o ADNc de alta capacidade kit de transcrição reversa (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Quantitativo em tempo real da reacção em cadeia da polimerase (qRT-PCR) foi realizada usando iniciadores específicos de genes adquiridos de MWG-Biotech (Ebersberg, Alemanha) (Tabela 6). ARN 18 S foi usado como controlo interno. Todas as reacções foram realizadas em triplicado. RT-PCR quantitativa foi realizada num sistema de PCR padrão 7900T Rea-ltime (Applied Biosystems) utilizando verde de SYBR como o Fluoróforo detecção. Os resultados são apresentados como níveis de expressão relativa após o cálculo com base no

método de T [37] delta delta C.

fixação do tecido, amostragem e processamento

Depois de ecocardiografia, ratos foram anticoagulados com heparina IP 500 IE, anestesiados com isoflurano e mortos por deslocamento cervical três minutos mais tarde. O coração foi então excisado, montado num aparelho de Langendorff, perfundidos com paraformaldeído a 4% em tampão de fosfato de retrogradamente através da aorta durante 10 min e mantidos em paraformaldeído a 4 ° C até posterior processamento.