Abstract

14-3-3 proteínas são proteínas adaptadoras diméricas ubiquamente expressas que têm surgido como mediadores importantes de muitas vias de sinalização celular em vários tipos de células. Os seus efeitos são mediados principalmente por ligação a proteínas fosfoserina /treonina selectivos. A importância de proteínas 14-3-3 em câncer só ter começado a tornar-se aparente e o seu papel exacto na progressão do cancro, bem como os mecanismos pelos quais as proteínas 14-3-3 medeiam a função de células do cancro permanecem desconhecidas. Enquanto 14-3-3σ proteína é largamente aceite como um supressor de tumor, 14-3-3ζ, β e isoformas y têm mostrado ter efeitos promotores de tumor. Apesar da importância da família 14-3-3 na mediação de vários processos celulares, o papel exato e um mecanismo de 14-3-3ζ permanecem inexplorados. No presente estudo, foram investigados o papel de 14-3-3ζ proteína na motilidade celular do cancro da próstata e a migração transendotelial usando biologia bioquímico, molecular e abordagens de detecção da impedância eléctrica célula-substrato, bem como ensaios funcionais com base celular. O nosso estudo indicou que a expressão com a proteína de tipo selvagem aumentou significativamente a actividade 14-3-3ζ Rac em células PC3. Em contraste, a expressão do mutante resistente dímero de proteína 14-3-3ζ (DM-14-3-3) inibiram a actividade de RAC e associado a fosforilação da p21 cinase-1 activada e 2. Expressão com o tipo selvagem 14-3-3ζ ou Rac1 constitutivamente activa o reforço do reconhecimento da matriz extracelular, a formação lamellipodia, migração celular e migração trans-endotelial por células PC3. Em contraste, a expressão com 14-3-3ζ DM ou DN-Rac1 em células PC3 inibiu significativamente estas funções celulares. Nossos resultados demonstram pela primeira vez que 14-3-3ζ aumenta as interações célula-matriz de câncer de próstata, motilidade e migração transendotelial

in vitro

activação através de Rac1-GTPase e é um alvo importante para intervenções terapêuticas para o câncer de próstata .

Citation: Goc A, Abdalla M, Al-Azayzih A, Somanath PR (2012) Rac1 Activation Impulsionada por 14-3-3ζ dimerização promove o câncer de próstata célula-matriz Interactions, motilidade e migração transendotelial. PLoS ONE 7 (7): e40594. doi: 10.1371 /journal.pone.0040594

editor: Ming Tat Ling, Universidade de Tecnologia de Queensland, Austrália |

Recebido: 14 Março, 2012; Aceito: 11 de junho de 2012; Publicação: 13 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Goc et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os fundos foram fornecida pela University of Georgia Research Foundation, Farmácia Fundação Wilson e UGA College of Pharmacy através de subsídios intramurais para PRS, e em parte pelo National Institutes of Health subvenção (R01HL103952) e da American Heart Association Scientist Desenvolvimento Grant (0830326N) para PRS. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Os sete membros da família 14-3-3 (também conhecidas como proteínas YWHA) são conhecidos por interagir com mais do que 100 moléculas de sinalização importantes em células normais e cancerosas e regulam uma grande variedade de processos celulares [1] , [2]. Em geral, 14-3-3 isoformas se ligam a dois motivos de ligação de alta afinidade dependentes de fosforilação tais como RSXpSXP RXXXpSXP e [3], [4]. Uma vez que as interacções de proteínas com esta proteína adaptadora são dependentes do mesmo local na proteína 14-3-3 [5], por 14-3-3 é necessário em muitas isoformas diferentes é uma questão de longa data. Considerando que todas as 14-3-3 isoformas formar homodímeros

in vivo

, uma explicação para a exigência de diferentes proteínas 14-3-3 é formar heterodímeros distintas com motivos de reconhecimento exclusivos para ligantes específicos. No entanto, enquanto vários 14-3-3 isoformas podem formar heterodímeros

in vitro

, uma combinação de 14-3-3 ε e ζ é o único heterodímero conhecido que é formado

in vivo

[ ,,,0],6].

Enquanto global de infra-regulação da expressão de 14-3-3 medeia a supressão do tumor, a expressão de proteínas 14-3-3 é significativamente elevada em vários cancros [7], [8], [9] [10], [11], [12]. Embora a superexpressão de 14-3-3 β e γ em células NIH 3T3 tenham mostrado induzir a transformação oncogénica [10], [13], o β, γ, ε, ζ e θ 14-3-3 expressões de genes demonstraram ser elevados no cancro do pulmão sozinho [14]. No entanto, de todos os 14-3-3 genes, 14-3-3 σ e ζ foram mais diretamente ligado ao câncer. Proteína 14-3-3 σ e Ç provocar efeitos opostos em células epiteliais mamárias [15]. Proteína 14-3-3σ é pensada para funcionar como um supressor de tumor através de uma indução de paragem do ciclo celular G2-M, na maioria dos cancros [16]. A sua expressão é regulada negativamente em cancros genito-urinário invasivas, tais como bexiga [17], da próstata [18], e do ovário [19]. Em contraste, o aumento da expressão de 14-3-3ζ, um homólogo de Drosophila de Leonardo ‘, tem sido associada a tumorigénese reforçada e é projectado como um marcador de prognóstico e alvo terapêutico para o cancro [20].

Uma correlação entre aumento da expressão da sobrevivência das células e reforçada 14-3-3ζ foi avaliado em células de cancro da próstata [21]. Dois estudos independentes também indicaram uma relação entre a expressão elevada de 14-3-3ζ e incidência de cancro da próstata em humanos [22], [23]. No entanto, a função exacta da 14-3-3s na progressão do cancro da próstata é em grande parte desconhecida. Embora os efeitos sobre a proliferação de 14-3-3s, do ciclo celular e para a sobrevivência de células cancerosas são amplamente estudados, quer sejam ou não 14-3-3s são necessários para a migração de quaisquer tipos de células de cancro e os mecanismos que conduzem a 14-3 migração direccional -3-mediada de células de cancro continua a ser determinado. Os nossos estudos anteriores em células NIH 3T3 têm mostrado que a proteína 14-3-3 a sobre-expressão resulta na activação de Rac1 e p21 quinase activada (Pak) via de sinalização de migração de células mediadoras [24]. No presente estudo, investigamos o papel específico de 14-3-3ζ e sua dimerização na regulação do câncer de próstata (PC3) interações célula-matriz, formação lamellipodia, motilidade em vários matriz extracelular (ECM) proteínas e migração transendotelial através da activação de Rac1. Nossos resultados mostram que a inibição da 14-3-3ζ pode ser uma estratégia terapêutica potencial no câncer de próstata.

Resultados

Proteína 14-3-3ζ aumenta a expressão com a transformação oncogénica em células cancerosas da próstata

estudos anteriores estabeleceram uma relação entre a expressão elevada de incidência 14-3-3ζ e aumento de câncer de próstata em seres humanos [22], [23]. Por isso, procurou-se comparar os níveis de 14-3-3ζ expressão entre os vários murino (TRAMP) e linhas celulares de cancro da próstata. Os nossos dados indicam que, embora 14-3-3ζ é expressa em não-tumorigénico TRAMP (TR-C2D) (transgénicos adenocarcinoma da próstata do rato) linha de células, a sua expressão é significativamente mais elevada em tumorigénico (TR-C2) e metastáticos (TR- linhas C2N) de células TRAMP (

P

0,05) (Figura 1A e B). No entanto, não foi observada diferença significativa na expressão 14-3-3ζ entre LNCaP não metastático e metastático LNCaP C4-2 ou células PC3.

ζ expressão aumenta com a transformação oncogénica em células de câncer de próstata. (A) TRAMP Murino (TR-C2D, TR-C2 e TR-C2N), LNCaP responsivo hormona humana assim como a hormona insensíveis lisados ​​celulares de LNCaP C4-2 e cancro da próstata PC3 foram sujeitos a análise comparativa western blot para 14-3- expressão 3ζ. (B) Quantificação dos dados acima por análise de densitometria banda que mostra o aumento da expressão de 14-3-3ζ em células de cancro da próstata em comparação com as células de murideo TRC2D não tumorigénicas. células PC3 (C-E) foram transfectadas com vector de controlo, WT-14-3-3ζ e DM-14-3-3ζ e foram submetidos a viabilidade (ensaio azul Trypan), Proliferação (MTT), e ensaio de formação de colónia, respectivamente. (*

p Art 0,001; Δ

p Art 0,01; #

p Art 0,05; n = 3).

foi previamente mostrado que a dimerização 14-3-3ζ é necessária para a sua actividade em células [26]. Portanto, o próximo investigado se a expressão e /ou a dimerização da proteína 14-3-3ζ pode mediar funções celulares de cancro da próstata, tais como a proliferação, a viabilidade e a formação de colónias. O nosso estudo indicou que a sobre-expressão de 14-3-3ζ proteína de tipo selvagem (WT-14-3-3ζ) em células PC3 proliferação significativamente aumentada (

P

0,001), viabilidade (

p Art 0,01) e formação de colónias (

p Art 0,05), em comparação com aqueles que expressam vector de controlo só (Figura 1C-e). Em contraste, as células que expressam dímero resistente à proteína mutante 14-3-3ζ (DM-14-3-3ζ), o que impede a sua dimerização em PC3 * células resultou na redução significativa na proliferação (

P

0,01 ), viabilidade (

p Art 0,01) e formação de colónias (

p Art 0,01), em comparação com as células PC3 que expressam vector de controlo (Figura 1C-e). No geral, estes resultados indicam que a expressão e dimerização do 14-3-3ζ é necessário para a função das células de câncer de próstata

in vitro

.

Protein 14-3-3ζ dimerização Unidades de Atividade GTPase Rac1 em as células PC3

o nosso estudo anterior em fibroblastos NIH3T3 mostraram que a proteína 14-3-3 é necessário para a activação de p21 activado e Rac1 cinases 1 e 2 (Pak 02/01) [24]. No presente estudo, determinou-se a sobre-expressão e a dimerização da proteína 14-3-3ζ conduz à activação de Pak1 /Rac1 2-mediada em células de cancro da próstata. O nosso estudo indicou que a sobre-expressão de células PC3 com activação Rac1 WT-14-3-3ζ significativamente melhorada, como evidenciado pelo aumento dos níveis de Rac1 GTP-ligado, em comparação com células de controlo vector que expressa (

P

0,01) (Figura 2A e B). No entanto, com a expressão de DM-14-3-3ζ em células PC3 Rac1 níveis significativamente inibida ligada a GTP em comparação com o controlo (

P

0,05) (Figura 2A e B). Em seguida, determinou-se a expressão 14-3-3ζ e dimerização é necessária para a sua interacção com Rac1. Os nossos dados indicam que, apesar de imunoprecipitação a partir de células de 14-3-3ζ PC3 que expressam WT-14-3-3ζ co-precipitado Rac1 (

P

0,01), esta interacção foi abolida após expressão de células PC3 com MS-14-3-3ζ (Figura 2C e D). Interacção entre 14-3-3ζ e Rac1 em células PC3 foi também conseguida com EGF (

P

0,05). (Figura 2E e F)

ζ expressão e dimerização conduz à activação de Rac1 em células de câncer de próstata. plasmídeos de expressão de (A) de WT-14-3-3ζ e DM-14-3-3ζ juntamente com o vector de controlo foram transfectados para células PC3 e os lisados ​​celulares foram submetidos a ensaio de actividade Rac1 utilizando esferas de sepharose-Pak PBD-glutationa. (B) Quantificação dos dados acima pela análise de densitometria banda mostrando uma relação positiva entre a expressão 14-3-3ζ, dimerização e da atividade Rac1. Bares retratam atividade Rac1 medida pelos níveis de Rac1 GTP ligado. (C) WT-14-3-3ζ e DM-14-3-3ζ plasmídeos de expressão, juntamente com o vector de controlo foram transfectados para células PC3 e os lisados ​​celulares foram sujeitos a imunoprecipitação de 14-3-3ζ e co-precipitação de Rac1 foi analisada . (D) Quantificação dos dados acima por análise de densitometria banda. Bares retratam atividade Rac1 medida pelos níveis de Rac1 GTP ligado. células (E) privadas de soro PC3 foram tratadas com 50? M de EGF durante 12 h e os lisados ​​foram sujeitos a imunoprecipitação de 14-3-3ζ e co-precipitação de Rac1 foi analisada. (F) Quantificação dos dados acima por análise de densitometria banda. Bares retratam atividade Rac1 medida pelos níveis de Rac1 GTP ligado. (*

p Art 0,001; Δ

p Art 0,01; #

p Art 0,05; n = 3).

em seguida, analisou-se 14-3-3ζ Rac1-interacção pode resultar na modulação da actividade de GTPase Rac1-. Em nosso estudo, a sobre-expressão de Rac1 constitutivamente ativa resultou na migração avançada de células PC3 em diversas proteínas da matriz. Do mesmo modo, a expressão com a WT-14-3-3ζ também resultou no aumento da fosforilação da Pak1 /2 (

P

0,001) (Figura 3A e B). Desde níveis basais de Pak1 fosforilada /2 em vetor de controle células PC3 transfectadas eram demasiado baixos, a sobre-expressão com uma DN-Rac1 ou DM-14-3-3ζ não mostrou qualquer alteração significativa no Pak1 2 fosforilação /(Figura 3A e B ). Embora a co-expressão de DM-CA-14-3-3ζ com Rac1 em células PC3 mostraram aumento significativo na Pak1 /2 fosforilação em comparação com células de controlo que expressam o vector (

P

0,001), a co-expressão do DN-Rac1 com WT-14-3-3ζ significativamente prejudicada Pak1 2 fosforilação /(

p Art 0,001). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a activação de Rac1 é a jusante de dimerização 14-3-3ζ.

(A) WT-14-3-3ζ, DM-14-3-3ζ, CA-Rac1 (L

61) e DN-Rac1 (N

17) os plasmídeos de expressão e do vector, isoladamente ou em combinações, foram transfectados para células PC3 e os lisados ​​celulares foram sujeitos a análise de Western de Pak1 fosforilada. (B) Quantificação dos dados acima por análise de densitometria banda. Barras representam a actividade Pak1 como medido pelos níveis de fosforilação. (*

p Art 0,001; Δ

p Art 0,01; #

p Art 0,05; n = 3).

Interação entre Proteínas 14-3-3ζ e Rac1 Melhora Reconhecimento Matrix pelas células PC3

Desde RAC-GTPases são master reguladores de remodelação do citoesqueleto em resposta a sugestões do microambiente extra-celular, que estudamos se a modulação da proteína 14-3-3ζ-Rac1 sinalização em células de cancro da próstata irá ter qualquer efeito sobre a sua capacidade de reconhecer e ligar-se a proteínas de ECM tais como f ibronectina (FN), vitronectina (VN), colagénio I (Coll-I) e laminina (ln ), que são abundantemente expressa em vários tecidos que albergam as células de cancro da próstata. Nosso estudo indicou que, embora a expressão com WT-14-3-3ζ e CA-Rac1 reforçada células PC3 adesão a estas proteínas ECM, expressão com DM-14-3-3ζ ou DN-Rac1 significativamente prejudicada nesse processo (Figura 4A-D) . Enquanto a adesão diminuída pela expressão de DM-14-3-3ζ foi resgatada pela co-expressão com o CA-Rac1, a co-expressão de WT-14-3-3ζ em DN-Rac1 expressando células PC3 não resgatar a adesão celular diminuída (figura 4A-D), indicando que 14-3-3ζ actua a montante da activação Rac1 na regulação das interações célula-matriz PC3.

(AD) WT-14-3-3ζ, DM-14-3- 3ζ, CA-Rac1 (L

61) e DN-Rac1 (N

17) os plasmídeos de expressão e do vector, isoladamente ou em combinações, foram transfectados para células PC3 e células carência de soro foram submetidas a ensaio de adesão de células em extracelular proteínas da matriz como a fibronectina (FN), colágeno tipo I (Coll-1), a laminina (ln) e vitronectina (VN), respectivamente, com uma densidade celular de 1 x 10

4 células /poço na presença de 10 % de FBS. Barras representam o número de células aderidas a PC3 proteínas ECM específicos. (*

p Art 0,001; Δ

p Art 0,01; #

p Art 0,05; n = 3 de quadruplicado).

Protein 14-3-3ζ-Rac1 sinalização regula a formação lamellipodia em células PC3

a nossa análise posterior usando coloração phalloidin de células PC3 que as manchas especificamente citoesqueleto de actina recém-polimerizado indicou que a sobre-expressão com WT-14- 3-3ζ ou CA-Rac1 resultou na formação lamelip�ios aumentada nas células, em comparação com células de controlo do vector que expressa PC3 não tratadas na presença de 10% de FBS (Figura 5A) recém-propagação. Em contraste, a expressão de DM-DN-14-3-3ζ ou Rac1 resultou na formação lamelip�ios reduzida em comparação com células de controlo (Figura 5A). Efeitos semelhantes foram também observados na migração de células PC3 analisados ​​por coloração com faloidina. células PC3 que expressam WT-14-3-3 ou CA-Rac1exhibited formação reforçada lamelip�ios em comparação com células que expressam o vector (Figura 5B). Juntos, estes resultados indicam que a associação 14-3-3ζ-Rac1 está envolvida na formação de lamelip�ios em células de cancro da próstata.

Cooperação

ζ-Rac1 regula a formação lamelip�ios em células PC3. (AB) WT-14-3-3ζ, DM-14-3-3ζ, CA-Rac1 (L

61) e DN-Rac1 (N

17) plasmídeos de expressão e vector, isoladamente ou em combinações, foram transfectados para células PC3, semeadas em câmaras de cultura de células na presença de 10% de FBS e fixados em 40 minutos (a) ou 16 horas (B) após o plaqueamento. células fixas paraformaldeído foram marcadas com Alexa Fluor (vermelho) phalloidin marcadas para detectar citoesqueleto de actina e lamellipodia recém-polimerizado.

A cooperação entre Protein 14-3-3ζ e Rac1 Melhora a EGF-estimulado PC3 Cell Migration direcional e transendotelial migração

em seguida, examinamos se 14-3-3ζ desempenha um papel na migração de células de câncer de próstata. Para fazer isso, transfectadas células LNCaP andrógeno responsivo e células PC3 andrógeno-insensitive com WT-14-3-3ζ e DM-14-3-3ζ e sujeitou-os para o ensaio de migração em placas de 24 poços na presença e na ausência de EGF. Os nossos resultados mostraram que enquanto a expressão de ambas as LNCaP e PC3 células com a migração de células WT-14-3-3ζ significativamente aumentada em comparação com células de controlo do vector de expressão (

P

0,05) na presença de EGF, com expressão MS-14-3-3ζ resultou na migração de células deficiente após 24 h (

P

0,01 para células PC3 e

P

0,05 para células LNCaP) (Figura 6A e C) . Embora uma tendência similar foi observada na ausência do EGF, os dados não era estatisticamente significativa (Figura 6B e D).

LNCaP e PC3 a migração celular. (A-D) WT-14-3-3ζ e DM-14-3-3ζ plasmídeos de expressão ou vector de controlo foram transfectadas para LNCaP e células PC3. As células foram então submetidas a ensaio de migração de células através de um arranhão feito na monocamada de células. Barras representam a migração de células PC3 como medido pela sua recuperação zero. (*

p Art 0,001; Δ

p Art 0,01; #

p Art 0,05; n = 4 de quadruplicado).

em seguida, determinou-se 14-3-3ζ Rac1 cooperação é necessária para a migração transendotelial, bem como a migração direccional de células PC3 em resposta a EGF em várias proteínas de ECM que são abundantes em tecidos abrigar células cancerosas da próstata durante as diferentes fases do crescimento do tumor, invasão, migração transendotelial e metástases para tecidos tais como o osso. Nossa análise indicou que, embora a expressão com WT-14-3-3ζ e CA-Rac1 aumentou significativamente a migração de células PC3 em proteínas da MEC, como FN, VN, LN, sialoprote�a óssea (BSP; osteopontina) e SPARC (Osteonectina), expressão com MS-14-3-3ζ ou DN-Rac1 prejudicada significativamente a migração direccional de células PC3 (Figura 7A-F). Da mesma forma, enquanto que a expressão com WT-14-3-3ζ ou CA-Rac1 aumentou significativamente a migração transendotelial de células PC3, expressão com DM-14-3-3ζ ou DN-Rac1 significativamente prejudicada a migração transendotelial de células PC3 (Figura 8A-C) . Considerando que a migração de células PC3 prejudicada pela expressão DM-14-3-3ζ foi resgatado por co-expressão com CA-Rac1, motilidade deficiente e migração transendotelial pelo DN-Rac1 expressando células PC3 não foi resgatado por co-expressão com WT-14-3 -3ζ (Figura 8A-C). Colectivamente, os nossos resultados demonstram o papel de 14-3-3ζ na mediação Rac1 activação necessária para a migração celular PC3 e a migração transendotelial.

Migração celular PC3

ζ-mediada. (AF) WT-14-3-3ζ, DM-14-3-3ζ, CA-Rac1 (L

61) e DN-Rac1 (N

17) plasmídeos de expressão e vector, isoladamente ou em combinações, foram transfectados para células PC3 e as células foram submetidas a ensaio de migração de células sobre plástico ou proteínas da matriz extracelular, tais como fibronectina (FN), a laminina (ln) e vitronectina (VN), osteonectina (SPARC) e osso sialoproteína (BSP; osteopontina), respectivamente . Barras representam a migração de células PC3 em diversas proteínas da MEC, conforme medido pela sua recuperação zero. (*

p Art 0,001; Δ

p Art 0,01; #

p Art 0,05; n = 4 de quadruplicado).

activação Rac1

ζ mediada PC3 regula a migração transendotelial de células. (AB) WT-14-3-3ζ, DM-14-3-3ζ, CA-Rac1 (L

61) e DN-Rac1 (N

17) os plasmídeos de expressão, vector de controlo, bem como uma combinação de DN-Rac1 e WT-14-3-3ζ, foram transfectados para células PC3 e as células foram sujeitas a migração transendotelial de ensaio

in vitro utilizando

ICE. (C) Análise de migração transendotelial de células PC3 em 1,5 h após a introdução das células endoteliais em monocamada ECIS fichas de matriz que demonstram o papel da dimerização na activação do 14-3-3ζ Rac1 na mediação da migração transendotelial de células PC3 (Δ

p Art 0,01; #

p Art 0,05; n = 5)

Discussão

A observação principal do nosso estudo é que. expressão com 14-3-3ζ proteína em células PC3 resultados nas interações célula-ECM melhoradas, formação lamellipodia, migração celular e migração transendotelial via ativação de Rac1-GTPase. Nós relatado anteriormente que a sobre-expressão da proteína resulta numa maior actividade 14-3-3β Rac1 e Pak em células NIH 3T3, o que resulta em activação aumentada de integrina, formação lamelip�ios, a migração celular e formação da matriz extracelular [24]. Também mostraram que a activação de Rac1-Pak1 via 2 /está envolvido na transformação oncogénica de células Rat-1a [25], o que implica que pelo mecanismo semelhante 14-3-3ζ em células cancerosas podem melhorar o crescimento do tumor, a migração transendotelial e metástase. No presente estudo, observou-se que a expressão com WT-14-3-3ζ em células PC3 resultou na adesão reforçada e migração em várias proteínas da MEC, que são abundantes em tecidos que abrigam células de câncer de próstata durante os vários estágios de invasão das células tumorais, migração e metástase óssea trans-vascular. No entanto a sobre-expressão de um mutante de 14-3-3ζ (DM-14-3-3ζ), que tem sido mostrado previamente para evitar a sua dimerização [26], em células PC3 não apresentam estes efeitos, não resultou na célula deficiente adesão e migração em comparação com células de controlo PC3. Enquanto expressão WT-14-3-3ζ resultou na formação lamelip�ios melhorada e um aumento da actividade de GTPase Rac1-como evidenciado pela fosforilação aumentada de Pak1 /2, com expressão de DM-14-3-3ζ oposição estes efeitos. Além disso, os nossos dados indicam que a dimerização da proteína 14-3-3ζ é necessário para a activação de Rac1, que por sua vez, regula a motilidade e a migração transendotelial de células cancerosas da próstata. Ao todo, o nosso estudo mostra uma associação direta entre 14-3-3ζ proteína e Rac1 na regulação da interação ECM com células PC3, sua motilidade e migração transendotelial, e que a prevenção da dimerização do 14-3-3ζ pode inibir estes efeitos.

Embora o papel das proteínas 14-3-3 em sobrevivência e proliferação das células tem sido extensivamente estudada, o papel específico de 14-3-3s na regulação das interacções célula-matriz, motilidade e invasão transendotelial e os mecanismos moleculares regulando o processo não está claramente entendido. interacções célula-matriz e migração são as propriedades principais das células cancerosas metastáticas, e o primeiro passo deste processo envolve a remodelação do citoesqueleto, controlada principalmente por pequenas GTPases Rho [27] .Duas estudos independentes proteína quinase identificado D (PKD) como um candidato proteína associada com a formação de F-actina e interage com 14-3-3 na regulação da montagem do citoesqueleto [28], [29]. No entanto, PKD foi envolvido em uma regulação negativa da remodelação do citoesqueleto ativo na ponta com sobre-expressão de PKD constitutivamente activa resultando na migração celular prejudicada através da ativação da RhoA. Outros mecanismos que têm sido implicados na migração celular mediada por 14-3-3 incluem o seu envolvimento na inactivação de cortactina, uma proteína de ligação à actina, através da fosforilação mediada por PKD em Ser298, que conduz à inibição da migração das células [30].

Estudos durante a última década têm revelado a importância de proteínas 14-3-3 na regulação positiva da migração de células envolvendo Rac1-GTPases. A evidência inicial de 14-3-3 e Rac1 associação foi relatada pela primeira vez em um modelo celular de CHO [31]. Nosso laboratório tem demonstrado que 14-3-3β ativa Rac1 e Pak1 sinalização na regulação da interação célula-matriz NIH 3T3, migração e formação da matriz extracelular através de modulação de afinidade de α integrina

5β

1 [24]. Também mostramos que a expressão com resultados 14-3-3β na translocação de Rac1 aos plissados ​​membrana que aumenta a actividade e formação Pak1 lamelip�ios em células NIH3T3. Depois disso, um estudo mais recente indica que 14-3-3 controla a mecânica celulares e citocinese em

Dictyostelium

via coordenação da actividade Rac1, miosina II e microtúbulos [32]. No entanto, não há outros relatórios sobre a associação de 14-3-3 e Rac1-GTPases na regulação da migração celular de todas as células cancerosas. No estudo atual, os nossos resultados indicam que a sobre-expressão dos resultados WT-14-3-3ζ na formação lamellipodia na difusão e migração de células PC3 semelhantes a Rac1 células que expressam constitutivamente ativo. Em contraste, a formação lamelipodia inibida DM-14-3-3ζ. Os resultados de ensaio de actividade de fosforilação e Rac1 Pak1 /2, um substrato a jusante da RAC-GTPases, indicaram ambas que 14-3-3ζ activa Rac1. Além disso, o facto de que a co-expressão com DM-14-3-3ζ não inibiu a fosforilação de Pak1 /2 mediada por expressão com CA-Rac1 indicar que a dimerização é 14-3-3ζ a montante da activação Rac1. Embora o mecanismo exato pelo qual 14-3-3ζ regula a atividade Rac1 em células de câncer de próstata não é evidente a partir de nossos resultados, um possível mecanismo seria a interação de 14-3-3ζ com um de seus fatores de câmbio nucleótido guanina (GEF) e a sua entrega ao Rac1 resultando na sua activação.

Entre os 14-3-3 isoformas, a expressão aumentada de 14-3-3ζ tem sido implicada para desenvolver resistência dos tumores à quimioterapia, incluindo o cancro da próstata [21], [33]. Em contraste, a regulação negativa da expressão de 14-3-3 sensibiliza as células de cancro a drogas quimioterapêuticas [2], [20], incluindo o cancro da próstata [21], implicando o potencial terapêutico de 14-3-3ζ para a terapia do cancro. Os avanços recentes em SiRNA knockdown base de proteínas 14-3-3, bem como os inibidores de péptidos que impedem a dimerização de 14-3-3, tais como R18 (difopein, um dímero de R18) [34] ou de compostos de moléculas pequenas, tais como FOBISIN 101 [35 ] mostra a promessa de desenvolver anti 14-3-3-terapia para o câncer.

em conclusão, nós identificamos 14-3-3ζ e Rac1 como novos parceiros na via que regulam as interações célula-matriz câncer de próstata, motilidade em resposta a estímulos invasivos e metastáticas, bem como para intravasamento de células cancerosas da próstata. Nossos resultados indicam que 14-3-3 é um alvo potencial para intervenções terapêuticas no câncer de próstata.

Métodos

Os reagentes, as linhas celulares e anticorpos

PC3 humano, LNCaP e células LNCaP C4-2 (ATCC, Manassas, VA) foram usadas e mantidas em DMEM-elevado teor de glucose (Hyclone, Thermo Scientific, Logan, UT) com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina, em um CO 5%

2 atmosfera a 37 ° C. TRAMP murino (TR-C2D, TR-C2 e TR-C2N) células foram dotados pelo Dr. Barabara Foster, Baylor College of Medicine, TX. Os anticorpos primários contra a fosfo-Pak1 /2 Ser144 /142, 14-3-3ζ e pan-proteína-14-3-3 foram adquiridos a partir de Cell Signaling (Boston, MA). Anti-anticorpos Rac1, fibronectina e laminina foram obtidos da BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ). Os anticorpos primários contra β-actina foram adquiridos a partir de Sigma, St. Louis, MO. Todos os anticorpos secundários foram obtidos a partir de BioRad (Hercules, CA). faloidina marcada com Alexa Fluor555 foi adquirido de Invitrogen (Carlsbad, CA). Osteopontina (sialoprote�a Bone), osteonectina (SPARC) e vitronectina foram adquiridos de R . D Systems (Minneapolis, MN)

Transient Transfec�es

células PC3 humanos foram transitoriamente transfectadas com plasmídeos pEBG WT 14-3-3ζ (GST tag), DM-14-3-3ζ (dimerização resistente 14-3-3ζ-GST etiquetado; 14-3-3 E5K, L12AE para Q12QR, Y82Q, K85N, e E87Q), CA -Rac1 (Rac1-L

61) e DN-Rac1 (Rac1-N

17) construções, respectivamente, ou em combinações de WT-14-3-3ζ com DN-Rac1 (Rac1-N

17) constrói e DM-CA-14-3-3ζ com Rac1 (Rac1-L

61), utilizando lipofectamina 2000 Invitrogen (Carlsbad, CA), o reagente de transfecção de acordo com o protocolo do fabricante. Proteína 14-3-3 construções, inicialmente gerados por Joseph Avruch laboratório, Hospital Geral de Massachusetts, Boston foram obtidos a partir Addgene, Cambridge, MA. As células de controlo foram transfectadas transientemente com o vector vazio pBabe-puromicina. Cerca de 70-80% obteve-se a eficiência da transfecção.

Rac1 Activation Assay

Rac1 actividade foi medida utilizando um kit de ensaio de actividade de RAC do citoesqueleto (Denver, CO) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, o domínio de PBD de PAK fundida com glutationa

S

-transferase (GST) e conjugado com pérolas de glutationa-Sefarose 4B foram misturadas com 1 mg de proteína total no lisado a partir de células PC3 transfectadas transientemente com WT-14- 3-3ζ, DM-14-3-3ζ, CA-Rac1, ou DN-Rac1 plasmídeos ou em combinações de CA-14-3-3ζ com DN-Rac1 e DM-14-3-3ζ com CA-Rac1, seguido por incubação a 4 ° C durante 1 h. As esferas foram recolhidas por centrifugação e foram lavadas três vezes com tampão de lavagem com inibidores de protease completos 1X (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) e duas vezes com 1X PBS. As proteínas foram eluídas por pérolas em tampão de amostra de Laemmli 2X (BioRad, Hercules, CA) em ebulição durante 5 min, separadas num gel de SDS-poliacrilamida a 12% e colocados a hibridar com anticorpos Rac1.

Avaliação da Viabilidade de Azul de Tripano

As células foram cultivadas até à confluência em DMEM com FBS a 10%. As células foram plaqueadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5 x 10

3 células /100 uL de DMEM e deixadas aderir durante a noite. Após isso, as células foram transfectadas com os respectivos plasmídeos e cultivadas durante 48 h. As células foram então cultivadas durante um adicional de 24 h em condições isentas de soro. As células foram então colhidas através de tripsinização, coradas com uma solução de azul de tripano (0,04% w /v, Invitrogen, Carlsbad, CA), e contou-se utilizando a hemocitómetro. As células totais e de tripano azul-corados (ou seja, não viáveis) células foram contadas, e a percentagem de células não viáveis ​​foi calculada.

Ensaio de Proliferação Celular

Proliferação de linhas de células PC3 foi determinada utilizando o não radioactivo ensaio de proliferação de células à base de BrdU (Roche Applied Science), de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células PC3 transfectadas foram plaqueadas em placas de 96 poços de fundo plano a uma densidade de 5 x 10

3 células por 100 uL, e deixou-se crescer durante 48 h. As células foram então cultivadas durante um adicional de 24 h em condições isentas de soro. As células PC3 foram então submetidas a um ensaio de 5-bromo-2-desoxiuridina utilizando a marcação BrdU e kit de detecção III (Roche Applied Science), de acordo com o protocolo do fabricante. Incorporação de BrdU no ADN foi determinada por medição da absorvância a 450 e 690 ambos nm num leitor de placas de ELISA. Os dados são apresentados como média ± DP

Formação de Colónias Ensaio

ensaio de formação de colónias foi realizada utilizando o protocolo padrão [36].