Sumário
fixados em formalina e tecidos humanos embebidos em parafina ressecada durante a cirurgia de câncer é indispensável para fins diagnósticos e terapêuticos e representa um recurso vasto e em grande parte inexplorado de investigação. A microscopia óptica desta amostra é limitada pela resolução limitado por difração de microscopia óptica convencional. Para superar esta limitação, utilizou-se microscopia de super-resolução STED permitindo resolução óptica bem abaixo da barreira de difracção. Visualizamos distribuições de proteína em nanoescala nas seções de tecido de cancro rectal bem anotado parafinado humano armazenado em um repositório clínica. Utilizando anti-soros contra várias proteínas mitocondriais, microscopia STED revelou distribuições de proteína sub-mitocondrial distintas, sugerindo um elevado nível de conservação estrutural. A análise de tecidos humanos armazenados por até 17 anos, demonstraram que estas amostras ainda estavam propícios para a microscopia de super-resolução. microscopia STED de secções de HER2 adenocarcinoma rectal positiva revelou detalhes na superfície e distribuição HER2 intracelular que foram borrados nas imagens convencionais correspondentes, demonstrando o potencial da microscopia de super-resolução para explorar o regime nanoescala, até agora, em grande parte inexplorado em tecidos armazenados no Biorepositórios.
Citation: Ilgen P, Stoldt S, Conradi LC, Wurm CA, Rüschoff J, Ghadimi BM, et al. (2014) STED Super-Resolution Microscopia de Tissue Clinical Cancer retal humanos embebidos em parafina. PLoS ONE 9 (7): e101563. doi: 10.1371 /journal.pone.0101563
editor: Anthony Federação das Índias Ocidentais Lo, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 12 Março, 2014; Aceito: 09 de junho de 2014; Publicação: 15 de julho de 2014
Direitos de autor: © 2014 Ilgen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados são incluídos dentro do papel
Financiamento:. Parte do trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft através do Cluster de Excelência “Nanoscale Microscopia e Fisiologia Molecular do Cérebro” eo IMAGINT projecto da UE (Saúde-F5 -2.011-259.881) (tanto para SJ), bem como através da KFO179 “base biológica da resposta do tumor individual em doentes com cancro retal.” os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
competir interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o número de amostras de tecidos humanos armazenados em Biorepositórios (clínicos) foi estimado. em mais de 300 milhões já há 15 anos em os EUA sozinhos [1], [2]. Muitos destes espécimes ter sido fixadas em formalina e embebidos em parafina, um método de preservação clínica padrão que está em uso por mais de um século. Em muitas situações clínicas, tecidos retirados de pacientes com câncer durante cirurgia oncológica é armazenado em blocos de parafina para o diagnóstico, decisão sobre estratégias de tratamento pós-operatório e estudos de acompanhamento, o que representa um recurso vasto e valioso para estudar a patologia e base funcional de muitas doenças malignas.
Para as análises, o tecido embebido em parafina armazenados e anotado, pode ser seccionado, desparafinados, manchado e depois fotografada por microscopia de luz convencional. Em microscopia clássica (fluorescência) a resolução possível é limitada por difracção a cerca de 250 nm, restringir a informação extraíveis a partir de um espécime. Na última década, várias técnicas de microscopia de super-resolução (Nanoscopia) foram desenvolvidos que permitem a superar fundamentalmente o limite de difração, permitindo a microscopia de campo distante com uma resolução substancialmente melhorada [3] – [5].
destas técnicas, depleção de emissão estimulada (STED) microscopia destaca-se como uma abordagem que pode ser usada em conjunto com amostras immunolabeled e que não requer esforços computacionais para gerar a imagem final [6], [7]. Na microscopia STED, um padrão de luz é usado para inibir a fluorescência nas coordenadas da amostra bem definida de tal forma que os recursos adjacentes emitem sequencialmente. A inibição da fluorescência é realizado por emissão estimulada de fluoróforos animado para o estado fundamental. Numa implementação típica microscopia STED os fluoróforos localizados no rebordo exterior de um ponto focal de varrimento de luz de excitação são transitoriamente desligado por desexcitação através de emissão estimulada com um STED-feixe em forma de anel com um zero central. Como consequência, apenas fluoróforos num foco eficaz com um diâmetro de são capazes de fluorescência. Aqui,
λ
é o comprimento de onda,
I
s
é uma característica do fluoróforo, e
I
max
indica a intensidade do elemento de envolvimento pico a zero. Para
I
max
/
I
s Art 1, o foco eficaz se torna muito menor do que o limite de difração. Como consequência, ao contrário de microscópios ópticos baseados em lentes convencionais, a resolução não está mais limitado pelo comprimento de onda.
STED microscopia, portanto, presta-se como uma ferramenta poderosa para abrir o regime nanoescala, até agora, em grande parte inexplorado no arquivado material de tecido humano. Anteriormente, várias técnicas de super-resolução têm sido utilizados para localizações de proteínas imagem em secções de vibratome quimicamente fixos ou em secções de criostato de tecidos de ratinho ou de rato [8] – [10], bem como nas secções de tecidos de plástico incorporado a partir de roedores que expressam proteínas fluorescentes como etiquetas [11], [12]. microscopia STED também tem sido usada para o tecido imagem viva [13] – [15]. Nenhuma destas abordagens podem ser imediatamente transferidos para procedimentos clínicos estabelecidos que requerem procedimentos normalizados e a possibilidade de armazenamento de amostras a longo prazo.
Para investigar se microscopia STED pode ser usado para visualizar as distribuições de proteína no tecido embebido em parafina, nós tecido retal arquivado utilizado câncer que havia sido ressecada durante total de excisão mesorreto (TME-cirurgia) padronizado e foi armazenado em temperatura ambiente por até 17 anos em um repositório de patologia clínica. Este tecido foi escolhida para este estudo porque com uma incidência continuamente crescente, cancro colorectal tornou-se um dos três cancros mais frequentes no mundo ocidental [16]. Um terço dos cânceres colorretais são cancros rectais e apesar dos avanços no diagnóstico e tratamento multimodalidade, usando pré-operatório (neoadjuvante) quimioradioterapia seguido por TME-cirurgia oncológica estendida, o prognóstico a longo prazo de pacientes com cancro rectal localmente avançado é limitado pela ocorrência de metástases distantes em quase 30% dos pacientes [17] – [19]
a desregulação da sinalização através do receptor do factor de crescimento epidérmico humano (HER; também conhecido como ERBB) da família de proteínas tem um papel complexo na. a patogénese de numerosos cancros humanos [20]. Recentemente, foi demonstrado que HER2 é sobre-expresso em ~ 30% do adenocarcinoma rectal localmente avançado primário, clinicamente classificados como União para o Controle Internacional de Câncer (UICC) em estágios II e III [21]. Pouco se sabe sobre a localização subcelular de HER2 em tecidos tumorais.
Neste artigo investigamos a possibilidade de visualizar a distribuição nanoescala de HER2 e outras proteínas usando microscopia de super-resolução STED em tecido de cancro rectal arquivado. Nós demonstramos que até mesmo os tecidos armazenados por mais de uma década em um repositório clínica são passíveis de imagem de super-resolução STED.
Resultados
A microscopia de fluorescência de secções finas
HER2 positivo tecido carcinoma retal, arquivado após a fixação formol e parafina-embedment, foi seccionada em 2 mm fatias grossas. As secções de tecido foram desparafinados e tratado pelo calor durante 45 min para recuperação de antígeno [22]. Depois disso, as secções foram coradas com DAPI para destacar os núcleos e decorado com os anti-soros contra a proteína de membrana integral HER2 e contra a proteína de membrana exterior mitocondrial Tom20, uma proteína essencial expressa em todas as células humanas. A microscopia confocal demonstram a forte expressão de HER2 no tecido do tumor, enquanto que as células do estroma normais circundantes não expressaram uma quantidade relevante de HER2 (Figura 1). massa mitocondrial foi mais elevada nas células malignas e em consequência Tom20 era mais abundante, embora, como esperado, os sinais Tom20 também foram detectável nas células do estroma normais. Além disso, o sinal de DAPI foi reconhecido tanto em células cancerosas e tecido normal. Conclui-se que a rotulagem multi-color imunofluorescência e microscopia confocal é viável em tecido embebido em parafina clínica rotineiramente processadas arquivado.
confocal imagem panorâmica de uma região de uma secção de tecido de câncer retal HER2 positivo marcado com DAPI (azul) para destacar os núcleos e decorado com anti-soros contra Tom20 (fogo) e HER2 (verde). (A) de sobreposição, (B) Tom20, e (C) de HER2. Barras de escala:. 25 um
preservação estrutural em nanoescala
A resolução óptica de microscopia confocal convencional é limitado pela difracção de aproximadamente 200 nm no plano axial, muitas vezes escondendo informações valiosas . tecidos embebidos em parafina supostamente exibem autofluorescência pronunciado [23] e, embora a preservação estrutural possível de tecido embebido em parafina é suficiente para microscopia de luz convencional (Figura 1; [24]), tecidos arquivados podem ser inadequados para atender às altas exigências de difração microscopia de super-resolução ilimitada. Para investigar se rotineiramente processadas tecido humano clínica parafinado armazenado é adequado para microscopia STED, decidimos analisar distribuições de proteína sub-mitocondrial em mitocôndrias. Essas organelas estão desafiando estruturas celulares para a microscopia de super-resolução, devido ao seu pequeno tamanho, a sua complexa arquitetura organelar interior e a embalagem com muito denso de proteínas nas membranas mitocondriais [25]. Para este fim, utilizou-se tecido de cancro rectal em parafina que foi armazenado durante ~ 1 ano à temperatura ambiente em um arquivo de patologia clínica. As secções de tecido que contêm uma secção longitudinal da camada muscular circular interna do recto (
Muscularis externa
) foram decorados com anti-soros contra quatro diferentes proteínas mitocondriais: Tom20, um receptor periférico da translocase TOM na membrana mitocondrial externa; Mic60 (mitofilin), um componente do complexo Minos preferencialmente localizada nas junções cristas na membrana interna; aconitase, uma enzima de matriz do ciclo do ácido tricarboxilico catalisa a isomerização de citrato a isocitrato; e ciclofilina D, a isomerase peptidilprolil localizada na matriz mitocondrial.
A mitocôndria em
Muscularis externa
formam grandes túbulos alongados. Quando os blocos de tecido foram cortados ao longo do eixo longitudinal do espécime rectais ressecados, a maioria dos organelos foi estendido dentro do plano de corte (Figura 2A). Através de uma grande imagem STED do tamanho de 120 mm × 100 mm, Tom20 mostrou uma localização pontuada distinta dentro da mitocôndria (Figura 2A), que está em pleno acordo com estudos anteriores usando várias formas de microscopia de super-resolução em células de mamíferos em cultura [26] , [27]. A resolução alcançada, conforme determinado no fundo-clusters, foi consistentemente ~ 40 nm ao longo das secções de tecido gravados (Figura S1). Considerando que as gravações em confocal correspondentes as distribuições de Tom20, Mic60, aconitase e ciclofilina D foram praticamente indistinguíveis, o mais elevada resolução fornecido por o microscópio STED demonstrou diferenças na distribuição sub-mitocondriais das proteínas respectivas (Figura 2B-E). Tom20, aconitase e ciclofilina D foram encontrados geralmente em grupos distribuídos uniformemente, embora em quantidades diferentes. Secções decoradas com um anti-soro contra a ciclofilina D exibiu o agrupamento mais denso (Figura 2E), enquanto um anti-soro contra aconitase resultou na rotulagem dos clusters esparsos (Figura 2D). Como foi mostrado anteriormente para Mic60 em células em cultura [28], esta proteína parece ter também uma distribuição mais ordenada em tecidos humanos (Figura 2C). A distribuição global de sub-mitocondrial das respectivas proteínas no tecido foi comparável à localização observada em células humanas cultivadas (Figura S2).
STED gravações foram realizadas em 2 uM secções desparafinados de espessura em corte ao longo do eixo longitudinal do do recto. (A) Esquerda: imagem panorâmica STED de uma região da camada circular interna da rectal
Muscularis externa
decorado com um anti-soro contra Tom20. Direita: As ampliações das áreas nas praças tracejadas indicadas mostrando a distribuição dos aglomerados TOM dentro das mitocôndrias. (B-E) Sted imagens de secções de tecido decorado com anti-soros contra Tom20 (B), Mic60 (mitofilin) (C), aconitase (D), e de ciclofilina D (E). Em cada painel de confocal (em cima, à esquerda) e a imagem STED correspondente (topo, direita) é exibido. Parte inferior: ampliação da imagem STED como indicado por um quadrado a tracejado. Nota as diferentes distribuições das quatro proteínas dentro das mitocôndrias. Barras de escala: 20 mm (A, à esquerda); 1