Abstract

Os dados existentes sugerem que a sinalização NF-kappaB é um regulador chave da perda de massa muscular esquelética induzida por câncer. No entanto, a identificação dos componentes desta via de sinalização e de os factores de transcrição NF-kB que regulam desperdício está longe de ser completa. Em músculos do tumor C26 tendo ratos, superexpressão de dominante negativo (D.) IKKβ bloqueada perda de massa muscular em 69% e o repressor IκBα-super bloqueado desperdício em 41%. Em contraste, a sobre-expressão de D.N. IKKα ou D.N. NIK não bloquear desperdício induzido por C26. Surpreendentemente, a sobre-expressão de D.N. p65 ou D.N. c-Rel não afectou significativamente a perda de massa muscular. matrizes de expressão de mRNA de todo o genoma mostrou regulação positiva de muitos genes previamente implicados na atrofia muscular. Para testar se esses genes regulados positivamente foram alvos diretos de fatores de transcrição NF-kB, comparamos ligação ao DNA no controle e muscular caquéticos usando o chip-sequenciação p65 de todo o genoma. análise bioinformática de dados do chip-sequenciação de músculos C26 controle e mostrou muito pouca ligação a genes em caquexia e pouco p65 para sugerir que as influências de ligação p65 regulada positivamente a expressão do gene associado a caquexia base muscular. Os dados do chip-SEQ p65 são consistentes com a nossa descoberta de nenhuma mudança significativa na proteína de ligação a um oligonucleótido de NF-kB num ensaio de desvio em gel, não activação de um repórter NF-kB-dependente, e nenhum efeito de sobre-expressão dnp65 nos músculos tumor de ratos portadores. Tomados em conjunto, estes dados suportam a ideia de que, embora a inibição da IκBα, e particularmente IKKβ, blocos desperdício induzida por cancro, a via de sinalização de NF-kB alternativa não é necessário. Além disso, os factores de transcrição NF-kB a jusante, p65 e c-rel não parecem regular as alterações da transcrição induzida pelo tumor C26. Estes dados são consistentes com o crescente corpo de literatura mostrando que não são substratos NF-kB-independentes da IKKβ e IκBα que regulam os processos fisiológicos

Citation:. Cornwell EW, Mirbod A, Wu CL, Kandarian SC, Jackman RW (2014) perda de massa muscular C26 Cancer-induzida é IKKβ-dependente e NF-kappaB-Independent. PLoS ONE 9 (1): e87776. doi: 10.1371 /journal.pone.0087776

editor: Imed Eddine Gallouzi, McGill University, Canadá |

Recebido: 09 de julho de 2013; Aceito: 30 de dezembro de 2013; Publicação: 29 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Cornwell et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) prêmio AR060217. (https://grants.nih.gov/grants/oer.htm.) Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Conflito de interesses :. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a caquexia é uma condição metabólica associada a muitas doenças crônicas e é caracterizada pela perda de massa severa do músculo esquelético e tecido adiposo, que não pode ser invertido pelo aumento da ingestão calórica [1]. caquexia associada ao câncer é visto na maioria dos cancros avançados, mas é mais comumente visto em cânceres do trato pulmão e do trato gastrointestinal superior [1]. Os pacientes com câncer com caquexia tem uma menor qualidade de vida devido à função imune comprometido, resistência à insulina, fraqueza e fadiga [2]. Pacientes com caquexia, mesmo leve não pode tolerar o tratamento de quimioterapia, o que agrava ainda mais a sua doença [3]. A caquexia é estimado para contribuir para a morte de aproximadamente 30% dos pacientes [4] cancerosas. Por toda a seriedade desta aflição, tratamentos permanecem paliativos. Desde as consequências mais graves de caquexia parecem residir com a perda de músculo esquelético [1], o desenvolvimento de uma melhor compreensão da sinalização celular mecanismos e gene regulação no músculo poderia produzir novas estratégias terapêuticas para o tratamento desta condição.

Research em diferentes tipos de cancro foi sugerido um papel para o NF-kB de sinalização e regulação transcricional de NF-kB na perda muscular [5], [6], [7]. A inibição da via clássica do NF-kB, por sobre-expressão do repressor de super IkappaBalpha (IκBαSR), perda de massa muscular bloqueado no carcinoma do pulmão de Lewis ratinhos portadores de tumor (LLC) em 50% [5]. O factor prototípico de transcrição NF-kB, p65 (Rel A), mostrou aumento da ligação num ensaio de oligonucleótido de NF-kB baseado em ELISA no músculo dos ratinhos com LLC. O aumento da ligação foi revertida quando IκBαSR foi sobre-expresso no músculo, o que sugere que a p65 é um factor de transcrição NF-kB envolvida na perda de massa muscular devido a cancro, pelo menos em ratinhos com LLC [5]. Fosforilação de p65 na serina 536, pensado para aumentar a actividade de transcrição, é aumentada no músculo de ratos portadores de tumores C26 [6] e no músculo de seres humanos com cancro pancreático [8]. Por outro lado, alguns resultados sobre o papel dos factores de transcrição NF-kB na caquexia tem sido equívocos. Por exemplo, os ensaios de desvio em gel mostrou um pequeno aumento na ligação de factores de transcrição para um oligonucleótido de NF-kB nos músculos dos ratos portadores de tumores C26 [6], [9], e noutro estudo, não houve aumento na proteína de ligação a um NF- kB oligonucleótido em ratos caquéticos com hepatoma de ascite Yoshida [10]. É possível que diferentes tipos de cancro induzir a perda de massa muscular através de diferentes mecanismos celulares. No entanto, apenas uma proteína NF-kB de sinalização (IκBα) e fator de transcrição uma NF-kB (p65) foram estudadas em perda de massa muscular induzida por câncer, e, não sabemos a atrofia induzindo genes que são alvo de NF-kB transcrição fatores.

o objetivo do presente estudo foi identificar as proteínas conhecidas de mamíferos NF-kB de sinalização e fatores de transcrição NF-kB que regulam a perda de massa muscular devido ao câncer. Um segundo objectivo foi o de identificar os genes alvo de NF-kB em um nível de todo o genoma, a fim de determinar se uma rede de transcrição NF-kB regula a perda muscular induzida por cancro. Testou-se as proteínas de sinalização de NF-kB são necessários para a perda de massa muscular por sobre-expressam negativo dominante (D.N.) formas de quinases a montante do NF-kB. Estes são o inibidor de alfa-quinase kappaB (IKKα), IKKβ, e a cinase de indução de NF-kB (NIK). O papel de IκBα foi testada por sobreexpressão de uma forma super-repressora de trans-dominante da IκBα (IκBαSR). Se a transcrição NF-kB factores Rel A (p65) ou c-Rel são necessários para a perda de massa muscular foi testada por sobreexpressão de D.N. p65 ou D.N. c-Rel, respectivamente. NF-kB factor de transcrição de ligação a um oligonucleótido de NF-kB e a actividade transcricional de NF-kB de uma repórter foram medidos nos músculos caquéticos. Para determinar se o fator de transcrição NF-kB, p65, genes alvo ligadas canônicos que poderiam estar relacionados à regulação atrofia, realizamos ChIP-seqüenciamento no músculo de ratos de controlo e portadores de tumor em conjunto com a medição da expressão gênica global como uma medida funcional mediada por caquexia expressão do gene.

Este é o primeiro estudo em profundidade sobre o papel da sinalização de NF-kB e de fatores de transcrição NF-kB na regulação da perda de massa muscular devido ao câncer. Embora a inibição da IκBα, e em particular actividade IKKβ, reverteu de forma significativa perda de massa muscular, não houve efeito sobre o desperdício de fibra devido à inibição da IKKα ou NIK. Surpreendentemente, a sobre-expressão de p65 dominante negativo ou c-Rel mostraram pouco ou nenhum efeito sobre a perda de massa da fibra muscular. Além disso, não houve alteração no factor de transcrição NF-kB de ligação num ensaio de desvio em gel ou na actividade repórter de NF-kB. Mais importante, a sobre-regulação de genes de citoquinas ou atrofia encontrados por micromatrizes de expressão génica não estava mediada por factores de transcrição contendo p65 tal como avaliado por Chip-seq. Nossos resultados são consistentes com os de Cai et al. [5] que mostra um papel para IκBα em desperdício do cancro, e pela primeira vez que mostram que IKKβ é necessário para o desenvolvimento de caquexia do cancro, mas IKKα NIK e não são. A nossa análise em profundidade de sinalização de NF-kB e a transcrição durante caquexia de cancro demonstra que a IKKβ é a regulação da expressão génica por outros factores de transcrição NF-kB do que, pelo menos no músculo esquelético durante C26 caquexia do cancro. Estes resultados revelam uma faceta inesperada, mas importante da regulação da perda de massa muscular induzida por câncer.

Métodos

Declaração de Ética

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo Comitê Animal Care Universidade Institucional e Use o Charles River Campus Boston (número de protocolo: 12-016). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia cetamina /xilazina, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. Todas as pessoas que trabalham com animais tenham sido submetidos a treinamento IACUC obrigatório e revisão anual: https://www.bu.edu/orctraining/animal/lacf/

Células

células de adenocarcinoma de C26 (National Cancer. Institute, Frederick, MD) foram plaqueadas e mantidas a 37 ° C, 5% de CO

2 em Dulbecco Modified Eagle Médium, glucose elevada (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Invitrogen), 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen), e 1% de L-glutamina (Invitrogen). Antes da inoculação em ratinhos, as células C26 foram tripsinizadas e lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato e em seguida, re-suspensas numa solução de PBS 1X e Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) 01:01.

Animais

com oito semanas de idade, os ratinhos CDF1 macho adquiridos de Charles River Laboratories (Wilmington, MA, EUA) foram utilizados para todas as experiências. Os ratos foram tratados em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. Os animais foram mantidos em um ciclo de 12:12 L /D, foram alojados individualmente, e tiveram acesso a alimentos e água

ad libitum

. Depois de três dias de aclimatação, os animais foram aleatoriamente atribuídos a um grupo de controlo não-tumoral ou um grupo portador de tumor C26. Os animais de controlo receberam um inoculo de 150 mL 1 × PBS /matrigel (01:01) por via subcutânea na flancos direito e esquerdo. animais portadores de tumor receberam um inoculo de 5,0 x 10

5 C26 células suspensas em 150 ul de PBS /Matrigel (01:01) injectado subcutaneamente nos flancos direito e esquerdo; Isto foi realizado em ratos ligeiramente anestesiados (40 mg /kg de cetamina 5 mg /kg de xilazina).

injecção de DNA de plasmídeo no músculo

O DNA de plasmídeo foi isolado usando o Kit QIAGEN endotoxina mega-Free de acordo com as instruções do fabricante. O DNA de plasmídeo foi injectado em músculo de 10 dias após a inoculação de tumor, tal como descrito anteriormente [11]. Resumidamente, o DNA de plasmídeo foi e re-suspensas em 0,45% de solução salina estéril /DDH

2O precipitado com etanol. Todos os ratinhos que receberam a cirurgia foi dada tratamentos profiláticos com 0,1 mg /kg de Buprenorfina injecção antes da cirurgia. Os ratinhos foram anestesiados com cetamina (80 mg /kg) e xilazina (10 mg /kg). Os tibial anterior (TA) de cada animal foram injectados com 35 ug de plasmídeo de expressão em 25 mL de 0,45% de solução salina estéril usando uma seringa de insulina 29-gauge. Após a injeção do plasmídeo, músculos foram estimulados com uma corrente elétrica de baixa tensão usando eletrodos de dois remo [12] que entregue 6 pulsos de 86 V /cm durante 20 ms, com um intervalo interpulse de 200 ms (Electro Praça Porator ECM 830, BTX) . Este é um protocolo de electroporação baixa dose que não induz danos [13], [14], [15]. No dia 25 pós-inoculação, músculos TA foram removidas de ambos os ratos portadores de tumores C26 controlo e, pesados, e ou congelados instantaneamente em azoto líquido para a análise bioquímica ou montado sobre os depressores de língua, incorporado no meio de congelamento de tecidos, e congelados em isopentano arrefecido em azoto líquido para análise histoquímica. A injecção do plasmídeo repórter de NF-kB foi feito no mesmo dia que a inoculação das células de tumor. A injeção de d.n.p65-EGFP foi feito no dia 6 após a inoculação do tumor

Os plasmídeos

Os plasmídeos de expressão utilizados foram os seguintes:. D.N. IKKα-EGFP, D.N. IKKβ-EGFP, IκBαSR-EGFP, D.N. NIK-GFP, D.N. p65-EGFP, e D.N. c-Rel-EGFP. O D.N. IKKα-EGFP (K44M) e D.N. IKKβ-EGFP (K44M) plasmídeos de expressão codificam proteínas de fusão EGFP de formas cinase-dead de IKKα e IKKβ que descrevemos em detalhe [11]. Nós também construído o plasmídeo de fusão EGFP-IκBαSR que descrevemos em pormenor [16]. O D.N. p65 (313) é uma forma truncada de p65 em falta os domínios de transactivação C-terminal e foi um presente de D. Guttridge [17]. Criamos um D.N. plasmídeo de fusão p65-EGFP por clonagem da sequência de ADN N-terminal de 313 amino-ácido de codificação de p65 nos sítios HindIII-SalI de pEGFP-N1 (313 + 238 = 551 a.a.). Verificou-se a clonagem por sequenciação do plasmídeo e testou a função negativa dominante em miotubos C2C12, em que o D.N. p65-EGFP foi capaz de bloquear a activação de TNF de um repórter de NF-kB por 90% (Figura S1A). Para a criação de um D.N. c-Rel-EGFP plasmídeo, foi utilizado um rato modelo de c-Rel, um presente de T. Gilmore, copiar a sequência de ácido nucleico para o domínio de homologia Rel da contendo a.a. gene 1-288 (faltando os dois domínios de transactivação do terminal N) e a adição de sítios de restrição para clonar o fragmento em grelha nos locais EcoRI-Kpnl de pEGFP-N1. O D.N. resultante c-Rel-EGFP inserção foi verificada por sequenciação e funcionava como um Rel dominante negativo porque a sua expressão reduzida níveis repórter NF-kB em C2C12 miotubos (Figura s1b). O D.N. plasmídeo de expressão NIK-GFP, um presente de A. Kumar, codifica uma forma morta cinase da NIK e EGFP de um cistrão separado [18].

Imuno-histoquímica

áreas fibra muscular TA cross-seccionais de fibras transfectadas com plasmídeo (que expressam proteínas de fusão de fluorescência verde) foram comparados a áreas de fibra nos mesmos domínios que não ocupam o plasmídeo em ratos portadores de tumor e controle. Tal como descrito anteriormente [11], secções congeladas foram tomadas a partir do meio da barriga da TA (7,5 um de espessura), montadas em lâminas de tecido de aderência microscópio (Polysciences, Inc., Warrington, PA, EUA) e fixados em paraformaldeído a 4%. Secções transversais foram lavadas, bloqueadas em 10% de BSA e incubadas com anticorpo de coelho anti-laminina 1:200 (L9393, Sigma-Aldrich) em 1% de BSA, seguido por um anticorpo secundário Texas Red-X de cabra anti-IgG de coelho conjugado com corante fluorescente 1 :200 (T-6391; Invitrogen). As secções foram montadas em lâminas com meio de montagem Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Imagens foram visualizados com ampliação de 20x utilizando um microscópio de luz invertido (Nikon Eclipse TS 100). Todas as imagens foram capturadas com uma câmera SPOT RT (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI, EUA). Fibra área transversal foi calculada usando o Imaging System Meta-Morph (Universal Imaging, Glendale, WI, EUA). O número médio de fibras medidas per muscular foi 200. controles

O isolamento de extractos nucleares bruto

extractos nucleares brutos de músculos dos membros posteriores de ratos machos CD2F1 13 a 23 dia C26-inoculado e idade combinados foram isolados de acordo com Kumar e Boriek [19], com algumas modificações. Todos os passos de isolamento e rotações foram efectuadas a 4 ° C utilizando tampões refrigerados. músculos congelados flash foram suspensas a 1 mg de peso muscular por 18 ul de tampão (HEPES 10 mM [pH 7,9], KCl 10 mM, MgCl2 3 mM, EDTA 0,1 mM [pH 8], 0,1 mM de EGTA, 0,1% de Triton X-100 , ditiotreitol 1 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 0,5, e mistura de inibidores de protease) e imediatamente homogeneizados em gelo. músculos homogeneizados foram incubados em gelo durante 5 min, seguido por 20 segundos de vórtex vigoroso. Os núcleos foram centrifugados a 3000 ×

g Compra de 10 min. O sobrenadante foi removido e armazenado a -80 ° C. pastilhas nucleares foram lavados com 1 mL de tampão de extracto citoplasmático modificado sem Triton X-100 e centrifugada a 3000 ×

g

durante 3 min. As peletes foram ressuspensas em 4 ul de tampão de extracto nuclear (HEPES 20 mM [pH 7,9], NaCl 420 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, glicerol a 25%, ditiotreitol 1 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 0,5, e mistura de inibidores de protease) por mg de peso do músculo originais. Re-suspendeu peletes nucleares foram incubadas em gelo durante 30 min, com 15 s de vórtice vigoroso a cada 10 min. As amostras foram centrifugadas a 16000 ×

g

durante 20 min e o extracto nuclear (sobrenadante) foi removido e armazenado a -80 ° C.

electroforética ensaio de desvio de mobilidade (EMSA)

a concentração de proteínas de extractos nucleares musculares em bruto foi determinada utilizando o ensaio de Bradford (Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA). De cadeia dupla de NF-kB IRDye 700 tinta infravermelha oligonucleótido marcado na extremidade, 5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3 ‘(sublinhado indica NF-kB local de ligação), foi adquirido a partir de LI-COR Biosciences (Lincoln, NE, EUA). Consenso competidor não marcado NF-kB oligonucleótido foi adquirido a partir de tecnologias de ADN integradas, Inc. (Coralville, IA, EUA). reacção de ligação EMSA foi realizada utilizando Odyssey Kit Tampão EMSA (LI-COR Biosciences) com algumas modificações. volume de reacção total foi preparado em 20 ul. Binding reagentes de reacção foram adicionados a água purificada na seguinte ordem: 2 uL de tampão de ligação (Tris 100 mM, KCl a 500 mM, DTT a 10 mM; pH 7,5), 2 uL de DTT a 25 mM /2,5% de Tween-20, 1 ug /poli ul dI • dC em Tris 10 mM, EDTA 1 mM; pH 7,5, 50 fmol de NF-kB IRDye 700 tinta infravermelha oligonucleótido marcado na extremidade, e 15-20 ug de extracto nuclear. Em reacções com concorrente não marcado NF-kB, não marcado e os oligonucleótidos marcados foram misturados antes da adição à reacção de ligação. As reacções de ligação foram suavemente misturadas e incubadas durante 25 min, à temperatura ambiente, no escuro. Antes de se colocar as amostras, 2 ul de laranja corante (65% w /v de sacarose, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM de EDTA, 0,3% w /v de laranja L) foi adicionada à reacção 20 mL e misturou-se suavemente.

complexos DNA-proteína foram separados do oligonucleótido livre não desnaturante em 5% de Tris-borato-EDTA, página Pronto geles (Bio-Rad Laboratories, Inc.). As amostras foram sujeitas a electroforese a 76 V durante 2 horas à temperatura ambiente no escuro. A proteína ligada aos complexos oligonucleotídicas marcadas foram visualizadas utilizando um Odyssey infravermelhos (LI-COR Biosciences).

repórter actividade de NF-kB-dependente

Nos pontos de tempo indicados, músculos TA transfectada com um NF-kB-dependente repórter de luciferase foram recolhidas e, em seguida, homogeneizada em 1 ml de Tampão de lise passiva (Promega, Madison, WI) com os inibidores da protease e da fosfatase (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Os homogenatos foram centrifugados a 5000 ×

g

a 4 ° C durante 20 minutos. O sobrenadante foi recolhido e misturado com Reagente de Ensaio da Luciferase (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. A actividade da luciferase foi medida por um TD-20/20 luminómetro (Turner Designs, Sunnyvale, CA, EUA).

foi determinada análise Western blot

A concentração de proteína de lisados ​​musculares em tampão de lise passiva utilizando o ensaio de Bradford (Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Cinquenta a 75 microgramas de proteína foi desnaturada e fraccionado em tamanho 4-15% de gel SDS-poliacrilamida. As proteínas foram transferidas para uma membrana Immobilon-FL fluoreto de polivinilideno (Millipore, Bedford, PA, EUA), bloqueadas em Odyssey tampão de bloqueio (LiCor Biotecnologia, Lincoln, NE, EUA) e incubados com o anticorpo primário apropriado de acordo com as instruções do fabricante. Os anticorpos incluíram: anti-IKKα /IKK1 (IMG-5477, Imgenex, San Diego, CA, EUA), IKKβ /IKK2 (# 2684), NF-κB2 (p100 /p52; # 4882), e p-IκBα (# 9246 ) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA), IκBα (SC-371), NF-kB p65 (sc-7151), c-Rel (sc-6363), e NIK (sc-7211) (Biotecnologia Santa Cruz , Santa Cruz, CA, EUA). Anti-GAPDH (L-9545) foi utilizada como um controlo de carga (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Alexa Fluor 680 corante fluorescente conjugado foi utilizado anticorpo secundário (Invitrogen) para visualização com o sistema de imageamento infravermelho Li-Cor Odyssey descrito anteriormente [20].

isolamento do RNA

músculos gastrocnêmio e plantar foram colhido de controlo anestesiado e ratos portadores de tumor (25 dias pós-inoculação), congelados instantaneamente em azoto líquido, e armazenado a -80 ° C até posterior processamento. O RNA total foi extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O ARN total extraído foi adicionalmente purificado utilizando um kit de DNase I sem RNase (Qiagen, Valencia, CA, EUA) e um RNeasy Mini Kit (Qiagen), como descrito anteriormente [21]. RNA extraído foi quantificado por espectrofotometria de UV e qualidade verificada por um 1% desnaturante em gel de agarose. As amostras também foram verificados por análise Bioanalyzer 2100 e tinha um número RIN mínima de 8,0 (Agilent, Palo Alto, CA, EUA).

análise Microarray

Para a análise de microarray, as amostras de RNA acima descrita foram enviados para a Facilidade de Boston University Medical Center Microarray Núcleo de amplificação de rotulagem, e hibridação em um mouse Gene Affymetrix 1,0 matriz ST (Santa Clara, CA, EUA) por instruções do fabricante para medir a expressão de 28,132 genes bem anotados. Um total de 6 imagens de matriz (amostras do músculo 3 de controle e 3 C26 amostras musculares) foram adquiridos pela GeneChip Scanner 3000 TG e qualidade avaliados pela Affymetrix Expressão Console (Santa Clara, CA, EUA). valores de sinal de expressão de genes foram gerados pelo módulo de Ficheiro Criador Expressão da plataforma GenePattern (Broad Institute, Cambridge, MA) e robusto algoritmo de análise de multi-matriz (RMA) foi utilizado para o pré-processamento de dados [22]. Brainarray MoGene 1.0 ST costume arquivo CDF v.13 foi usada para anotação sonda [23]. . Ambos

cel

arquivos e valores de expressão foram depositados em Miame compatível Gene Expression Omnibus NCBI com o número de acesso: GSE48363 (link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc. cgi símbolo = rnupvmqqyocggpk ? acc = GSE48363). expressão gênica diferencial foi calculado usando o módulo de selecção comparativo marcador em GenePattern que compara diferenças médias entre grupos C26 controle e por bidirecionais paramétricos testes t. Parâmetros utilizados para identificar genes que foram diferencialmente expressos em músculo de ratinhos portadores de tumor foram:

P

-value≤0.05,

Q

-value≤0.05, e dobrar mudar maior do que 1,5 vezes . As listas de genes para cima ou para baixo-regulados foram enviados para o banco de dados DAVID Bioinformática para anotação funcional e para a atribuição de ontologia gênica baseada no processo biológica dos genes em comparação com a de

mus musculus

genoma onde o limiar de EASE score (a Fisher modificado Exact P-value) foi fixado em 0,01 e uma contagem mínima gene de 2.

ChIP-sequenciação

músculos gastrocnêmio e plantar foram isolados a partir de controlo (ou seja, não-tumoral -bearing) e C26 ratos no dia 25 de inoculação pós tumor portador de tumor. Recentemente dissecados músculo foi picada e reticulado em formaldeído a 1% durante 15 minutos, extinguiu-se com glicina e então congelados em azoto líquido. Para cada condição (isto é, controlo ou C26) plantares músculo de quatro pernas foram reunidas, homogeneizadas, e cromatina isolada como descrito anteriormente [21]. Este material foi sonicado para produzir fragmentos de cromatina que estavam, em média, de 250 pb. Uma alíquota da cromatina sonicado foi posta de lado para ser usada como a fracção de entrada para Chip-PCR. O resto da cromatina foi diluída em tampão IP e dividido em um grupo de incubação com o anticorpo p65 (Santa Cruz SC-372X) e um grupo sem qualquer anticorpo primário; isso foi feito para cromatina de ambos os grupos C26 controle e. As amostras com e sem anticorpo primário foram incubados durante 16 horas a 4 ° C com mistura constante baixa velocidade e, em seguida, os complexos de anticorpo-cromatina foram capturados com pérolas de proteína G magnéticos. A cromatina foi eluída a partir das contas e reticulações invertidas, seguido por tratamento com pronase /RNase e precipitação do DNA. Um décimo do material foi utilizado para a PCR para um gene já demonstrado ter robusto de ligação, a fim de testar o chip p65 p65. Três bibliotecas diferentes de DNA foram feitas: o controle de cavacos p65, p65 C26 Chip, e chip sem anticorpo primário. As bibliotecas foram preparadas para a sequenciação de alto rendimento utilizando o kit de biblioteca Ilumina-ChIP SEQ. Uma alíquota de cada biblioteca foi examinada por electroforese em acrilamida e coloração Sybr-ouro para estimar a qualidade por tamanho e a intensidade do produto, que aparece como uma mancha com um tamanho médio de 350 pb. Todo o procedimento para fazer as três bibliotecas foi repetido uma segunda vez com as novas amostras de músculo, de modo a ter duas bibliotecas Chip-seq para cada um dos três grupos. As bibliotecas foram enviados para o Instituto Whitehead (Cambridge, MA), onde foram limpos de dímeros adaptador usando pérolas Ampure XL. As bibliotecas limpas foram testados por qPCR Bioanalyzer e de controlo de qualidade foi realizado a fim de determinar a quantidade de cada biblioteca a utilizar. As bibliotecas foram sequenciados utilizando Illumina Solexa sequenciação num sequenciador GA II. As sequências resultantes de amostras C26 controle e foram alinhados ao genoma do rato (versão MM9) usando ELAND. As sequências foram enviados para o nosso laboratório no formato ELAND.

Os alinhamentos para as duas amostras de controlo independentes foram reunidas e o mesmo foi feito para as duas amostras de C26. Em cada caso, isso foi feito através da combinação das formas .bam dos alinhamentos no site do Galaxy. As sequências foram então avaliados com o pacote de FastQC de testes de controlo de qualidade, o qual foi obtido como um programa independente a partir do Instituto Brabaham (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). Após a análise FastQ inicial duas operações foram realizadas nos dados ChIP-seq: 1. nós removemos duplicatas PCR utilizando samtools rmdup via Galaxy e 2. novamente usando samtools, aproveitamos os rótulos de mapeamento nos dados Eland para isolar só lê mapeados em locais únicas no genoma do rato. Sequência de leituras eram 35 ou 36 pares de bases. Os três arquivos de dados do chip-seq foram: controle de cavacos p65 (10,7 milhões lê), C26 p65 chip (11,1 milhões leituras), e uma sequência de fundo arquivo que representa lê (8,5 milhões) obtido através da combinação de controle e C26 sonicada cromatina, que foi executado através do chip sem um anticorpo primário (sem grupo de anticorpos). Esses arquivos três seqüência de pós-QC .bam estão disponíveis online em: (https://drive.google.com/folderview?id=0B0Ph0YwXvamQektEaTFkcElSLTQ usp=sharing) As sequências alinhadas foram convertidos para .sam formato e, em seguida, enviados para o pico programa localizador em ChIPseeqer [24] com os seguintes parâmetros: 1. limiar = 5, 2. mudança dobra = 2 ou mais (em comparação com o fundo), 3. fragmento de comprimento de 250 pb =, 4. comprimento de pico, pelo menos, 100 pb e 5 . separação de pico, pelo menos, 100 pares de bases. Em adição à identificação de p65 e de controlo C26 picos relativos ao fundo (sem anticorpo), ChIPseeqer identificada a região do gene da p65 picos de ligação (isto é, a localização genómica dos picos).

Os grupos de controlo e C26 picos de p65 foram executados em PeakAnalyzer [25] (https://www.ebi.ac.uk/research/bertone/software#peakanalyzer), a fim de encontrar o gene com o TSS mais próximo de cada pico. Isso gera uma lista de genes com picos menos de 100 kb do TSS. As listas foram então comparadas com as listas de aumento e a diminuição da expressão de ARNm a partir do controlo versus dados de microarray C26 usando um algoritmo de Perl localizado numa página Web desenvolvido por Jim Lund, na Universidade de Kentucky (https://nemates.org/MA /progs /compare.html).

Controle positivo para Chip

para confirmar a ligação correta do anticorpo p65 estudamos chip com PCR para dois promotor consecutivo altamente estudada e verificada NF-kB locais de ligação no rato de IP-10 (CXCL10) gene [26]. Este experimento chip também utilizado um anticorpo para p50 (Santa Cruz SC-1190X). Um controlo positivo para o chip foi feita com cromatina de miotubos C2C12 que tinham sido tratados durante 4 horas com 10 ng /ml de TNFa de ratinho. Anteriormente mostrou que este tratamento induziu fortemente um repórter de luciferase de NF-kB e um aumento de IP-10 os níveis de ARNm, ambas as quais são dependentes de p65 [27]. Para a experiência de ensaio utilizou-se os métodos descritos no nosso trabalho anterior [21]. cromatina Resumidamente, formaldeído fixo de miotubos C2C12 não tratadas e tratadas com TNF? foi imunoprecipitada com o anticorpo p65, anticorpo p50, ou sem anticorpo e a proteína precipita, L-capturados foram processados ​​para produzir ADN que foi testado por PCR utilizando iniciadores que flanqueiam a dois NF consecutivo -κB sítios no gene PI-10. Além disso, também avaliamos p65 e p50 de ligação ao promotor IP-10 usando a cromatina dos músculos de controle e C26.

ChIP-PCR para Fbxo6

ChIP-PCR foi realizada a partir de tecido muscular fixo, homogeneizada e sonicada como para Chip-SEQ, com a excepção de que o anticorpo p65 foi ligada à proteína G esferas magnéticas por pré-incubação (dia para o outro a 4 ° C) antes da incubação com a cromatina, e os produtos de DNA foram utilizados como molde para PCR com os iniciadores de flanqueamento local de ligação do alvo do gene Fbxo6, como determinado a partir de ChIP-seq. O local alvo do chip-SEQ foi no primeiro intrão do gene Fbxo6, 2 kb a jusante do local de início da transcrição. As sequências dos iniciadores utilizados para a PCR foram agctcgttgatgtggaccat (iniciador esquerdo) e cctcctgctttaggctcctt (iniciador direita) e produziu um produto de PCR de 302 pb.

Estatísticas

Uma ANOVA ou um

t

-test foi utilizado para análise, dependendo do número de grupos a ser comparados. Os dados são expressos como média ± SE, e significância foi estabelecido em

P Art 0,05. Estatísticas para dados de microarranjos são descritos na seção microarray.

Resultados

Caracterização de C26 ratos

caracterização deste modelo de tumor em nosso laboratório portador de tumor envolveu a inoculação de CDF1 ratinhos com células tumorais C26 em PBS /Matrigel (n = 164) ou com PBS /Matrigel única (n = 142). Os ratos foram sacrificados aos 12, 13, 14, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 25 e 26 dias após a inoculação de células tumorais. Em caquexia severa (23-26 dias pós-inoculação) ratinhos portadores de tumor perdeu 22,1% ± 0,8% da massa corporal inicial, enquanto os controlos não-tumorais ganhou 12,3% ± 0,7% da massa corporal inicial (Figura S2A). Como massa tumoral aumentou tibial anterior (TA) a massa muscular diminuída (Figuras S2B). A massa muscular TA de ratos severamente caquéticos foi de 40,4 ± 0,3 mg, em comparação com 51,1 ± 0,3 mg para os ratos de controle pareados por idade. camundongos portadores de tumor em caquexia severa teve 214 ± 8,7 mg de massa gordura epididimal, enquanto os ratinhos de controlo teve 465 ± 10 mg (Figura S2C). A massa do baço de ratinhos portadores de tumor foi de 205 ± 4,6 mg em comparação com 75,5 ± 0,7 mg em ratinhos não portadores de tumor (Figura S2D). massa do tumor aumentou em função do tempo após a inoculação (Figura S2E).

Efeito do dominante negativo NF-kB proteínas sinalizadoras de atrofia das fibras musculares em camundongos

A fibra de média C26 portador de tumor