Sumário
Background
Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de curto non -coding ARN que regulam a homeostase celular, inibindo a tradução ou degradar ARNm de genes alvo, e deste modo podem agir como genes supressores de tumores ou oncogenes. O papel de microARNs em meduloblastoma só recentemente foi abordado. Nossa hipótese é que microRNAs diferencialmente expressos durante o desenvolvimento normal do SNC pode ser anormalmente regulada em meduloblastoma e são funcionalmente importante para o crescimento de células de meduloblastoma.
Metodologia e principais conclusões
Foi examinada a expressão de microRNAs em meduloblastoma e em seguida, investigou o papel funcional de um um específico, o miR-128a, na regulação do crescimento de células de meduloblastoma. Descobrimos que muitos microRNAs associados à diferenciação neuronal normal são significativamente baixo regulamentada em meduloblastoma. Um destes, o miR-128a, inibe o crescimento de células de meduloblastoma, visando o oncogene Bmi-1. Além disso, o miR-128a altera o estado redox intracelular das células tumorais e promove a senescência celular.
Conclusões e significado
Aqui nós relatamos o regulamento novela de espécies reactivas de oxigénio (ROS) por microRNA 128a através da inibição específica do Bmi-1 de oncogene. Nós demonstramos que miR-128a tem actividade supressora de crescimento em meduloblastoma e que esta actividade é parcialmente mediada pela segmentação Bmi-1. Estes dados têm implicações para a modulação dos estados redox em células-tronco do câncer, que são pensados para ser resistente à terapia devido aos seus estados de baixa ROS
Citation:. Venkataraman S, Alimova I, Fan R, Harris P, Foreman N, Vibhakar R (2010) MicroRNA 128a Aumenta intracelular ROS Nível de segmentação Bmi-1 e inibe Cancer Medulloblastoma crescimento celular através da Promoção da senescência. PLoS ONE 5 (6): e10748. doi: 10.1371 /journal.pone.0010748
editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 03 de fevereiro de 2010; Aceite: 30 de abril de 2010; Publicação: 21 de junho de 2010
Direitos de autor: © 2010 Venkataraman et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela Fundação Tumor Pediatric Brain (https://www.pbtfus.org/), os Bear Necessities Fundação Pediátrica Câncer (https://www.bearnecessities.org) e National Institutes of Health-National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NIH-NINDS) K08NS059790 concessão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o meduloblastoma é o tumor cerebral maligno mais comum da infância. Embora os resultados têm melhorado, existe significativa morbidade relacionada com a terapia de [1], [2]. Além disso, os pacientes com características de alto risco continuam a ter um prognóstico pobre. Avanços recentes indicam que meduloblastoma surge a partir de precursores de células de grânulos de cerebelo ou de células estaminais neurais localizados no cerebelo [3], [4], [5], [6]. Embora os mecanismos moleculares envolvidos na tumorigénese meduloblastoma não são bem definidas, é claro que existe um controlo anormal dos mecanismos normais de desenvolvimento [7].
Recentemente trabalhar a partir de nosso laboratório e outros implicaram microARNs como reguladores importantes de meduloblastoma o crescimento das células [8], [9], [10]. MicroRNAs consistem de 18-22 moléculas de RNA nucleotídeos com atividade silenciamento gênico pós-transcricional [11]. Mais comumente que controlam a expressão do gene através da associação com a região 3 ‘não traduzida (UTR 3’) dos genes e inibir a tradução da proteína [12]. MicroRNAs também pode desestabilizar e medeiam a degradação de transcritos de ARN [13]. Em adição ao seu papel no desenvolvimento normal, microARNs também estão associados com a carcinogénese [14], [15]. Muitos microARNs estão sob expressos em tumores humanos, em comparação com os tecidos normais, enquanto alguns são sobre-expressa [16]. Importante, desregulação do processamento de microRNA resulta em tumorigênese reforçada [17]. Em adição, um número crescente de microARNs estão associadas com cancros humanos específicos. Por exemplo, microRNA 21 (miR-21) é mais expresso em glioblastoma, e inibição de miR-21 inibe o crescimento de glioblastoma
in vitro
e
in vivo
[18]. Outros mostraram que o miR-137 e miR-124 induz a diferenciação de células estaminais glioma [19]. Nós mostramos anteriormente que o miR-124 também actua como um supressor de tumor em células de meduloblastoma, enquanto outros estudos recentes implicaram a polycistron miR 17-92 como um oncogene em meduloblastoma mediada por hedgehog Sonic [9], [10], [20].
Estes e outros estudos recentes sugerem que microRNAs são reguladores críticos de tumorigênese e que a sua contribuição para tumorigênese meduloblastoma é importante. Portanto, decidimos investigar a função microRNA em meduloblastoma. Nós exploramos a possibilidade de que a expressão de microRNAs enriquecido-cerebral está alterada em meduloblastoma e que alguns destes microARNs pode desempenhar um papel regulador fundamental neste tumor. Descobrimos que vários microRNAs associados à diferenciação neuronal normal são significativamente baixo regulamentada em meduloblastoma. Destes microARN 128a (miR-128a) foi fortemente regulada negativamente. Enquanto o papel de miR-128a tem sido investigada em tumores astrocíticos tais como o glioblastoma, o seu papel nos tumores neuronais, tais como meduloblastoma não é conhecido. Aqui descrevemos o papel funcional de miR-128a em meduloblastoma, pela primeira vez. Descobrimos que miR-128a inibe o crescimento de células de meduloblastoma, visando o oncogene Bmi-1 e, assim, aumentar os níveis de estado estacionário de superóxido e promover a senescência celular.
Resultados
cérebro enriquecido microRNAs são diferencialmente expressos em meduloblastoma
Como um primeiro passo para abordar o papel do microRNA em meduloblastoma foi realizada a análise baseada em microarrays de microRNA em células de meduloblastoma e comparou-a adulto normal cerebelo humano. Nós escolhemos examinar explantes celulares meduloblastoma primárias na passagem 2 em cultura para evitar ruídos de contaminar elementos da cerebral normal em amostras de biópsia. Fora dos 385 microARNs humanos testados, 167 foram expressos em níveis mais baixos em comparação com meduloblastoma quando cerebelo normal. agrupamento hierárquico da expressão microRNA corretamente separados do cerebelo normal a partir das amostras de meduloblastoma (Figura S1-A). Outras análises revelaram que a diminuição da expressão de 90 microARNs em meduloblastoma foram estatisticamente significativas (p 0,05). Esta lista foi então examinada para separar os microARNs que foram expressos em todas as três amostras de cerebelo e estatisticamente diminuiu em todas as três amostras de meduloblastoma. Isto reduziu a lista de microARNs humanos estatisticamente significativas com a diminuição da expressão em todas as três amostras de meduloblastoma para microARNs 30 (Figura S1-B). É de notar que muitos dos microARNs tinha sido anteriormente identificado como sendo enriquecido no cérebro normais [21]. Alguns, mas nem todos estes microARNs também foram relatados anteriormente como sendo diminuiu em meduloblastoma, em comparação com o normal cerebelo [8], [9]. Comparação dos conjuntos de dados de diminuição microARNs relatado anteriormente e os nossos dados revelou que apenas cinco microARNs foram detectados por todos os três grupos (Figura S2). Estes são miR-124, miR-129, miR-138, miR-150 e miR-323. Nós mostramos anteriormente que o miR-124 é funcionalmente importante na meduloblastoma, enquanto a biologia dos outros quatro miRs comuns ainda não é claro [10]. Ferretti
et al
teve um adicional de 12 microRNAs em comum com os nossos conjunto de dados onde como Northcott
et al
tinha apenas 3 microRNAs adicionais em comum com a gente (Figura S2). Além disso, havia 10 microRNAs adicionais que só foram identificadas por nós como sendo significativamente diminuída em meduloblastoma (Figura S2).
A seguir, realizada em tempo real RT-PCR em uma coorte de estes miRNA em amostras adicionais para validar o nosso microarray dados (Figura 1A). Comparando as células de meduloblastoma primários para adultos e cerebelo normal, pediátrica revelou uma regulação para baixo significativa de cérebro microRNAs enriquecidas em meduloblastoma. Há quatro microRNAs altamente regulados para baixo, ou seja, miR-125, miR-128a, miR -139 e deixe-7g. Destes quatro microARNs, miR-139 foi identificado por nós, mas não em dois relatórios anteriores [8], [9]. Além disso, nós, bem como Ferretti
et al
mas não Northcott
et al
detectado miR-128a como a diminuição no meduloblastoma. Curiosamente cerebelo adulto teve maior expressão de muitos destes microARNs quando comparado com cerebelo pediátrica. A expressão de microRNAs altamente reprimidas foi ainda validado num painel de linhas de células de meduloblastoma. Semelhante aos explantes primários todas as quatro microARNs foram diminuídas nas linhas de células quando comparado com cerebelo normal (Figura 1B). Coerentes com os dados publicados anteriormente também encontramos miR17-5p a ser sobre-expresso em meduloblastoma [9].
A) de calor MicroRNA mapa de perfis de amostras de pacientes de meduloblastoma e comparação com cerebelo normal. B) A repressão de miR-125, miR-128, miR-139, deixe-7g e aumento da expressão de miR17-5p em linhas de células de meduloblastoma. C) A expressão relativa de microRNAs em amostras de pacientes de meduloblastoma.
Em seguida, examinaram a expressão de let-7 g, miR-125 e miR-128a em tumores de meduloblastoma primários e tecido cerebelar normal. Usando PCR qRT- verificou-se que todos os três miARNs estão significativamente diminuídos em expressão em 10 amostras de pacientes arquivados meduloblastoma (ANOVA, p 0,001, Figura 1C). Dado o pequeno conjunto de amostras, é difícil desenvolver qualquer correlação com tumor sub-tipo ou os resultados dos pacientes. No entanto, as amostras não foram GLI1 elevada e, portanto, não na subcategoria SHH [9], [22]. Estes dados indicam que estes microARNs poderia ter um papel biológico importante na meduloblastoma. Com base na extensão de miR-128a reprimido em meduloblastoma, em contraste com a sua elevada expressão no cerebelo normal, optou-se por continuar a investigar o papel funcional de miR-128a em meduloblastoma.
re-expressão de miR-128a diminui Daoy
crescimento de células de meduloblastoma
Para determinar se a re-expressão de microRNAs altera o crescimento de células tumorais, que transfectadas células de meduloblastoma Daoy com oligonucleótidos precursoras microRNA. Estas moléculas precursoras microARN são concebidos para imitar microARNs endógenos. Re-expressão de miR-128a diminuiu o crescimento de células de meduloblastoma como medido pelo ensaio de MTT (Figura 2A). Descobertas similares foram observados na linha celular de meduloblastoma D283 (dados não mostrados). Para melhor avaliar o efeito inibidor do crescimento de miR-128a, que transfectadas células Daoy com controlo miR ou oligonucleótidos miR-128a e as células contadas, durante 5 dias, usando o método de exclusão de corante azul de tripano. Consistente com os dados de MTT, miR-128a diminuiu o crescimento de células Daoy de um modo dependente da dose (Figura 2B).
A) miR-128a inibe a proliferação de células de meduloblastoma como medido pelo ensaio MTT. Número de células Daoy como medido pelo ensaio de exclusão com corante azul de tripano B); (01 P 0,001)
Para avaliar melhor o impacto dos microRNAs em células de meduloblastoma foi utilizado um plasmídeo lentiviral, que expressa a cassete de miR-128a e ensaios de formação de colónia realizadas. Tal como mostrado na Figura 2C e D, a transfecção com miR-128a inibiu potencialmente a formação de colónias por células de meduloblastoma, indicando que o miR-128a é um supressor tumoral putativo em meduloblastoma. Além disso miR-128a potentemente diminuiu a capacidade de células Daoy para crescer em agar mole, sugerindo ainda uma função supressora de tumor para miR-128a em meduloblastoma (Figura S3).
MicroRNA 128a para baixo regula Bmi-1 em células de meduloblastoma
a seguir, realizada uma análise de potenciais locais alvo microRNA usando dois algoritmos de previsão comumente usados, TargetScan (https://www.targetscan.org) e PicTar (https://pictar.bio.nyu.edu) [23], [24]. Ambos os algoritmos previu o gene Polycomb Bmi-1 a ser alvo de miR-128a. O local alvo satisfaz os critérios de correspondência de sementes (Figura 3A). Para testar se experimentalmente os nossos objectivos previstos foram regulados pelo miR-128a, o local alvo Bmi-1 foi clonado no 3’UTR do gene da luciferase de Renilla no vector siCHECK. células Daoy foram transfectadas com controle ou miR-128a oligonucleotídeos. A co-transfecção com o miR-128a diminuiu significativamente a actividade de luciferase Renilla nos vectores no local alvo Bmi-1, mas não nos vectores do sítio mutado (Figura 3B). Estes dados sugerem que o IMC-1 é um alvo de miR-128a. Um outro estudo recente de miR-128a em glioma também relatado que o IMC-1 é um alvo para o miR-128a [25]. Isto é especialmente interessante uma vez que os genes Polycomb desempenhar um papel vital na renovação das células estaminais durante a embriogénese e também são conhecidos por serem biologicamente importante na proliferação de células neurais e meduloblastoma patogénese [26] – [27].
A) MiR- site de destino 128a na Bmi-1 3’UTR. B) Os ensaios de repórter da luciferase indicaram que o miR-128a funcionalmente tem como alvo o peso Bmi-1 3 ‘UTR, * p 0,01 C) análise Western blot confirmou que o miR-128a, mas não a expressão de proteínas de controlo de miR (CM), inibe de IMC -1 em células de meduloblastoma. D) A quantificação das bandas de Western blot. (P 0,01)
Para validar ainda mais Bmi-1 como um alvo de miR-128a, foi realizada a análise de imunotransferência de células transfectadas de controlo ou miR-128a. As células Daoy foram transfectadas com controlo ou miR-128a oligonucleótidos e colhidas 48 horas mais tarde. A análise por Western blot foi realizada utilizando um anticorpo anti-Bmi-1. MiR-128a diminuiu os níveis de proteína Bmi-1 em células Daoy consistentes com os dados de luciferase. (Figura 3C, D).
MicroRNA 128a inibe Bmi-1 mediada sinalização
Bmi-1 é conhecido por reprime a expressão p16 [28]. Na ausência de Bmi-1, o p16 é regulada para cima em células estaminais neuronais, reduzindo a proliferação de células [26]. Além disso, tem sido mostrado que o IMC-1 repressão mediada por p16 pode conduzir a um aumento de comportamento agressivo de células estaminais melanoma [29]. células Daoy de meduloblastoma e ONS76 transfectadas com miR-128a sobre-regulada de p16 como detectado por Western blotting (Figura 4A). As mesmas linhas celulares quando transfectadas com Bmi-1 expressão p16 completamente reprimida. Para confirmar adicionalmente que o miR-128a evita a repressão da p16 pela inibição Bmi-1, tanto ONS76 linhas de células Daoy e foram co-transfectadas com o miR-128a e Bmi-1. Isto resultou em um aumento moderado no nível da proteína p16 em comparação com a das células transfectadas apenas com o Bmi-1.
A) análise de transferência de Western mostraram aumento da expressão de p16 em células Daoy transfectadas com miR-128a em relação ao do vetor de controle, pVETL. O nível de expressão de p16 foi completamente inibida em células Daoy que foram transfectadas com o vector de Bmi-1 sozinha enquanto que a inibição modesta foi observada em células co-transfectadas com o miR-128a. B) A diminuição da actividade em células Daoy E2F1 transfectadas com miR-128a como medido por ensaios de repórter de luciferase. (P 0,01)
Estudos anteriores indicam que Bmi-1 inibe a p16 e, assim, aumenta a atividade E2F1 [30]. Os factores de transcrição E2F desempenhar um papel-chave na regulação da proliferação celular e diferenciação terminal. Por conseguinte, foi examinado o efeito de miR-128a sobre a actividade de transcrição E2F1. Verificou-se que a transfecção de miR-128a em células Daoy diminuiu significativamente a actividade E2F1 como medida pela actividade de luciferase repórter, p 0,05 (Figura 4B). Isto é consistente com nossas descobertas que miR-128a diminui Bmi-1 e aumenta a p16.
Bmi-1 é um componente funcional do miR-128a mediada parada do crescimento de células meduloblastoma
Para melhor avaliar se Bmi-1 repressão é um componente funcional do miR-128a fenótipo parada do crescimento investigamos se Bmi-1 poderia resgatar a parada do crescimento miR-128a em células de meduloblastoma. células de meduloblastoma foram transfectadas com miR-128a, 128a e miR-Bmi-1 ou os controlos correspondentes e as células submetidas ao ensaio de colónia foco. A co-transfecção de miR-128a com IMC-1 resultou numa atenuação do miR-128a mediada paragem do crescimento em ambas as células Daoy (Figura 5A e B). células Daoy co-transfectadas com o IMC-1 sem o seu 3’UTR e miR-128a também resgatou a proliferação de células como por sozinho inibiu o miR-128a (Figura S4A). Isto sugere claramente que o miR-128a tem como alvo Bmi-1 e diminuem a sobrevivência das células. Outra linha de células de meduloblastoma ONS76 células também mostraram a mesma tendência na eficiência de revestimento, quando transfectadas com miR-128a e Bmi-1 (Figura S4B). Estes dados funcionalmente coloca Bmi-1 na cascata de miR-128a.
a) a co-transfecção de células Daoy com miR-128a e IMC-1 aumentou o número de colónias formadas em relação à da sozinho miR-128a . B) A análise quantitativa do número de colónias formadas por células Daoy diferentes após as transfecções, incluindo Bmi-1 que não possui o seu 3’UTR. pBABE-puro é um vector de controlo para o comprimento total Bmi-1. * P 0,05 para miR-128a vs. pVETL e ** p 0,001 para miR-128a vs.
MicroRNA 128a aumenta o nível de estado estacionário de superóxido miR-128a + Bmi-1. em células Daoy
recentemente, foi mostrado que a ausência de Bmi-1 conduz a um aumento de espécies de oxigénio reactivas (ROS) níveis em células derivadas de Bmi-1 knockout mice [31]. ROS são bem conhecidos para modular uma variedade de funções celulares, incluindo a biologia celular do cancro [32]. Dado que o miR-128a diminuiu os níveis de proteína Bmi-1, quisemos testar se um aumento semelhante em níveis de ROS foi evidente em células Daoy tratadas com miR-128a. Foi realizada trapping rotação de radicais livres e espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica (EPR) para identificar se houve um aumento do nível de ROS em células re-expressão de miR-128a. A armadilha de spin, DMPO foi escolhido por causa de sua baixa citotoxicidade, a acessibilidade à célula, e reação com radicais hidroxila (· OH) para produzir um distintivo rodada aduto DMPO-OH [33]. A reacção de DMPO com superóxido produz um produto (DMPO-OOH) que é convertido em DMPO-OH por GPx em células. Portanto, DMPO é uma sonda útil para detectar radicais centrados no oxigénio decorrentes de superóxido e H
2O
2. Os espectros de EPR mostram uma 1:2:2:1 DMPO-OH típica quarteto (círculos a cheio, A Figura 6A-II). EPR resultados mostram claramente um aumento na intensidade quarteto DMPO-OH em células Daoy expressar miR-128a em comparação com a do vector vazio (Figura 6A-i). Para identificar com exactidão se o sinal quarteto DMPO-OH pode ser devido directamente para dismutase ou a H
2O
2, células Daoy transfectadas com miR-128a foram incubadas com CuZnSOD durante 30 min antes da adição de DMPO. A adição de SOD diminuiu de forma significativa a altura do sinal EPR sugerindo que o sinal de DMPO-OH é directamente devido a superóxido (Figura 6A-III). A análise quantitativa da altura do pico quarteto (Figura 6B) demonstraram um aumento significativo (p 0,05) de superóxido em células transfectadas transitoriamente com miR-128a quando comparada com células tratadas com o vector de controlo. Este aumento na intensidade do sinal foi inibida pela adição de SOD. É, portanto, claro que miR-128a aumenta o nível de estado estacionário de superóxido nas células de meduloblastoma. Para confirmar ainda que o aumento em ROS é devido à inibição da Bmi-1, células Daoy foram co-transfectadas com o IMC-1 e miR-128a. Isto resultou num nível diminuído de ROS nas células em comparação com a de miR-128a sozinho (Figura 6A-IV). experimentos de resgate com Bmi-1 sem o seu 3’UTR também revelou que miR-128a atinge Bmi-1 e, portanto, leva a um aumento no nível de ROS nas células (Figura S5)
a) aumento da formação de radicais superóxido nas células Daoy que foram transfectadas com o miR-128a como detectado utilizando espectros de EPR do spin aducto DMPO-OH (círculos fechados em (ii)). Os espectros recolhidos são uma média do sinal de 15 varreduras. O sinal 1:2:2:1 (círculos fechados) quarteto visto é devido à formação de DMPO-OH. As células tratadas com miR-128a tem ~ 3 vezes de aumento na intensidade de sinal de ROS (II), em comparação com o vector vazio (i). A co-transfecção de células com o miR-128a e IMC-1 resultou num grau de ROS diminuída comparada com a de miR-128a isolado (III). O tratamento de SOD em células de miR-128a-transfectadas suprimidos os sinais mostrando que o radical formado é principalmente superóxido (IV). B) A análise quantitativa de EPR altura de pico normalizada ao número de células. * P . 0,05 miR128a vs. pVETL e miR-128a + SOD
MicroRNA 128a induz senescência celular em células Daoy
espécies reativas de oxigênio, um subproduto do estresse oxidativo pode induzir irreversível a paragem do crescimento celular e senescência [34]. Além disso, as células senescentes tem significativamente mais ROS quando comparado com as células apoptóticas [35]. Na expressão de p16 disso é uma das marcas do salão de senescência celular [36]. Dado que encontramos células Daoy miR-128a transfectadas mostraram um aumento no nível de estado estacionário de ROS, o aumento no nível de proteína p16 e demonstrou uma parada do crescimento celular, foi realizado um ensaio para a senescência. Cinco dias após a transfecção com o miR-128a, um aumento do número de associados-senescência β-galactosidase foram observadas células (SA-β-Gal) positivos (Figura 7A). Houve um aumento de cinco vezes nas células senescentes após a transfecção miR-128a de células, quando comparado com as células transfectadas com vector vazio (Figura 7B) Dados semelhantes foram observados em células de meduloblastoma ONS 76 (Figura S6).
A ) miR-128a induz senescência em células de meduloblastoma tal como detectado por coloração com SA-beta-galactosidase (células azuis escuras, os exemplos indicados por setas vermelhas). contagens B) células por campo High Powered de células positivas β-gal no vetor de controlo (pVETL) ou células transfectadas miR-128a, * p = 0,003. C) Análise de mancha de Western mostrando aumento do nível de proteína nas células Daoy H3K9me2 transfectadas com miR-128a quando comparada com o vector vazio. Actina é usado como um controlo interno.
Para apoiar ainda mais a nossa conclusão de que o miR-128a transfecção leva a senescência celular, examinamos os níveis de metilação de histonas 3, lisina 9 (H3K9) por western blot. focos de heterocromatina associada à senescência está associada com a metilação das histonas 3 9 lisina (H3K9me2). Curiosamente, a re-expressão de miR-128a resultou num aumento da metilação de histona 3 9 lisina (H3K9me2), outra marca de expressão do gene reprimida mediada pela Bmi-1 Polycomb complexo repressor (Figura 7C). Todos estes resultados sugerem fortemente que o efeito inibidor do crescimento de miR-128a é devido à via de sinalização como senescência provocada pelo aumento das ERO
Discussão
Aqui relatamos a regulação de novo reactivo espécies de oxigênio por microRNA 128a através da inibição específica da Bmi-1 oncogene. O papel funcional da microRNA 128a em meduloblastoma não tenha sido previamente descrito.
Encontramos regulação para baixo significativa de vários microRNAs conhecidos por serem envolvidos no desenvolvimento do SNC em meduloblastoma ,. Nossos dados está em consonância com estudos anteriores que descreveram menor expressão de microRNAs em meduloblastoma [8], [9]. Ferretti
et al, achou 55 microRNAs a ser regulada negativamente em meduloblastoma com diferenças na expressão entre os principais subtipos histológicos [8]. Da mesma forma Northcott
et al, achou 61 microRNAs de ser diminuída em meduloblastoma quando comparado ao cerebelo normal, [9]. Curiosamente, quando ainda classificados em 4 grupos moleculares houve diferenças significativas na expressão de microRNA. Por exemplo Sonic Hedge Hog expressão (SHH) tumores conduzidos tinha diminuído de 10 microRNAs mas nenhum que sobreposto com microRNAs identificados por nós ou por Ferretti
et al
. Na verdade comparação análise revelou diferenças significativas entre os microRNAs detectados pelos três grupos (Figura S2). Estas diferenças são provavelmente relacionado com as plataformas utilizadas por cada grupo, de origem do tumor e a fonte e a idade do cerebelo normal utilizado. Utilizou-se explantes de células primárias em cultura na passagem 2, enquanto os outros dois grupos usaram material de biópsia. Além disso nossos tecidos dos pacientes eram todos da histologia clássica, e não tem uma assinatura de expressão gênica para SHH. De nota tanto o nosso estudo e do relatório do Ferretti
et al., Achou que o miR-128a foi significativamente diminuído em expressão em meduloblastoma quando comparado ao cerebelo normal.
Nós mostramos que esta diminuição da expressão é uma propriedade de amostras de tumores primários, bem como um painel de linhas de células de meduloblastoma vulgarmente utilizados. Estes dados serão de uso particular em função microRNA é ainda sondado em meduloblastoma. De notar o cluster miR17-5p foi mais expresso em nossas amostras, o que é consistente com relatórios anteriores [9].
A análise da re-expressão de miR-128a em células de meduloblastoma mostrou que miR-128a inibiu o crescimento de células de meduloblastoma com maior probabilidade de diminuir a proliferação. MiR-128a demonstrado tumorais efeitos supressores pelo potente inibição da formação de colónias de células de meduloblastoma. Uma análise mais aprofundada dos possíveis mecanismos revelou que a Bmi-1 oncogene era um alvo putativa de miR-128a. Nós demonstramos que o IMC-1 proteína é regulada negativamente por miR-128a, que por sua vez leva a um aumento na p16 um inibidor do ciclo celular. Regulamento da Bmi-1 por microRNAs é dada emocionante que Bmi-1 é sobre-expresso em meduloblastoma e crítico para o desenvolvimento do cerebelo normal, [27]. Bmi-1 também é crítico para a auto-renovação das células estaminais neurais [26]. Bmi-1 também foi recentemente mostrado ser um alvo de miR-128a no glioblastoma [25]. Nossos dados estende esta observação, demonstrando que a inibição da Bmi-1 é funcionalmente essencial para a função do crescimento supressiva miR-128a. Restaurar expressão Bmi-1 em células que expressam o miR-128a salva as células de meduloblastoma de paragem do crescimento. Em seguida, procurou explorar ainda mais o mecanismo do miR-128a-Bmi-1 percurso em meduloblastoma.
Dados recentes sugerem que Bmi-1 regula espécies reativas de oxigênio [31]. Mostramos que microARN 128a intracelular induz a geração de superóxido, possivelmente por regulação dos níveis de Bmi-1 e que o IMC-1 re-expressão inverte a geração de superóxido. Evidências recentes sugerem que as células estaminais do cancro são mais resistentes a terapia devido a um estado redox global inferior [37]. Assim modulando mecanismos de regulação da geração de ROS em células-tronco do câncer, talvez uma estratégia útil para destruir estas células. Nós imaginar um cenário em que a 128a microARN pode ser utilizado para induzir ROS nas células estaminais meduloblastoma e assim torná-los mais radiossensíveis. A chave é para modular a homeostase da ROS. Em concentrações normais, ROS desempenha um papel nas funções celulares que envolvem a transdução de sinal. No entanto, um desequilíbrio entre a produção de ROS e da capacidade de antioxidantes para neutralizar ROS pode resultar numa perturbação do estado redox da célula, conduzindo ao estresse oxidativo. Nossa observação de um aumento do nível de estado estacionário de ROS, e indução de p16 pode contribuir para prematura-senescência em células que expressam miR-128a (Figura S7).
Em resumo, nós descrevemos o papel funcional de microRNA 128a em meduloblastoma. Nós demonstramos que microRNA 128a diminui o crescimento de células meduloblastoma através de mecanismos que envolvem ROS e senescência. Estamos agora a investigar o papel de microRNA 128a em meduloblastoma sensibilizadores de rádio utilizando
In vivo
modelos de xenotransplante ortotópicos.
Materiais e Métodos
células, tecidos e Cultura
células Daoy e de meduloblastoma D283 foram obtidos de American Type Culture Collection (Rockville, Md.) e cultivadas em meio DMEM (Gibco, Grand Island, NY) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco) de acordo com as recomendações do fornecedor . A linha celular ONS76 foi gentilmente cedido pelo Dr. James T. Rutka (Universidade de Toronto, Canadá) e foi cultivada em DMEM contendo 10% de FBS. D341 foi obtido a partir de ATCC e cultivadas em DMEM com 20% FBS e 1% de piruvato de sódio e L-glutamina. culturas de células primárias foram derivadas a partir de amostras de biópsias de pacientes de meduloblastoma sob um protocolo aprovado pelo Institutional Review Board da Universidade de Iowa Hospitais e Clínicas. consentimento por escrito de todos os pacientes foi obtido conforme estipulado pela Universidade de Iowa IRB. As culturas foram mantidas em baixos números de passagem (P2-P4) em meio DMEM suplementado com soro fetal de bovino a 20%. amostras cerebelo e meduloblastoma de pacientes humanos normais foram obtidas a partir do Pediátrica Co-operative Tissue Network Humana (Columbus, Ohio) sob uma Universidade de Iowa IRB protocolo aprovado. Todas as amostras foram obtidas de forma anónima, conforme estipulado pela IRB. Amostras que amostras de cerebelo normais eram de pediatria oncológica e cérebro adulto. Todas as amostras de meduloblastoma eram de pacientes pediátricos. Detalhes das amostras dos doentes foram previamente descritos [38]. Resumidamente todas as amostras eram de não-metastáticos (M0) tumores com histologia meduloblastoma clássica.
Isolamento MicroRNA e análise quantitativa PCR
RNAs Pequenos foram isolados utilizando o kit de isolamento Mirvana RNA (Ambion).
expressão MicroRNA foi medida por PCR quantitativa utilizando um termo-cycler ABI 7700. primers microRNA e sondas foram adquiridos da Applied Biosystems (Foster City, CA) e os ensaios realizados segundo as recomendações do fabricante com várias modificações para nos permitir detectar microRNAs baixa abundância. Para a reacção de transcrição reversa (RT) foi utilizada 20 nanogramas de ARN total. Para a reacção de qPCR do ADNc resultante foi diluído 1:02. Cada passo de RT foi realizada em duplicado e o qPCR em triplicado para cada reacção de RT. U6b e U66 pequenos RNAs foram usados como controles endógenos e quantidade microRNA relativo calculado pelo método ΔΔCT.
transfecção transitória de células Daoy com miR-128a e análise de proliferação e viabilidade celular
A proliferação celular foi medida pelo ensaio de MTT e a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de exclusão com corante azul de tripano. Para ensaio de proliferação de células, as células de meduloblastoma foram transfectadas com controlo de miR, miR-9 ou oligonucleótido miR-128a em placas de 24 poços, utilizando o reagente de LT1 (Mirus, Madison, WI). 6, 000 células /poço foram então semeadas em triplicado em placas de poços de 96 em 100 ul de meio. Após 2 dias, foram adicionados 100 ul de células Titer AQeous (Promega, Madison, WI) e as células incubadas durante 1 hora e a absorvância medida a 490 nm utilizando um leitor de microplacas de acordo com as recomendações do fabricante. (F).