Abstract

Câncer-1 tiróide (TC-1), uma proteína nativa desordenada, é amplamente expresso em vertebrados e sobre-expresso em muitos tipos de tumores. No entanto, o seu papel exacto e mecanismo de regulação no cancro do pulmão de células não pequenas humano (NSCLC) ainda não estão claros. No presente estudo, verificou-se que TC-1 é altamente expresso em NSCLC e que a sua expressão aberrante está fortemente associada com a proliferação de células NSCLC. Exógeno TC-1 sobre-expressão promove a proliferação celular, acelera a transição G1 para a fase S de células e reduz a apoptose em NSCLC. O knockdown de TC-1, contudo, inibe a proliferação de células NSCLC, a transição do ciclo, e resistência à apoptose. Além disso, também foi demonstrado que PD173074, que funciona como um inibidor da CT-1 no NSCLC, diminui a expressão de CT-1 e inibe a CT-1 sobreexpressão mediada por proliferação celular

In vitro

e

In vivo

. No entanto, a função de inibição da PD173074 na proliferação de células NSCLC foi eliminado em células CT-1 com knockdown. Estes resultados sugerem que PD173074 desempenha um papel significativo em 1 TC-sobreexpressão mediada por proliferação de células NSCLC e pode ser um alvo potencial para a intervenção de prevenção da proliferação de células em NSCLC

citação:. Lei J, Li W, Y Yang , Lu Q, Zhang N, Bai G, et al. (2014) TC-1 superexpressão promove a proliferação celular in Human Non-Small Cell Lung Cancer que pode ser inibida por PD173074. PLoS ONE 9 (6): e100075. doi: 10.1371 /journal.pone.0100075

Autor: Philip C. Trackman, Boston University Goldman Faculdade de Medicina Dentária, Estados Unidos da América

Recebido: 20 Janeiro, 2014; Aceito: 21 de maio de 2014; Publicação: 18 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Lei et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é uma das principais causas de morbilidade no mundo todo. Em 2013, cerca de 228.190 novos casos são projetados para ocorrer nos Estados Unidos, respondendo por 13,74% de todos os novos casos de câncer. Ainda mais preocupante, apesar do uso de um tratamento multi-modalidade, incluindo a gestão cirúrgica, quimioterapia e radioterapia, o cancro do pulmão continua a ser a principal causa de mortalidade por câncer em homens e mulheres; De fato, aproximadamente 159.480 pacientes morrem de doenças relacionadas com o cancro do pulmão nos Estados Unidos [1]. Portanto, novas terapias que surgem a partir de uma melhor compreensão dos reguladores moleculares do crescimento do tumor são urgentemente necessárias. Nos últimos anos, diversos biomarcadores que estão envolvidos na progressão de cancro do pulmão têm sido investigados, mas poucos estudos avaliaram as funções de TC-1 no desenvolvimento do cancro do pulmão.

TC-1 foi originalmente clonado a partir do subtractivo hibridação entre um carcinoma papilar da tireóide e seu tecido tireoidiano normal ao redor [2]. Ele é expressa ubiquamente em uma ampla variedade de vertebrados com maior conservação entre as espécies centradas sobre a grelha de leitura aberta (ORF). A sua expressão ubíqua e conservação da sequência sugerem que CT-1 pode desempenhar um papel importante na biologia das células [3]. Ele codifica uma proteína de 106 aminoácidos, sem um domínio funcional identificados, o que indica que a proteína TC-1 é um membro do grupo de proteína nativa desordenada que tenha sido demonstrado para executar funções principais em controlo do ciclo celular, proliferação, metástase, e transdução de sinal [3], [4]. Um crescente número de estudos demonstraram que a CT-1 é altamente expresso em vários carcinomas, e a sua expressão aberrante foi implicada na proliferação de células normais e cancerosas [5] – [9]. Margaret Sunde et ai. confirmou que TC-1 é uma nova proteína tumorigénico associada com o cancro da tiróide e verificou que a sobre-expressão de TC-1 em células normais da tiróide aumentou a sua taxa de proliferação, aumentado o seu crescimento independente da ancoragem em ágar mole, e diminuíram a taxa de apoptose [3] . TC-1, que está localizado na região genómica sensível ao cancro da mama (8p

11-12), foi encontrada para ser significativamente regulada positivamente em linhas celulares de cancro da mama humano e tecidos, implicando, assim, esta proteína no desenvolvimento de cancro da mama [8]. No cancro gástrico, a CT-1 foi encontrado para ser um dos genes regulados positivamente em ambas as linhas de células e tecido de carcinoma, e a sua expressão foi fortemente correlacionado com quase todas as variáveis ​​clínico-patológicos de comportamento agressivo biológica de cancros, incluindo o tamanho, estado avançado, e pobre sobrevivência [10], [11]. No entanto, o nível de expressão e a função biológica de TC-1 no NSCLC não foram até agora elucidada.

Recentemente, Olivier E. Pardo et ai. relatado que o receptor de factor de crescimento de fibroblastos selectiva (FGFR) inibidor blocos PD173074 a proliferação e crescimento clonogénico de duas linhas de células pequenas do pulmão (cancro de células H69 e H510) de uma forma dependente da dose e impede quimiorresistência induzida por FGF-2. Surpreendentemente, em xenoenxertos de H510, o crescimento do tumor foi prejudicada ao tratamento com PD173074, resultando num aumento na sobrevivência média em comparação com os animais de controlo tratados com placebo, de forma semelhante ao efeito observado com a administração de um único agente, cisplatina; H69 em xenoenxertos, PD173074 induziu uma resposta completa, que durou, pelo menos, 6 meses em 50% dos ratinhos. Além disso, o efeito da cisplatina foi significativamente potenciado pela sua co-administração com PD173074. Estes efeitos foram explicada pela constatação de que o tratamento com PD173074 intratumoral diminuição da proliferação e aumento da apoptose de células com um elevado aparência do marcador apoptótico de morte celular de caspase-3 [12]. Esses resultados encorajadores promover ainda mais a investigação do efeito de PD173074 em células NSCLC.

Para estudar o papel da CT-1 na proliferação celular e para avaliar o efeito de PD173074 na proliferação de células CT-1-mediada, neste estudo, investigamos a relação entre TC-1 expressão e proliferação celular em NSCLC por imuno-histoquímica, e o efeito de PD173074 sobre a proliferação celular mediada TC-1-usando uma série de

in vitro

e

in vivo

perda de função e estudos de ganho de função.

Materiais e Métodos

2.1 Ética Declaração

o estudo humano foi aprovado pelo Hospital Tangdu Comissão de Ética institucional, eo estudo foi realizado de acordo com as disposições da Declaração de Helsinki de 2008. Todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito antes de participar no estudo.

Todos os estudos com animais foram realizados com um protocolo aprovado pelo Comitê animal Care e Use o Tangdu Hospital.

2.2 Imuno-histoquímica e Avaliação

imediatamente após a remoção cirúrgica, amostras de 122 pacientes com NSCLC foram dissecados por patologistas e snap-congelados em líquido azoto. As amostras de cancro foram recolhidos a partir do centro dos nódulos, e as amostras normais foram obtidas a partir de uma área de 5 cm distante dos nódulos. Cada uma das amostras foi fixa com paraformaldeído a 4% e embebidos com parafina. Os tecidos foram cortados para obtenção de cortes de 4 um de espessura, e os cortes foram desparafinados com uma série de xileno e re-hidratadas através de uma série gradual de álcool. recuperação de antigénios Microondas foi executada a 750 W durante 10 minutos em tampão de citrato (pH 6,0) para aumentar a imunorreactividade. A actividade de peroxidase endógena das secções foi bloqueada com 3% de peroxidase de hidrogénio durante 30 min, e as secções foram então incubadas com soro de cabra normal a 5% em PBS durante 30 min a 25 ° C para bloquear qualquer anticorpo não específico de reacção. As secções foram lavadas três vezes com PBS durante 10 min, incubadas com os anticorpos primários (TC-1, 1:100, Gene Tex, EUA; Ki-67, 1:300, Neomarkers Lab Visão Corp., CA, EUA) durante a noite em 4 ° C, e depois coradas com um kit de detecção ™ Envision (Dako, Dinamarca) seguindo as instruções do fabricante. As secções foram então tratadas com 0,003% 3, 30-diaminobenzidina e contrastadas com hematoxilina

.

A avaliação da TC-1 expressão foi realizada por dois patologistas sem acesso aos dados clínicos e baseou-se tanto o grau de TC-1 rotulagem e a intensidade do TC-1 coloração. O grau de TC-1 marcação foi medida de acordo com a percentagem de células positivas: 0 = 0-5%, 6-25% 1 =, 2 = 26-50%, 3 = 51-75%, e 4 = 76- 100%. A intensidade da coloração de TC-1 foi estimada visualmente e estratificado em quatro grupos: 0 = negativo; 1 = fraco; 2 = moderada; e 3 = intensa. A pontuação TC-1 foi determinada como o grau de TC-1 rotulagem multiplicada pela intensidade de coloração com TC-1: 0 = 0, 1+ = 1-4, 2+ = 5-8, 3+ = 9-12. Aqueles tumores com uma pontuação de 0 foram considerados TC-1-negativo, ao passo que os outros (1+ a 3+) foram considerados positivos. As percentagens de células tumorais Ki-67-reativa foram avaliados em um campo de alta potência (400 ×), contando mais de 1000 células tumorais em partes representativas escolhidas ao acaso da tumor [13].

Cultura

2.3 celular

A549 NSCLC, SPC-a-1, 95D, e NCI-H520 células e as células do epitélio 16HBE bronchiorum túnica mucosa foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA) e mantida no nosso laboratório . As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Gibco, Grand Island, NY, EUA) e 100 unidades /ml de estreptomicina /penicilina e cultivadas a 37 ° C numa atmosfera húmida com 5% de CO

2. Para as experiências de PD173074, células A549 e A549- plenti-shRNA1 foram cultivadas em soro-livre e do factor de crescimento epidérmico (EGF) forma -livre (SITA: RPMI 1640 suplementado com 5 ug /ml de insulina, 10 ^ g /ml de transferrina, 30 nmol /l de selenito de sódio, e 0,25% de albumina de soro de bovino) suplementado com PD173074 (dissolvido em DMSO, Cayman, EUA) a uma concentração final de 1 μΜ. O meio de crescimento para as células de controlo foram suplementadas com volumes equivalentes de DMSO sem inibidor.

2.4 Knockdown de TC-1 por RNA de interferência

Quatro RNAi candidatos sequências alvo para a saúde humana TC-1 (Tabela 1) foram concebidos e clonado no vector GFP-pGCSIL por Shanghai GeneChem Co., Ltd. (China). TC-1 shRNA1 (Tabela 1) exibiram a melhor eficiência de knockdown em células 293T co-transfectadas com o CT-1 e expressão de shRNA construções, como revelado por Western blot e de imunofluorescência, e foi assim seleccionado para o knockdown da CT-1 endógeno em NSCLC células. Não silenciamento-shRNA (NSRNA) foi utilizado como um controlo negativo. Os oligonucleótidos que codificam o TC-1 shRNA1 ou NSRNA sequência e uma sequência de ansa de separar os domínios complementares foram sintetizados e inserido no pGCSIL-GFP por Shanghai GeneChem Co., Ltd. (China). O vírus recombinante foi empacotado usando Sistemas Lentivector de expressão (Shanghai GeneChem Co., Ltd., China). As células A549 foram infectadas com uma solução infecção melhorada e cultivadas em meio RPMI-1640. Uma semana após a infecção, as células positivas para GFP foram classificados utilizando um citómetro de fluxo (Becton-Dickinson, San José, CA, EUA). A GFP classificadas

+ células (pureza 97%) foram então usados ​​nos experimentos posteriores

2.5 Lentivírus Construção e transdução de células

O HA-TC1 construir. no vector plenti-DEST (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) foi descrita previamente [14]. Em resumo, um clone de entrada contendo de comprimento completo TC-1 foi criado pela nossa equipa usando o kit de clonagem TOPO direccional pENTR (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Depois do clone de entrada foi gerado, a reacção de recombinação LR foi realizada para transferir o gene no vector plenti-DEST, a fim de criar o clone de expressão. O constructo foi sequenciado para assegurar que as sequências de orientação e estavam correctas. O lentivírus foi produzido por células 293T co-transfecção com a construção de expressão plenti usando a mistura embalagem optimizada (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). as células NCI-H520 foram transduzidas com lentivírus, e o vírus plenti-LacZ foi utilizada como um controlo. A selecção foi iniciada 48 h após a infecção, em meio RPMI-1640 com 10 ug /ml de blasticidina na ausência de insulina ou EGF. Ao atingir a confluência, as células seleccionadas foram repicadas e cultivadas em série.

2.6 Tempo Real-Polymerase Chain Reaction

O ARN total foi extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) , e o ADNc foi sintetizado utilizando o PrimeScript TA mistura de PCR (Takara, Japão). Quantitative PCR foi realizada utilizando uma fluorescência contínua detectar termociclador ABI Prism 7500 Sequence Detection System (ABI, CA, EUA) com SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Japão). As medições foram realizadas em triplicado utilizando GAPDH como um controlo endógeno. qRT-PCR foi realizado utilizando os iniciadores para a CT-1 (5-AGCCACCAAGCCATC ATCAT-3, 5-TGTGTCGAAGTGGTAGCCATG-3) e GAPDH (5-AGGTCCACC ACTGACACGTT-3, 5-GCCTCAAGATCATCAGCA AT-3).

2,7 western blotting

transferência de western foi realizada como descrito anteriormente [10]. As células foram colhidas e lavadas com PBS, após cultura durante 48 h com MG-132 (dissolvido em DMSO, Cayman, América) a uma concentração final de 500 nM. quantidades iguais de proteínas das amostras foram separadas por 10% SDS-PAGE. Após transferência para uma membrana de nitrocelulose (Amersham Biosciences, Piscataway, Nova Iorque, EUA), a membrana foi incubada em tampão de bloqueio [solução salina tamponada com Tris (TBS), contendo 0,1% de Tween 20 e 5% de leite desnatado] durante 1 h a 25 ° C e, em seguida, com o anticorpo primário (TC-1, 1:300, Gene Tex, América; de p-actina, 1:500, Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA) a 4 ° C durante a noite. Em seguida, a membrana foi lavada três vezes com TBS-T e incubaram-se com anticorpos secundários marcados com peroxidase de rábano durante 2 h a 25 ° C. As bandas imunorreactivas foram reveladas usando um sistema de quimioluminescência aumentada (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), e as fotografias das bandas foram analisados ​​utilizando FluorChemTMIS-8900 (Alpha Innotech Co., San Leandro, CA, EUA).

2.8 Ensaio MTT

células (1 × 10

3 células /poço) foram semeadas em placas de 96 poços. Em uma série de pontos de tempo, 20 ul de MTT foram adicionados a cada poço, e as células foram então incubadas a 37 ° C durante 4 h. Em seguida, 150 ul de dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma, EUA) foi adicionado a cada poço. As placas foram agitadas durante 10 min, e o valor de densidade óptica (OD) foi medida a 490 nm utilizando um leitor de microplacas (Bio-Rad modelo 680, EUA). As curvas de crescimento de células foram então desenhada. Todos os experimentos foram repetidos três vezes, e os valores médios foram aprovadas.

2.9 Placa de formação de colónias Ensaio

Células (4 × 10

2 células /poço) foram semeadas em seis placas Bem e disperso uniformemente agitando ligeiramente as placas. As células foram incubadas a 37 ° C com 5% de CO

2 até que apareceram colónias visíveis. As colónias foram fixadas com etanol a 95% e coradas com solução de coloração de violeta de cristal. As colónias com mais de 40 células foram contadas utilizando um microscópio invertido, e a taxa de formação de colónias foi calculada pela fórmula seguinte: eficiência de formação de colónias da placa = (número de colónias /número de células inculcated) × 100%. Todas as experiências foram repetidas três vezes, e os valores médios foram adoptadas.

2,10 Citometria de fluxo Análise do Ciclo Celular

As células foram colhidas por tripsinização e recolhidas em tubos de centrifugação (2 × 10

6 células /tubo). Em seguida, 1 ml de PBS e 2 ml de álcool desidratado foram adicionados a cada tubo (4 ° C durante a noite) para fixar as células. Depois de RNAse e PI tratamento, a percentagem de células na fase S foi medida usando um citómetro de fluxo BD FACSAria (Franklin Lakes, NJ, EUA). Os dados foram analisados ​​usando o software ModFit LT (Verity Software House, EUA).

2,11 Fluxo de Análise de Citometria de celular apoptose

As células foram colhidas por tripsinização e recolhido em tubos de centrífuga (1 × 10

6 células /tubo). Após duas lavagens com PBS arrefecido em gelo, as células foram incubadas durante 15 min à temperatura ambiente no escuro em uma solução contendo PE-A e PerCP-Cy5.5 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, EUA) para células activadas por fluorescência análise classificador (FACS), utilizando um instrumento FACS equipada com um módulo de discriminar dupleto (Becton-Dickinson, San José, CA, EUA). Os dados foram analisados ​​utilizando o software CellQuest (Becton-Dickinson, San José, CA, EUA). Dez mil a 20.000 células foram analisadas por amostra.

2,12

In vivo

tumorigenicidade Ensaio

Para o ensaio de tumorigenicidade, de 4 a 6 semanas de idade BALB /c atímicos camundongos nus (Centro Experimental animal, The Forth Military Medical University, Xi’an, China) foram administrada por via subcutânea 5 × 10

6 A549- Plenti-shRNA1, A549- Plenti-NSRNA, NCI-H520-Plenti-TC-1 , ou as células NCI-H520-plenti-LacZ. As dimensões dos tumores foram medidos a cada cinco dias, durante um período de 30 dias utilizando um compasso de calibre linear. O volume do tumor foi calculado utilizando a seguinte equação: V (mm

3) = a x b

2/2, onde “a” é a maior dimensão e “b” é o diâmetro perpendicular. Cada grupo incluiu cinco ratinhos. Os animais foram sacrificados após 30 dias, e os tumores foram medidos e removida para um estudo mais aprofundado.

2,13

In vivo

PD173074 Tratamento Ensaio

Um total de 5 × 10

6 A549- A549 (células de suspensão de células 1:01; Matrigel) plenti-shRNA1 ou foram implantadas no flanco de ratinhos nus com 4 a 6 semanas de idade BALB /c atímicos. Quando os tumores se tornaram mensurável, 50 mg /kg /PD173074 ratinhos ou um volume equivalente de tampão sozinho foi administrado diariamente durante um total de 28 dias. Além disso, os ratinhos receberam ou não receberam duas doses de 5 mg /kg de cisplatina i.v. nos dias 1 e 15. O volume tumoral foi monitorizado utilizando um compasso de calibre linear. Os animais foram sacrificados quando a carga do tumor atingiu 15 mm de qualquer dimensão, e a sobrevivência foi registado utilizando um gráfico de Kaplan-Meier.

2,14 Análise Estatística

Os dados são expressos como a média ± padrão erro (SE). O pacote de software estatístico SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA) foi utilizado para as análises estatísticas. O teste de Mann-Whitney foi aplicado para os dados não paramétricos, eo estudante

t

teste estava usando para as comparações das médias entre dois grupos de dados de medição. Análise de variância (ANOVA) foi aplicada para comparações dos meios de vários grupos de dados de medição, e o-Newman-Keuls de Student (SNK) foi utilizado para mais comparações de cada grupo. O teste de log-rank (Mantel-Cox) foi utilizado para analisar a curva de sobrevivência. Um valor de p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

3.1 TC-1 é expressa em níveis elevados e Associated fortemente com proliferação celular em NSCLC humanas primárias

Para avaliar a expressão de TC-1 no NSCLC primária humana, imuno-histoquímica foi realizada utilizando 122 amostras de NSCLC, incluindo carcinoma de células escamosas 68 e 54 amostras de adenocarcinoma, que foram obtidos a partir de 83 machos e 39 fêmeas (Tabela 2). TC-1 expressão foi evidente em 49 (72,06%) das amostras de carcinoma de células escamosas e 41 (75,93%) das amostras de adenocarcinoma. A expressão de CT-1 foi principalmente localizada no citoplasma, mas também uma coloração nuclear foi parcialmente presente. Em tecido pulmonar normal, as células epiteliais brônquicas não neoplásico e alveolares foram consistentemente não reactivo ou reactivo de baixo para TC-1 (Fig. 1). Além disso, TC-1 expressão apresentou pequenas diferenças entre sexo, idade e subtipos histológicos (P 0,05, Tabela 2).

coloração imuno-histoquímica intensivo para TC-1 em adenocarcinomas do pulmão (A) e carcinomas de células escamosas (B). Não-reactividade para TC-1 em células epiteliais alveolares normais (C). (Ampliação × 200).

A correlação entre TC-1 expressão e proliferação de células de NSCLC foi analisada por detectar a expressão de Ki-67. Conforme resumido na Tabela 2, houve uma diferença estatisticamente significativa entre o grupo de alto proliferação (Ki-67 índice de marcação 10%) e do grupo de baixo-proliferação (Ki-67 índice de marcação ≤10%), tanto no escamosas do pulmão amostras de carcinoma e adenocarcinoma (p 0,05), sugerindo que o CT-1 expressão está fortemente correlacionada com a proliferação das células do NSCLC

3.2 Geração de clones estáveis ​​de células que sobre-expressam ou NSCLC downregulating TC-1