Sumário

Várias células de mamíferos, incluindo células cancerosas, derramou vesículas extracelulares (SVE), também conhecidos como exossomos e microvesículas, para os tecidos circundantes. Estes desempenham um papel VE no crescimento de tumores e metástases através da promoção da angiogénese. No entanto, o mecanismo detalhado de como os VE derivada-cancerosas eliciar a activação de células endoteliais continua a ser desconhecido. Aqui, forneceu a evidência de que o crescimento precoce de resposta-1 (Egr-1) de activação em células endoteliais está envolvida na actividade angiogénica de VE derivadas de células de cancro colorrectal. Tanto o ARN regulação negativa mediada por interferência de Egr-1 e ERK1 /2 ou inibidor de JNK bloqueou significativamente EV mediada por activação de Egr-1 e migração de células endoteliais. Além disso, lipídios inibidor da endocitose mediada por jangada bloqueado endotelial Egr-1 ativação e migração induzida por EVs derivadas de câncer. Os nossos resultados sugerem que a activação de Egr-1 em células endoteliais pode ser um mecanismo de chave envolvido na actividade angiogénica dos derivados VE-cancerosas. Estes resultados vão melhorar a nossa compreensão sobre as atividades pró-angiogénico de EVs em diversas condições patológicas, incluindo câncer, doenças cardiovasculares e doenças neurodegenerativas

Citation:. Yoon YJ, Kim DK, Yoon CM, Parque J, Kim YK, Roh TY, et al. (2014) Egr-1 Ativação pelo Cancer-Derived Extracelular vesículas Promove a migração de células endoteliais através de ERK1 /2 e JNK vias de sinalização. PLoS ONE 9 (12): e115170. doi: 10.1371 /journal.pone.0115170

editor: Shilpa J. Buch, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 24 de junho de 2014; Aceito: 19 de novembro de 2014; Publicação: 12 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Yoon et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa Pesquisador Mid-carreira através de concessão NRF financiado pelo MEST (No. 2014023004), BK21 Plus (10Z20130012243), financiado pelo Ministério da Educação , Coreia do Sul, e da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (2011-0030049). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Vários tipos de células de mamífero, tais como células cancerosas, macrófagos, células endoteliais, plaquetas e células epiteliais libertar vesículas extracelulares (SVE) em seus arredores dos compartimentos da membrana endossomal e o plasma [1] – [4] . Estes veículos eléctricos de mamíferos, também conhecida como exossomas e microvesículas, são Proteolipídeos bicamada esféricas com um diâmetro médio de 40-250 nm e são enriquecidos com vários componentes bioactivos, incluindo proteínas, lípidos e material genético [1] – [9]. Evidências crescentes têm revelado que o SVE desempenhar funções pleiotrópicas na comunicação intercelular:. VE estimular células receptoras pela activação de um receptor e a transferência de proteínas de membrana, moléculas de sinalização, de mRNAs, e miARNs [4] – [9]

VE têm sido muitas vezes referido como “pó celular”, embora as células derramado VE quer constitutivamente ou em uma forma regulada [1] – [9]. Além disso, as proteínas, os mRNAs, ou miARN no SVE diferem em composição dependendo dos estados de células dadoras [1], [4]. Recentemente, nosso grupo revelou que as proteínas de EVs derivadas de células de câncer colorretal humanos estão interligados através de interações físicas e agrupamento em módulos funcionais envolvidos na biogênese e função EV [4], [10]. Além disso, a secreção de VE é um processo celular universal que ocorre a partir de organismos simples (Archea ou Gram-negativas e bactérias gram-positivas) para organismos multicelulares complexos, sugerindo que esta comunicação mediada por EV é evolutivamente conservada [9], [11] – [13]. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que EVs desempenhar diversos papéis na comunicação intercelular [6], [10]. No entanto, os papéis patofisiológicos do SVE não são completamente compreendidos.

A angiogénese, a formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasculatura preexistente, é um processo complexo de múltiplos passos e que envolve a adesão, migração, invasão, proliferação e diferenciação de células endoteliais [14], [15]. Esta neovascularização ocorre sob várias condições normais e patológicas [14]. Por exemplo, a angiogénese é essencial para o crescimento de tumores e metástases por fornecimento de oxigénio e nutrientes para o tumor em crescimento [15]. No microambiente tumoral, uma população heterogénea de células, incluindo células cancerosas, células endoteliais, fibroblastos e células do sistema imunológico modula um ambiente favorável para o crescimento de tumores e invasão [16] – [18]. Estas células cancerosas e do estroma segregam factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), factor de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2), fator de necrose tumoral-α (TNF-α), e IL-6 para o meio envolvente e estes factores contribuem para a angiogénese associada a tumores [16] – [19].

em adição a estes factores solúveis pró-angiogénico, as células que constituem o tecido tumoral segregam VE para o meio extracelular e estes derramado VE desempenham múltiplos papéis no crescimento de tumores e metástases através da promoção da angiogénese, invasão do tumor, e de escape imune [4] – [8], [20] – [23]. Após o primeiro relatório sobre as atividades angiogénicos de EVs derivados de fibrossarcoma humano HT1080 e 145 du-células de carcinoma da próstata humanos [5], vários estudos confirmaram que EVs derivada de células cancerosas, fibroblastos e células-tronco cancerosas promover a

in vitro

e

in vivo

angiogênese [4], [8], [24] – [28]. Estas actividades angiogénicas de veículos eléctricos são mediadas por lípidos vesicular (s), proteínas, incluindo os receptores e proteínas de tetraspaninas, mRNAs, e miARNs. No entanto, o mecanismo detalhado de como os VE induzir actividade angiogénica não tem sido extensivamente estudada.

de crescimento precoce de resposta-1 (Egr-1), um gene precoce imediato e um factor de transcrição de dedos de zinco, desempenha um papel crucial na angiogénese [29] – [32]. Em adição ao soro de exposição, de Egr-1 podem ser rapidamente e de forma transiente induzido por citocina, factor de crescimento, e stress ambiental, incluindo a hipóxia, a tensão de cisalhamento de fluidos, e a lesão vascular [33], [34]. Egr-1 regula a expressão de genes pró-angiogénico, como o VEGF, FGF2, e IL-6 em células endoteliais ou TNF-α em macrófagos [31], [34] – [36]. Dentro do tecido do tumor, as células endoteliais, as células cancerosas, fibroblastos e macrófagos infiltrantes de tumor pode expressar de Egr-1. Além disso, as densidades de microvasos em tecidos de tumor obtidos a partir de Egr-1 deficientes em ratinhos são mais baixos do que os obtidos a partir de ratinhos de tipo selvagem [37] e de um recipiente semelhante a formação da estrutura em tecido de tumor foi suprimido por ADNzimas que têm como alvo de Egr-1 de ARNm [31] , sugerindo que a Egr-1 desempenha um papel essencial no crescimento tumoral e angiogénese. A este respeito, vários estudos têm relatado que a expressão de Egr-1 em células cancerosas, células endoteliais, macrófagos e está relacionada com progressão tumoral [32], [36] – [38]. Colectivamente, estes resultados sugerem que Egr-1 desempenha um papel importante na angiogénese associada ao tumor e progressão tumoral.

Neste relatório, nós fornecemos evidências de que Egr-1 ativação em células endoteliais deve ser um mecanismo-chave envolvidos no actividade angiogénica de EVs derivadas de câncer. Descobrimos que Egr-1 ativação por EVs derivadas de células de câncer colorretal promoveu a migração de células endoteliais através da /2 e JNK vias de sinalização e de lípidos endocitose mediada por jangada ERK1.

Materiais e Métodos

celular cultura

adenocarcinoma colo-rectal humano (SW480), o carcinoma colorrectal (HCT116), adenocarcinoma do pulmão (A549), e fibrosarcoma (HT1080), e células epiteliais brônquicas normais (BEAS-2B) foram mantidas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; Invitrogen), 100 U /mL de penicilina, e 0,1 mg /ml de estreptomicina. neuroblastoma humano (SH-SY5Y) e células de carcinoma da próstata PC3 () foram mantidas em MEM (Invitrogen) suplementado com 10% de FBS, 100 U /mL de penicilina, e 0,1 mg /ml de estreptomicina. SW480, HCT116, A549, HT1080, SH-SY5Y, PC3, e BEAS-2B foram adquiridos da American Type Culture Collection. células endoteliais microvasculares humanas (HMEC-1S) foram cultivadas em Meio de Crescimento Endotelial-2 (EGM-2; Lonza, Walkersville, MD, EUA) [5]. As células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) foram isoladas a partir de cordões umbilicais recém entregues e mantida como descrito previamente [39]. As HUVECs foram cultivadas em meio 199 (Invitrogen) suplementado com FBS a 20%, 3 ng /mL de FGF2 (R D Systems, Minneapolis, MN, EUA), 5 U /mL de heparina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) , 100 U /mL de penicilina, e 0,1 mg /ml de estreptomicina. As células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2. Todas as linhas celulares estavam livres de micoplasma confirmada usando e-MyCo Mycoplasma PCR Detection Kit (Intron Biotecnologia. Inc., Seoul, Coreia do Sul).

Purificação do SVE

EVs foram purificados por uma combinação de centrifugação diferencial, a ultrafiltração usando uma membrana de fibra oca 100 kDa, ultracentrifugação em almofadas de sucrose, e ultracentrifugação com gradiente de iodixanol densidade de acordo com métodos previamente estabelecidos [8]. Resumidamente, as células confluentes de 80-90% foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato e depois foram incubadas durante 24 h em meio RPMI 1640 isento de soro (SW480, HCT116, A549, HT1080, e BEAS-2B) ou meio MEM isento de soro ( SH-SY5Y e PC3). Cerca de 2000 ml de meio condicionado foi centrifugado a 500

g

durante 10 min, e depois duas vezes em 2000

g

durante 15 minutos para eliminar a contaminação celular. O sobrenadante foi ainda mais concentrado utilizando o Sistema de bancada QuixStand com uma membrana de fibra oca 100 kDa (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA). O concentrado (~ 35 mL) foi colocada em cima de 0,5 mL de 0,8 e 2,0 m almofadas de sucrose em tampão (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) e depois centrifugadas a 100000

g

durante 2 horas (SW 32 rotor balanço balde de Ti com um fator K de 256,8). EVS (0,5 ml) foram colhidas a partir da interface entre as almofadas de 0,8 e 2,0 M de sacarose, diluída com 9 mL de salino tamponado com fosfato, colocados em cima de 0,35 mL de 0,8 M e 0,15 mL de 2,0 M almofadas de sucrose, e centrifugado a 100,000

g Compra de 2 h (SW 41 rotor balanço balde de Ti com um fator K de 256,6). EVS (0,5 ml) foram colhidas a partir da interface entre as almofadas de 0,8 e 2,0 M de sacarose, e foram diluídas com 1,42 ml de solução salina de fosfato tamponada e 2,88 mL de 50% de iodixanol (Axis-Shield PoC AS, Nycomed, Noruega), a dar origem a 30% de iodixanol. Esta amostra foi colocada no fundo de um tubo e coberta com 3 ml de 20% de iodixanol e 2,5 mL de 5% de iodixanol. Após centrifugação a 200.000

g

durante 2 horas (SW 41 rotor de balanço balde de Ti com um factor-k de 128,3), 10 fracções de igual volume (1 mL) foram removidas a partir do topo do gradiente. Finalmente, os veículos eléctricos purificadas foram medidas pelo seu teor de proteína utilizando o ensaio de proteína de Bradford (Bio-Rad, Munique, Alemanha) e aplicado a outros ensaios. Obtivemos 70-150 ug de VE em proteínas totais de ~2,000 mL de 24 h o meio condicionado isento de soro de células cancerosas (SW480, HCT116, A549, HT1080, SH-SY5Y e PC3): o rendimento de VE da mesma quantidade de células normais humanas epiteliais brônquicas (BEAS-2B) é ~ 10 ug de proteína total.

Western blot análise

Cada uma das fracções de gradientes de densidade de iodixanol foi separada por SDS-PAGE e depois transferidos para uma membrana de difluoreto de polivinilideno. A membrana foi bloqueada e incubadas com anti-ratinho CD81 (BD Biosciences, San Jose, CA), rato de anticorpo anti-CD63 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anticorpo de ratinho anti-GM130 (BD Biosciences), e de murganho anti -cytochrome

C

anticorpo (BD Biosciences), seguida por anticorpos anti-ratinho de cabra conjugado com peroxidase de rábano (Santa Cruz Biotechnology). As bandas imunorreactivas foram visualizadas com um substrato chemiluminnescent.

ensaio de murino Matrigel e imunocoloração

Foram utilizados camundongos selvagens 6-8 semanas de idade do Laboratório Jackson. Os ratinhos (n = 5) foram injectados por via subcutânea com 0,5 ml de Matrigel (BD Biosciences) contendo 20 ug de VE-SW480 derivada ou salino tamponado com fosfato (Invitrogen). No dia 7 após a injecção, os ratinhos foram mortos, e o Matrigel foi removida e corada para o conjunto de montagem de imunofluorescência. Os vasos sanguíneos foram imunocoradas com anticorpo anti-CD31 de cabra (Cell Signaling Technology), seguido por anticorpo anti-cabra de burro AlexaFluor488 (Invitrogen). Todas as imagens foram visualizadas utilizando um microscópio confocal FV1000 Olympus (Olympus, Tóquio, Japão) equipado com uma lente objetiva UPlanSApo 20 × /0,75 e adquiridos utilizando FV1000-ASW 1,5 software (Olympus). A área de CD31-positivo (mm

2) na imagem de imunofluorescência foi quantitativamente analisados ​​usando o software ImageJ (National Institutes of Health). Todos os animais receberam cuidados humanos, e foram aprovados os experimentos pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade Pohang de Ciência e Tecnologia, Pohang, República da Coreia (número de aprovação: 2011-01-0015).

Risco cicatrização de feridas ensaio

HMEC-1s foram plaqueadas em placas de cultura celular de 24 poços (Corning Inc., Corning, NY, EUA) a uma densidade de 1 x 10

5 células por cavidade e deixadas a ligar durante a noite. HMEC-1s confluentes foram feridos por um zero deliberada e incubadas com controlo, derivado VE-SW480 (1 ug /mL, 0,5 mL), ou EGM-2. Doze horas após a lesão, as células foram lavadas em solução salina tamponada com fosfato, coradas com CellTracker (Invitrogen), e fixados em paraformaldeído a 4% antes de imagem de fluorescência. As imagens foram visualizadas sob uma Olympus 1 × 81 invertida microscópio de fluorescência (Olympus) e adquiriu usando software Metamorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA).

proliferação endotelial ensaio

HMEC-1s eram plaqueadas em placas de cultura celular de 24 poços (Corning Inc., Corning, NY) com lamelas de vidro (Fisher Scientific, Rochester, NY, EUA) a uma densidade de 5 x 10

4 células por cavidade e deixadas a ligar durante a noite. Depois de 24 h de tratamento com o controlo, VE derivado de SW480 (1 ug /mL, 0,5 mL), ou EGM-2, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% e incubadas com anticorpo de coelho anti-fosfo-histona H3 (PH3) (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) seguido por anticorpo IgG anti-coelho de cabra AlexaFluor488 (Invitrogen). Os núcleos foram contra-coradas com Hoechst (Sigma-Aldrich). As imagens foram visualizadas sob um microscópio confocal FV1000 Olympus (Olympus) e adquiriu usando FV1000-ASW software 3.0 (Olympus). A percentagem de células positivas PH3 foi quantificada por contagem das células com sinais de fluorescência co-localizado.

em tempo real de RT-PCR

iniciadores de PCR utilizados neste estudo foram concebidos utilizando o programa Primer3 (Instituto Whitehead, https://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi). Os iniciadores utilizados para a amplificação do gene foram como se segue: para a frente GAPDH, 5′-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3 ‘; inversa GAPDH, 5’-TTCACACCCATGACGAACAT-3 ‘; EGR1 para a frente, 5’-CCGCAGAGTCTTTTCCTGAC-3 ‘; EGR1 reverso, 5’-AGCGGCCAGTATAGGTGATG-3 ‘. HMEC-1s (2 × 10

5 células) plaqueadas em 6 cavidades da placa de cultura de células foram tratadas com os VE (1 ug /mL, 2,0 mL) durante 0,5, 1, 1,5, 2 e 4 h. O ARN foi extraído de células cultivadas utilizando o RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, EUA). Para tempo real de RT-PCR, o ARN total (100 ng) foi amplificado com um Kit de SYBR One Step RT-PCR (Takara Bio, Tóquio, Japão), utilizando um sistema de PCR LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha). A amplificação foi levada a cabo por aquecimento das amostras a 50 ° C durante 2 min, depois a 95 ° C durante 10 min, seguido de ciclos de repetição a 95 ° C durante 15 seg, 55 ° C durante 10 seg, e 72 ° C durante 10 segundo, para um total de 45 ciclos. O método Ct comparativo foi utilizado para a quantificação relativa da expressão do gene alvo contra a de um gene housekeeping, GAPDH [40].

Egr-1 translocação nuclear

HMEC-1s foram semeadas em 24- se placas de cultura celular (Corning Inc.) com lamelas de vidro (Fisher Scientific) a uma densidade de 5 x 10

4 células por cavidade e deixadas a ligar durante a noite. As células foram tratadas com o derivado VE-SW480 (1 ug /mL, 0,5 mL), fixadas com paraformaldeído a 4%, e incubadas com anti-Egr-1 de anticorpo de coelho (Cell Signaling Technology, Hitchin, Reino Unido), seguido de cabra anti-AlexaFluor488 anticorpo IgG de coelho (Invitrogen). Os núcleos foram contra-coradas com Hoechst (Sigma-Aldrich). As imagens foram visualizadas sob um microscópio confocal FV1000 Olympus (Olympus) e adquiriu usando FV1000-ASW software 3.0 (Olympus). A percentagem de células de Egr-1-positivos foi quantificado por contagem das células com sinais de fluorescência co-localizado.

Para investigar o efeito de inibidores da sinalização (Biomol Research Laboratories, Plymouth Meeting, PA, EUA) ou metil- β-ciclodextrina (MβCD; Sigma-Aldrich) em Egr-1 translocação nuclear, HMEC-1s foram tratados com ERK1 2 /inibidor (PD98059, 20 mM), inibidor de p38 MAPK (SB203580, 10 mM), inibidor de JNK (SP600125, 20 uM), inibidor da Akt (BML-257, 20 uM), ou MβCD (10 mM) na presença ou ausência de VE-SW80 derivados (1 jig /mL).

regulação negativa de ARN mediada por interferência de Egr -1

pequeno ARN interferente (siRNA) de Egr-1 (Bioneer, Daejeon, Coreia) a uma concentração final de 50 nM foi transfectado em HMEC-1S usando Welfect-Q (Welgene, Taegu, Coreia). Não silenciamento mexidos siARN foi utilizado como controlo negativo. Após 48 h, as células foram usadas para análise em tempo real de RT-PCR para determinar o nível de expressão de Egr-1 mRNA de Egr-1 Os ensaios de translocação nuclear, e ensaios de cicatrização de feridas zero. As sequências de siRNA foram como se segue: siARN mexidos, 5′-CCUACGCCACCAAUUUCGU-3 ‘; Egr-1 siRNA-1, 5’-CAGUAUCAUCUCCAUCAUA-3 ‘; Egr-1 siRNA-2, 5’-AGUUUGCCAGGAGCGAUGA-3 ‘; Egr-1 siRNA-3, 5’-GUGCAAUUGUGAGGGACAU-3 ‘.

EV absorção

VE

SW480 derivadas foram marcadas com DiI (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. VE Resumidamente, SW480 derivadas (100 ug) foram incubados com DII (1 uM) durante 15 min a 37 ° C e centrifugou-se a 100000

g

durante 2 h a 4 ° C (Tipo 90 Ti rotor de ângulo fixo com um factor-k de 126,4). Os peletes, VE DII marcadas, foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato, e depois de ultracentrifugação a 100000

g

durante 2 h a 4 ° C (Tipo 90 Ti rotor de ângulo fixo com um factor-k de 126,4), foram ressuspensas em solução salina tamponada com fosfato. HMEC-1s foram pré-tratados ou sem MβCD (10 mM) durante 0,5 h, e depois incubadas com VE-SW480 derivada DII-marcados (1 ug /mL, 0,5 mL) durante 1 h. As células foram então fixadas com 4% de paraformaldeído e os núcleos foram corados com Hoechst (Sigma-Aldrich). As imagens foram visualizadas sob um microscópio confocal FV1000 Olympus (Olympus) e adquiriu usando software FV1000-ASW 3.0 (Olympus).

Análise estatística

Todos os valores são expressos em média ± S.D.

valores

P foram calculados a partir de uma forma ou de duas vias de análise de variância (ANOVA) com correção de Bonferroni, com base em comparações com as amostras de controlo adequadas testadas ao mesmo tempo.

Resultados

EVs derivados de SW480 promovem

in vivo

e

in vitro

angiogênese

EVs divulgados pelo SW480 células foram purificados a partir de sobrenadantes de cultura por uma combinação de centrifugação diferencial , ultrafiltração utilizando uma membrana de fibra oca 100 kDa, ultracentrifugação em almofadas de sucrose, e gradientes de densidade iodixanol como relatado [8]. Consistente com o estudo anterior [8], os veículos eléctricos purificada tinha uma densidade de ~1.098 g /ml e guardado CD81 e CD63, as proteínas marcadoras de EV (Fig. 1A). No entanto, estes veículos eléctricos purificado não continha GM130 (

cis

-Golgi proteína) e citocromo

C

(uma proteína mitocondrial encontrado em corpos apoptóticos): estas duas proteínas são bem conhecidos não- proteínas vesiculares (Fig. 1B). O primeiro mostrou que EVs derivadas de células humanas de adenocarcinoma colorectal SW480 induzidas

in vivo

neovascularização (Fig. 1C e 1D). Quando os VE-SW480 derivadas dentro de Matrigel foram injectadas subcutaneamente em ratos, foi observada uma formação maciça de estruturas de vasos do tipo CD31-positivas (Fig. 1C). Em contraste, nenhuma formação de vasos aparente foi detectado no Matrigel sem VE. VE induzida significativamente um aumento de 10,4 vezes na área da CD31-positivo em Matrigel, quando comparado com o controlo não tratado (Fig. 1D).

(A, B) VE libertadas por células SW480 foram purificados a partir de sobrenadantes de cultura por uma combinação de centrifugação diferencial, ultracentrifugação em almofadas de sucrose, e gradientes de densidade de iodixanol. Cada uma das fracções de gradientes de densidade de iodixanol foi analisado por transferência de Western para detectar CD81 e CD63, as proteínas marcadoras de VE (A). Os EVs purificados na fração 3 foram analisados ​​por Western blot para detectar proteínas marcadoras não-VE (GM130 e citocromo

c

). SW480 derivada de lisado celular total (WCL; 10 ug) e VE-SW480 derivada (SVE; 10 ug) foram carregadas para análise de transferência Western (B). (C, D) de Matrigel na presença ou ausência de VE-SW480 derivadas (20 ug) foi injectada subcutaneamente em ratinhos C57BL /6. Após 7 dias, a toda a coloração de montagem de Matrigel com anticorpo anti-CD31 foi realizada (n = 5). Representativas fotografias Z-stack confocal de peças inteiras coradas para CD31 (verde) são mostrados em bares painel C. escala representam 100 mm. intensidades de fluorescência de CD31 coloração do plano Z-pilha de Matrigel foram medidos tal como descrito nos métodos (D). (E) a atividade migratória de EVs derivados de SW480 foi avaliada por um ensaio de cicatrização zero. HMEC-1s confluentes foram riscados e tratou-se com derivados de VE SW480 (1 ug /ml); em seguida, o número de células que migraram na zona desnudadas foi avaliada após 12 h (n = 3). (F) a actividade proliferativa de VE-SW480 derivada (1 ug /ml) foi avaliada por avaliação da mitose PH3 marcador. Após 24 h, a PH3 e os núcleos foram coradas com anticorpo anti-PH3 e Hoechst, respectivamente, e avaliada por microscopia confocal. A percentagem de células positivas em PH3 HMEC-1s foi quantificada por contagem das células com sinais de fluorescência co-localizado (n = 3). Como um controlo positivo, HMEC-1s foram tratados com meio EGM-2 suplementado com diferentes factores angiogénicos, tais como EGF, FGF2, VEGF, IGF1 e. Os dados são representados como média ± DP. *,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01; ***,

P Art 0,001; n.s., não significativo.

A seguir, investigou a atividade pró-angiogénico de EVs derivados de SW480 em células endoteliais humanas, HMEC-1s

in vitro

. Raspadinhas ensaios para cicatrização de feridas revelaram que os VE induziu um aumento de 4,1 vezes no número de células endoteliais migraram para a zona de desnudada em comparação com o controlo não tratado (Fig. 1E). Além disso, VE potentemente estimulou a proliferação de células endoteliais: a percentagem de células positivas aumentou PH3-8,9-vezes ao longo de que as células não estimuladas (Fig 1F.). O controlo positivo, EGM-2 suplementado com diferentes factores angiogénicos, tais como EGF, FGF2, VEGF, IGF1 e, tanto a migração de células endoteliais induzida também e proliferação. As actividades migratórias e proliferativas de VE-SW480 derivadas foram também observadas em outras células endoteliais, células HUVEC (dados não mostrados). Portanto, nossos dados indicam que EVs derivados de SW480 têm

in vivo

e

in vitro

atividades angiogénicos.

SW480 derivado EVs induzir Egr-1 ativação em células endoteliais

Egr-1 desempenha um papel crucial na angiogénese associada ao tumor [29] – [32]. Temos, assim examinada a possibilidade de a activação de células endoteliais de Egr-1 por VE-SW480 derivadas (Fig. 2). A análise em tempo real de RT-PCR revelou que o tratamento com VE-SW480 derivada causou uma elevação rápida e transiente de Egr-1 expressão ao nível da transcrição em células endoteliais humanas, HMEC-1s e HUVECs (Fig. 2A). Utilizou-se HMEC-1s nas experiências seguintes. Além disso, VE a partir de outras células humanas de cancro (carcinoma colo-rectal HCT116, adenocarcinoma A549 do pulmão, fibrossarcoma HT1080, carcinoma PC3 da próstata, e de neuroblastoma SH-SY5Y) também induziu Egr-1 a expressão de ARNm em células endoteliais humanas, que o SVE a partir de células epiteliais brônquicas humanas normais (BEAS-2B) não (Fig. 2B). Nós investigado Egr-1 ativação após a estimulação por EVs SW480-derivados. VE induzida a expressão rápida e transiente e a translocação nuclear de Egr-1 na proteína HMEC-1s; Observou-se o efeito máximo a 1 h após o tratamento VE (Fig. 2C e 2D). Tomados em conjunto, os VE derivada-cancerosas induzir activação de Egr-1 por aumento da sua expressão e a translocação nuclear de células endoteliais. Estas observações sugerem que a activação de Egr-1 podem ser críticos para a modulação da angiogénese induzida por EV.

(A) HMEC-1s e HUVEC foram incubadas com o derivado VE-SW480 (1 ug /ml) ou controlo não tratado. ARNm foi isolado a partir de células de controlo não tratadas ou células tratadas com SVE para 0, 0,5, 1, 2 e 4 h, e analisadas usando tempo real de RT-PCR (n = 3). Os valores representam a Egr-1 mRNA /GAPDH mRNA normalizados para células de controlo não tratadas. (B) HMEC-1s foram tratados com os VE (/mL 1 ng) derivadas do carcinoma HCT116 colorrectal, adenocarcinoma A549 do pulmão, fibrossarcoma HT1080, carcinoma da próstata PC3, neuroblastoma SH-SY5Y, e BEAS-2B células epiteliais brônquicas normais durante 0,5 h ( n = 3). (C, D) Em HMEC-1s, a translocação nuclear de Egr-1 de proteína após estimulação com VE derivado de SW480 (1 ug /ml) durante 0,5, 1, 2, e 4 h foi analisada por microscopia confocal (n = 3) . proteínas núcleos e Egr-1 foram coradas com Hoechst (azul) e anticorpo anti-Egr-1 (vermelho), respectivamente. sinais de fluorescência localizada-Co (roxo) indicam a translocação de Egr-1 para o núcleo. fotografias representativas são mostrados no painel de bares C. escala representam 30 mm. A percentagem de núcleos de Egr-1-positivas foi determinada medindo o número de células com núcleo sinais co-localizada mais a de células totais (D). Os dados são representados como média ± DP. *

P Art 0,05; **

P Art 0,01; **

P Art 0,001; ns, não significativo.

Egr-1 migração de células endoteliais siRNA atenua a migração de células endoteliais induzida por EVs derivados de SW480

A seguir, investigou o papel de Egr-1 em EV-induzida usando siRNA. Quando examinámos três siRNAs de Egr-1, verificou-se que Egr-1 siRNA-1 mais eficazmente reduzido o nível de ARNm de Egr-1 em células endoteliais mas mexidos siRNA não mostrado este efeito inibidor (Fig. 3A). As células endoteliais tratadas com Egr-1 siRNA-1 bloqueou eficientemente a Egr-1 activação induzida por EV (Fig. 3B) e a migração como observado em scratch ensaios para cicatrização de feridas (FIG. 3C e 3D) enquanto mexidos siRNA não mostram esses efeitos inibitórios . Assim, os nossos resultados indicaram que a expressão e a translocação nuclear de Egr-1 EV-induzida em células endoteliais deve contribuir para a migração de células endoteliais induzida por EV.

(A) HMEC-1s foram transfectadas com 50 nM de ARNsi mexidos ou de Egr-1 siRNA-1, de Egr-1 siRNA-2, ou de Egr-1-3 siRNA. ARNm foram isolados a partir das células após 48 h e o nível de ARNm de Egr-1 foi analisada utilizando tempo real de RT-PCR (n = 3). (B) a translocação nuclear de Egr-1 de proteína após estimulação com VE derivado de SW480 (1 ug /mL) durante 1 h foi analisada em siRNA mexidos (50 nM) ou de Egr-1 siRNA-1 (50 nM) transfectadas HMEC-1s (n = 3). (C, D) confluentes HMEC-1s transfectadas com ARNsi mexidos (50 nM) ou de Egr-1 siRNA-1 (50 nM) foram riscados e tratou-se com derivados de VE SW480 (1 ug /ml); em seguida, o número de células que migraram na zona desnudadas foi avaliada após 12 h (n = 3). O número de células que migraram na zona desnudada de cada grupo é mostrado no painel D. barras de escala representam 100 um. Os dados são representados como média ± DP. *

P Art 0,05; **

P Art 0,01; ***

P Art 0,001; ns, não significativo.

ERK1 /2 e JNK vias de sinalização estão envolvidos em Egr-1 ativação induzida por EV e migração em células endoteliais

A seguir, investigou as vias de sinalização envolvidas na EV mediada por activação de Egr-1. ERK1 /2 inibidor (PD98059) e inibidor de JNK (SP600125) quase completamente suprimida translocação nuclear de Egr-1 em células endoteliais após estimulação com VE derivado de SW480, mas inibidor de p38 MAPK (SB203580) e inibidor da Akt (BML-257) não teve efeito (Fig. 4A e 4B). Além disso, observou-se que PD98059 e SP600125 tratamentos quase completamente bloqueada migração de células endoteliais induzida por EV enquanto estes inibidores mostraram nenhum efeito aparente sobre a migração de células basais endoteliais (Fig. 4C e 4D). Além disso, PD98059 ou SP600125 inibiu quase completamente o

in vivo

angiogénicos atividades de EVs derivados de SW480 (Fig. 4E e 4F). Todas estas observações indicaram que os /2 e vias de sinalização JNK ERK1 são essenciais para activação de Egr-1, a migração celular endotelial, e

In vivo

angiogénese.

(A, B) HMEC-1s foram pré-tratados com inibidores de sinalização durante 1 h e em seguida estimuladas durante 1 h com VE-SW480 derivada (1 ug /ml). translocação nuclear de proteína Egr-1 foi analisada através de microscopia confocal (n = 3). proteínas núcleos e Egr-1 foram coradas com Hoechst (azul) e anticorpo anti-Egr-1 (vermelho), respectivamente. sinais de fluorescência localizada-Co (roxo) indicam a translocação de Egr-1 para o núcleo. Fotografias representativas são mostrados no painel A. A percentagem de núcleos de Egr-1-positivas foi determinada medindo o número de células com núcleo sinais co-localizada sobre as células totais (B). (C, D) confluentes HMEC-1s foram riscados e tratou-se com derivados de VE SW480 (1 ug /ml) na presença ou ausência de inibidores de sinalização; em seguida, o número de células que migraram na zona desnudadas foi avaliada após 12 h (n = 3). Fotografias representativas de imagem microscópica confocal são mostrados no painel C e o número de células que migraram na zona desnudada de cada grupo é mostrado no painel D. inibidor de ERK1 /2, PD98059 (20 uM); p38 MAPK inibidor, SB203580 (10 uM); inibidor de JNK, SP600125 (20 uM); inibidor da Akt, BML-257 (20