Abstract

Os microRNAs (miRNAs) são RNAs pequenos, não codificantes que podem funcionar como oncogenes ou supressor de tumor genes em cancros humanos. A evidência emergente revela que a desregulação de miARNs contribui para o cancro do pulmão de células humanas não pequenas (NSCLC). No presente estudo, foi demonstrado que os níveis de miR-132 de expressão foram drasticamente diminuída em linhas de células NSCLC e examinadas amostras de tecido NSCLC clínicos. Em seguida, verificou-se que a introdução de miR-132 suprimiu significativamente a migração e a invasão de células do cancro do pulmão in vitro, sugerindo que o miR-132 pode ser uma nova supressor de tumor. Outros estudos indicaram que o fator de transcrição ZEB2 relacionadas com a EMT foi um genes alvos diretos de miR-132, evidenciada pela ligação direta de miR-132 com ‘região não traduzida (3’ a 3 UTR) do ZEB2. Além disso, o miR-132 poderia diminuir a expressão de ZEB2 nos níveis de ARNm e proteína. Notavelmente, a EMT marcador E-caderina ou vimentina, a jusante da ZEB2, também foi regulada para baixo ou para cima regulada mediante tratamento miR-132. Para além disso, que sobre-expressam ou silenciamento ZEB2 foi capaz de elevar ou inibir a migração e a invasão de células do cancro do pulmão, em paralelo com o efeito de miR-132 em células de cancro do pulmão. Enquanto isso, o knockdown de ZEB2 reverteu a migração avançada ea invasão mediada por anti-miR-132. Estes resultados indicam que o miR-132 suprime a migração e a invasão de células NSCLC através segmentação ZEB2 envolvendo o processo de TEM. Assim, a nossa descoberta fornece uma nova visão sobre o mecanismo de progressão NSCLC. Terapeuticamente, miR-132 pode servir como um alvo potencial no tratamento de cancro do pulmão humano

citação:. Está J, Li Y, Fang N, Liu B, Zu G, Chang R, et al. (2014) miR-132 Suprime a migração e invasão das células cancerosas do pulmão

via

Segmentação do EMT Regulador ZEB2. PLoS ONE 9 (3): e91827. doi: 10.1371 /journal.pone.0091827

Edição: Pan-Chyr Yang, da Universidade Nacional de Taiwan, Taiwan

Recebido: 19 de setembro, 2013; Aceito: 15 de fevereiro de 2014; Publicação: 13 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Você et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi parcialmente financiado pelas doações do Projeto chave da National Natural Science Foundation da China (No.81000950), 863 Programa Nacional (No.2012AA02A201, No.2012AA02A502), Nacional 973 Programa (No.2010CB529405), Tianjin Programa Sistema de Inovação científica (No.07SYSYSF05000, No.07SYSYJC27900), China-Suécia Cooperative Foundation (No.09ZCZDSF04100) e Projeto principal Programa de Apoio Sci-tech Tianjin de (No.06YFSZSF05300). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é uma das causas mais comuns de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo, e, na maioria dos cancros do pulmão são o câncer de pulmão de pequenas células não-(NSCLC), que compreende cerca de 80% de todos os cânceres de pulmão [1 ]. Doentes portadores do NSCLC são frequentemente diagnosticada como um estágio avançado, sofrendo por doenças metastatically ou localmente avançado, fazendo quase 90% dos pacientes com câncer de pulmão morrem de metástases [2]. Apesar de grandes esforços e progressões foram feitas no estudo do cancro do pulmão nas últimas décadas, o mecanismo molecular de metástase de câncer de pulmão permanece indefinida.

O microRNA (miRNA) é uma classe de RNAs pequenos, não-codificantes com cerca de 19-25 nucleótidos. Ela regula negativamente a expressão do gene ao nível da pós-transcrição, interagindo com as regiões não traduzidas a 3 ‘(UTRs) de 3’- mRNAs alvo [3], [4]. MiRNAs são filogeneticamente conservada e desempenham um papel crucial num certo número de processos biológicos, incluindo o desenvolvimento, diferenciação, apoptose, metabolismo, imunidade e progresso do tumor [5], [6]. Além disso, cada vez mais provas indica microARNs pode modular a iniciação e progressão do tumor e função na invasão de células de tumores e metástase [7], [8], [9], [10]. Estudos anteriores têm documentado o papel de miR-132 na regulação da diferenciação de neurónios de dopamina [11] e activação do endotélio para facilitar a angiogénese patológica [12]. No tumorigénese, relata-se que a regulação negativa de miR-132 contribui para o desenvolvimento do cancro pancreático [13]. No entanto, o papel potencial do miR-132 na progressão do cancro do pulmão ainda não foi documentada.

ZEB2 /SIP1 é um membro da família deltaEF-1 de factores de duas mãos de dedos de zinco e desempenham um papel vital na o desenvolvimento de uma variedade de cancros, tais como gástrico, do ovário, carcinoma do pulmão de células escamosas e de não pequenas [14], [15]. ZEB2 especificamente suprimir a expressão de E-caderina através da ligação a CACCT (L) motivo no promotor da E-caderina durante mesenquimal epithelial- (EMT) [16], [17]. Além de E-caderina, outros genes como plakophilin 2 e ZO-3 que envolvem junções célula-célula epiteliais também são reprimidos por ZEB2 [18]. Recentemente, ZEB2 é relatada a transcrição-regulam vimentina

via

cooperação com SP1 durante EMT [19].

No presente estudo, procurou-se investigar o suposto papel de miR-132 em metástase do NSCLC. Descobrimos que o miR-132 é regulada negativamente em linhas celulares de cancro do pulmão metastático e amostras de tecido clínicos, sugerindo que o miR-132 pode actuar como um supressor do tumor. Identificou-se que o regulador de ZEB2 EMT é um dos genes alvo directo de miR-132. MiR-132 é capaz de inibir EMT e metástase de células NSCLC através de paralisar a função de ZEB2.

Declaração de Materiais e Métodos

Ética

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Comité das University Medical Tianjin, China e consentimentos informados por escrito foram obtidas de todos os pacientes estudados.

linhagens celulares e amostras clínicas

As linhas de sub-celulares, L9981 metastático de alta e baixa metastático NL9980, foram isolados e estabelecida a partir de uma linha de células de carcinoma de células grandes do pulmão humano [20]. O metastática e baixa 95D 95C metastática elevada foram sublinhas da linha de células de carcinoma de pulmão humano de células gigantes [21]. A linha de NSCLC de células YTMLC-9 [22], [23] foi criada em nosso instituto. Estas linhas celulares foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com soro de vitela a 10% (Invitrogen, EUA), 100 UI /ml de penicilina e 100 UI /ml de estreptomicina. A linha celular A549 NSCLC, adquirido a partir da cultura de tecidos na Colecção Americana (ATCC), cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bovino, 100 U /mL de penicilina e 100 U /mL de estreptomicina. Estas linhas celulares foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO

2. Para as transfecções, as células foram cultivadas até 70% de confluência e transf ectadas com os plasmídeos utilizando Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acordo com a recomendação do fabricante.

Um total de 90 casos de NSCLC amostras foram obtidas a partir de General Hospital de Tianjin Medical University. Todos os 90 pacientes não receberam radioterapia ou quimioterapia antes da cirurgia. As amostras de tecido para uso foram armazenados em nitrogênio líquido. O sistema de estadiamento TNM da UICC (1997) foi utilizado para classificar as amostras e os tempos de sobrevivência que foram calculados a partir do dia operação para a morte através da avaliação de recorrência e metástase até o último dia de acompanhamento. O acompanhamento dos pacientes que sobrevivem em média 32,55 meses, variando de 1 a 96 meses. O estudo foi aprovado pela comissão de ética do hospital. informações clínico-patológico dos pacientes sobre a idade, tamanho do tumor, tipo histológico, diferenciação, palco e metástases em linfonodos foi obtido a partir de registros de pacientes, que foram resumidos na tabela 1.

transcrição reversa PCR (RT- PCR), quantitativa em tempo real de Reacção em Cadeia da polimerase (qRT-PCR) e werstern Blot Assay

o ARN total extraído pelo Kit miRvana (Applied Biosystems, CA) foi transcrito reversamente em ADNc com a transcrição reversa em ansa pedunculada iniciador para a detecção de miARN. A transcrição reversa de miR-132 e U6 controlo interno foi realizada utilizando Transcriptase Reversa M-MLV (Takara, Japão). O qRT- PCR foi realizada utilizando SYBR Premix Ex Taq (Takara), seguindo o protocolo usando um instrumento em tempo real pré-aquecida (Invitrogen). Todos os iniciadores foram apresentados na Tabela S1. Três experiências independentes foram realizados para analisar as expressões de genes relativos e cada amostra foi testada em triplicado. Os valores Ct foram usados ​​para calcular a expressão de níveis de ARN. A quantidade de expressão do gene alvo (2

-ΔΔCt) foi normalizada utilizando referência U6.

plasmídeo Construções

sequência genômica do ser humano miR-132, incluindo a sequência lateral -200 pb, foi amplificado a partir do genoma humano, então inserido no local BamHI /EcoRI do vector pcDNA3.1 (Invitrogen), denominada pcDNA3.1-miR-132. A região 3’untranslated de comprimento completo (3’UTR) de ZEB2 foi amplificado a partir de ADN genómico humano, e foi clonado no jusante da luciferase do pirilampo região de PMIR-GLOTM vector de luciferase (Promega, EUA) de codificação. O vector recombinado foi nomeado como PMIR-ZEB2. As mutações de locais de ligação de miR-132 foram introduzidas por mutagénese dirigida ao sítio e o vector resultante foi chamado PMIR-ZEB2-Mut. Os iniciadores utilizados para as construções foram listados na Tabela S1. Todas as construções foram confirmadas por sequenciação.

Os anticorpos e os anticorpos primários siRNAs

utilizadas em Western blot foram de coelho anti-ZEB2 (Santa Cruz, EUA), anti-caderina-E (Santa Cruz) , anti-vimentina (Santa Cruz) e de ratinho anti-β-actina (Sigma, Aldrich, St. Louis, MO). β-actina foi utilizada para normalização. Os pequenos RNAs de interferência (siRNA) segmentação de mRNA ZEB2 humana, controle negativo siRNA (siControl), miR-132 inibidor (anti-miR-132), e inibidor controle negativo (anti-miR-NC) foram adquiridos de Ruibobio (Guangzhou, China ). Todas as sequências oligonucleotídicas estão listados na Tabela S1.

A migração celular e invasão Ensaios

ensaio de cicatrização de feridas foi realizada para analisar a migração de células como descrito previamente [24]. Os ensaios de câmara de Boyden foram usadas para examinar a capacidade de invasão de células. As células foram transfectadas com 1 ug de pcDNA3.1 ou pcDNA3.1-miR-132 vetor. Dezasseis horas mais tarde, as células transfectadas foram tratadas com tripsina e ressuspensas. 1,0 × 10

5 células em 300 ul de meio de cultura foram colocadas em câmaras superiores (Millipore). As câmaras inferiores foram cheias com 500 uL de meio completo com 10% de FBS. Após incubação durante 12 h a 37 ° C, as células não invasoras foram removidos a partir da parte superior da câmara com um cotonete. As células migratórias na superfície inferior das inserções foram fixadas e coradas com violeta de cristal a 0,1%, e cinco campos aleatórios para cada inserção foram contados em 100 × ampliações.

Luciferase Reporter Gene Assay

as células aderentes foram semeadas em placas de 24 poços e co-transfectadas com 200 ng de PMIR-ZEB2 ou PMIR-ZEB2-Mut vector e 80 ng de pcDNA3.1-miR-132 ou vector pcDNA 3.1 vectores vazios, e o pRL-TK plasmídeo (Promega, Madison, WI), que é usado como a normalização interna. As células foram colhidas após 36 horas e lisaram-se utilizando o tampão de lise (Promega). ensaio de gene repórter de luciferase foi implementado utilizando o Repórter Dual-Luciferase Assay System (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. Todas as experiências foram realizadas pelo menos três vezes.

Análise estatística

Cada experiência foi repetida pelo menos três vezes. A significância estatística foi avaliada comparando os valores médios (± SD), utilizando

t-

teste de Student para grupos independentes e foi assumido para

p Art 0,05 (*) e

p

. 0.01 (**)

Resultados

miR-132 é frequentemente regulada em Altamente células e tecidos câncer de pulmão metastático espécimes

Nós avaliamos a expressão de miR-132 por qRT-PCR em várias linhas celulares de NSCLC com capacidades distintas metastáticas. Descobrimos que os níveis de miR-132 exibiu um padrão variando nestas linhas celulares. Notavelmente, a expressão de miR-132 em L9981 altamente metastático e 95D células foi drasticamente diminuída, em relação ao que nos correspondentes NL9980 celulares ou linhas de 95C fracamente metastáticas, respectivamente (Figura 1A). Além disso, foi detectada a expressão de miR-132 em 45 emparelhado tecido de câncer de pulmão primário clínico e amostras dos nódulos linfáticos metastáticos de tecido de cancro. Em comparação com os seus homólogos primárias, as amostras de tecidos metastáticos linfáticos abrigava uma significativa redução miR-132 níveis (Figura 1B,

P Art 0,001, aluno

t

-teste). Além disso, a análise sobre as características clínico-patológicas de pacientes com NSCLC mostrou que a expressão de miR-132 teve uma correlação significativa com o estado dos linfonodos (Tabela 1,

P

= 0,011). Estes dados indicam que a expressão reduzida de miR-132 é um acontecimento frequente em células NSCLC e tecidos altamente metastático, que pode estar envolvida na metástase de células de cancro do pulmão humano.

(A) Os níveis de ARNm relativos de miR-132 foram detectados por qRT-PCR e normalizado contra um controlo endógeno (U6 ARN) em várias linhas celulares de cancro do pulmão com capacidade metastática distinta. Os dados são apresentados como média ± SD de três experiências independentes (**

P Art 0,01, Estudante de

t

– teste). (B) Análise de qRT-PCR da expressão de miR-132 em 45 pares de tecidos NSCLC primários e suas metástases nos nódulos linfáticos correspondente. MiR-132 expressão nesses dois tipos de tecidos foi comparada por meio de Wilcoxon signed-rank (***

P Art 0,001, de Student

t

– teste).

miR-132 é capaz de inibir a migração e invasão de células NSCLC in vitro

em seguida, testamos o significado funcional de miR-132 em células NSCLC. Wound healing ensaio mostrou que a expressão ectópica de miR-132 em células de cancro de pulmão L9981 ou migração de células A549 significativamente inibido, comparado com o grupo de controlo (Figura 2A). Além disso, foi realizado o ensaio de câmara de Boyden para investigar o efeito de miR-132 na invasão celular. Tal como mostrado na Figura 2B e 2C, quando transfectadas com pcDNA3.1-miR-132 plasmídeos, a capacidade de invasão de células A549 apresentaram um decréscimo sobre-3 vezes, em comparação com o grupo de controlo. No entanto, as células mostraram um aumento da invasão mediante o tratamento de miR-132 inibidor (Figura 2B, 2C). Além disso, foram observados resultados paralelos, 95D e linhas de células de L9981 (Figura 2C). Tomados em conjunto, os dados sugerem fortemente que o miR-132 é capaz de suprimir a migração e a invasão de células NSCLC

in vitro

.

(A) A cicatrização de feridas ou foi usada para detectar a migração capacidade das células L9981 e A549, respectivamente. (B, C) ensaio de câmara de Boyden foi empregado para examinar a capacidade de invasão 95D, L9981, A549 e células, respectivamente. Os resultados foram de três experiências independentes (*

P Art 0,05, **

P Art 0,01, Estudante de

t

– teste). O número de células em cada grupo migratório foi normalizada para o controlo. As células foram transfectadas com pcDNA3.1 (NC) ou pcDNA3.1-miR-132 (miR-132) constrói, e miR-132 inibidor (anti-miR-132) ou o controlo inibidor (anti-miR-NC). As células A549 migratórios em câmaras inferiores de um experimento foram mostrados em B.

miR-132 diretamente inibe a expressão de ZEB2 através da sua 3’UTR e regula a EMT de células NSCLC

Para detectar o mecanismo molecular pelo qual o miR-132 suprime a metástase de células do cancro do pulmão, previmos os putativos genes alvo de miR-132 em células humanas utilizando a ferramenta

miRanda

,

PicTar

e

TargetScans

. Entre os candidatos previstos, ZEB2 era de interesse neste estudo, considerando-se os papéis cruciais de ZEB2 no desenvolvimento de cancros humanos [14], [15]. Para testar se o miR-132 tem como alvo directamente ZEB2 (Figura 3A), do tipo selvagem ou uma sequência de UTR 3 ‘do mutante ZEB2 foi clonado no vector repórter PMIR, respectivamente, como mostrado na Figura 3B. A actividade da luciferase de pMIR- ZEB2 construto 3 ‘UTR-wt foi significativamente diminuída mediante a expressão excessiva de miR-132 em células NL9980, enquanto a sua contraparte não foi mutante (Figura 3C). De nota, a níveis de proteína de ZEB2 em L9981 mRNA ou ou 95D células foram drasticamente reduzidos por miR-132, respectivamente (Figura 3D, 3E e 3F). É relatado que ZEB2 é um indutor EMT vitais através da repressão de E-caderina ou indução da expressão de vimentina no cancro humano [16], [19]. Para confirmar ainda que as ZEB2 actua como um alvo de miR-132, que examina o efeito de miR-132 sobre estes dois efectores a jusante de ZEB2 por Western blot. Tal como mostrado na Figura 3E e 3F, a máquina de EMT E-caderina ou vimentina foi dramaticamente regulado para cima ou para baixo-regulada sobre a superexpressão de miR-132 em ambos L9981 e células 95D. Tomados em conjunto, estes dados indicam que o miR-132 inibe diretamente a expressão ZEB2

via

visando a sua ‘UTR 3 e induz a EMT de células NSCLC.

(A) O local de ligação de miR-132 previsto no 3’UTR do ARNm ZEB2. (B) O mutante foi gerado na região da semente de ZEB2 UTR 3 ‘, como indicado pelo sublinhado. Um fragmento a 3 ‘UTR do mRNA ZEB2 contendo de tipo selvagem ou mutante da sequência de ligação de miR-132 foi clonado no jusante do gene da luciferase em PMIR vector. (C) As células L9981 foram transfectadas com vectores repórter PMIR contendo quer de tipo selvagem ou mutante ZEB2 3’UTR (indicado como PMIR-ZEB2-3 ‘UTR-wt e PMIR-ZEB2-3’ UTR-mut) quer com pcDNA3.1 (indicado como NC) ou vector pcDNA3.1-miR-132 (indicada como o miR-132). A actividade de luciferase foi determinada 48 h após a transfecção. (D) ZEB2 ARNm foi detectada por qRT-PCR em linhas celulares transfectadas com pcDNA3.1 (indicado como NC) ou pcDNA3.1-miR-132 vector (indicado como o miR-132). (E, F) Os níveis de proteína de ZEB2, E-caderina ou vimentina foi analisada por Western Blot em células transfectadas com diferentes plasmídeos. Figura F mostra os valores de cinzento relativas de cada banda (normalizado para p-actina). As bandas de proteína a partir de três ensaios independentes de Western blot foram quantificados utilizando software Quantity One (Bio-Rad, EUA). Os dados são apresentados como média ± SD (**

P Art 0,01, de Student

t

– teste).

ZEB2 Contribui para miR-132- Reprimida migração e invasão de NSCLC células

em seguida, examinamos a expressão de mRNA ou proteína de ZEB2 em várias células NSCLC, bem como 45 casos de tecidos de câncer de pulmão primário e tecidos de nódulos linfáticos metastáticos. Os dados revelaram que o nível de proteína de ZEB2 no L9981 altamente metastático ou 95D células foi significativamente regulada para cima, em comparação com o NL9980 fracamente metastática ou células 95C, respectivamente (Figura 4A). Além disso, o mesmo resultado sobre os níveis de mRNA de ZEB2 foi observada em tecidos de nódulos linfáticos metastáticos, em relação aos tecidos de cancro primário do pulmão (Figura 4B). É de notar que a expressão de ZEB2 exibida uma correlação inversa com o nível de miR-132 em tecidos NSCLC (Figura 4C). Em seguida, investigamos se ZEB2 é fundamental para a migração e invasão de células NSCLC. A expressão ectópica de ZEB2 em NL9980 ou 95c células aumentou significativamente a invasão de células (Figura 4D), no entanto, silenciando ZEB2 por ARNic em células L9981 resultou numa diminuição da migração e invasão capacidade das células (Figura 4E, 4F), revelando os seus papéis positivos na contribuição da migração de células NSCLC e invasão. Enquanto isso, a transfecção ou silenciar eficiência do ZEB2 nas células foi detectada por Western blot (Figura 4D e 4F,

menor

). Em seguida, foi acessado se o efeito funcional de miR-132 em células NSCLC era dependente ZEB2. Tal como mostrado na Figura 4G e 4H, introdução de anti-miR-132 em células NL9980 levaram a um aumento da migração e invasão celular, ao passo que o silêncio de ZEB2 por ARNsi aboliu parcialmente o acessório. Em paralelo, o nível de proteína de ZEB2 foi confirmada por Western blot (Figura 4H,

inferior). Colectivamente, estes resultados sugeriram que ZEB2 funciona como um alvo de miR-132, responsável pela regulação de miR-132-mediada de a migração e a invasão de células NSCLC.

(A) A expressão de ZEB2 foi analisada por Western blot em células NSCLC. (B) Os níveis relativos de mRNA de ZEB2 foram detectados em 45 tecidos tumorais primárias emparelhados NSCLC e os seus homólogos metástases em linfonodos. expressão ZEB2 nos tecidos foi comparada por meio de Wilcoxon signed-rank (***

P Art 0,001, teste t de Student). (C) correlação inversa entre miR-132 e expressão ZEB2 em tecidos NSCLC. ZEB2 expressão foi analisada por qRT-PCR e normalizadas para GAPDH. A expressão de miR-132 foi detectado por análise de qRT-PCR e normalizadas para expressão U6. A análise estatística foi realizada por meio do coeficiente de correlação de Pearson (r = -0,68, ***

P Art 0,001). (D) A invasão de células foi detectada por ensaio de câmara de Boyden em NL9980 95C ou células transfectadas com vectores pCMV ou pCMV-ZEB2, respectivamente. (E, F) O efeito da ZEB2 knockdown na migração de células ou a invasão foi avaliada pela cicatrização de feridas ou ensaio de câmara de Boyden, respectivamente (**

P Art 0,01, de Student

t Restaurant – teste). Além disso, a eficiência de silenciamento por ARNsi ZEB2 foi analisada por Western blot. (G, H) A cicatrização de feridas ou ensaio de câmara de Boyden foi utilizado para detectar a capacidade de migração ou invasão de células NL9980 com tratamentos diferentes, respectivamente (*

P

0,05, **

P

0,01, Estudante de

t

– teste). Além disso, a eficiência silenciamento de ZEB2 por siRNA foi analisada por Western Blot.

Discussão

O nosso grupo tem vindo a apostar no mecanismo molecular de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) desenvolvimento nos últimos anos, especialmente a dedicar à investigação de NSCLC metástase. MiRNAs estão envolvidos na patogénese do NSCLC e os seus perfis de expressão foram usados ​​para classificar cancros [25], [26], [27]. Portanto, espera-se que o dyregulation de microARNs relacionadas com metástases podem facilitar o progresso avançada do NSCLC. Miao LJ,

et

,

al., Achou que o miR-449c poderia inibir a invasão de células NSCLC, visando c-Myc mRNA [28]. Além disso, Boning Liu,

et al.

Informou que miR-26a pode promover metástase de células de câncer de pulmão através da activação AKT, visando PTEN [29]. MiR-132, decorrente do cluster miR-212/132 [30], tem documentado papéis na promoção do desenvolvimento do câncer de pâncreas

via

via de sinalização ativando AKT [31]. No entanto, a função potencial desta microARN em progressão NSCLC humano tem poucos relatórios. No presente estudo, estamos interessados ​​no papel potencial do miR-132 na metástase de células NSCLC.

Neste estudo, descobrimos que miR-132 foi frequentemente regulada para baixo em linhas celulares de NSCLC altamente metastáticas e espécimes de tecidos. Assim, suposto que o miR-132 pode ser uma nova supressora de tumor e sua dyregulation miARN pode envolver o progresso avançado de cancro humano. Além disso, na tumorigénese inicial, Shuyu Zhang e o seu colega encontrado que o miR-132 exercia os baixos níveis de expressão em tumores pancreáticos primários e pode estar associada com o desenvolvimento precoce de cancro pancreático humano [13]. No entanto, o papel potencial do miR-132 na progressão precoce de NSCLC ainda precisa ser investigado. Para que o mecanismo envolvendo o miR-132 a infra-regulação, Shuyu Zhang,

et ai.

Relatado que a hiper-metilação da região promotora era responsável pela redução da expressão de miR-132 [13]. Por conseguinte, especulamos que esta modificação de ADN pode provocar a alteração da expressão de miR-132 em NSCLC humana.

Em seguida, investigou-se a função de miR-132 em NSCLC. Nossos dados mostraram que a reintrodução de 132 reprimida drasticamente a migração celular e invasão de células NSCLC

in vitro

. Por conseguinte, os nossos dados sugerem que a diminuição da expressão de miR-132 pode contribuir para a metástase das células cancerosas e, por conseguinte, facilitar o desenvolvimento avançado de cancros humanos como NSCLC. Nós ZEB2 ainda caracterizado como um alvo funcional de miR-132 através de ensaios de repórter de luciferase, gene de RT-PCR e análise de transferência de Western, respectivamente. ZEB2 /SIP1, como um membro da família deltaEF-1 de duas mãos fatores de dedos de zinco, é frequentemente expressa em uma variedade de cânceres humanos, incluindo pâncreas [31], de mama [32], gástrica [33], [34 ], renal [35], cabeça e pescoço [36], glioma [37], hepatocelular [38], ovarianos [39], carcinomas pulmonares de células escamosas e não-pequenas [14], [15]. O papel importante do factor de transcrição ZEB2 foi fortemente sublinhado em vários papéis, devido à sua função na indução da transição epithelial- mesenquimal (EMT) e facilitando a metástases de células cancerosas [37], [40], [41]. Por exemplo, Nam EH,

et al

. informou que ZEB2 poderia induzir EMT e invasão de células cancerosas humanas

via

especificamente reprimir a expressão de E-cateherin e up-regulação da expressão de vimentina [42]. Além disso, Cong N e seu colega descobriu que regulada microRNA-200 família foi capaz de promover EMT através de via Wnt /β-catenina, visando repressores E-caderina ZEB1 /ZEB2 no adenocarcinoma gástrico [33]. No presente estudo, descobrimos que ZEB2 tinha uma expressão frequentemente ricos em células NSCLC metastático e tecidos de nódulos linfáticos clínicos. E ZEB2 foi responsável pela migração de miR-132 modulada e invasão de células NSCLC. Notavelmente, observamos que a E-caderina ou vimentina, a efetora jusante da ZEB2, também foi regulada para baixo ou up-regulada por miR-132, indicando que miR-132 pode exercer funções na migração e invasão de células NSCLC através de modulação de EMT. Estes

in vitro

dados implícitas a contribuição necessária da atenuada miR-132 na promoção da metástase celular em cancros. Estudos recentes revelaram uma transição epitelial mesenchymal- (MET) em metástases que permitiram estabelecimento de células cancerosas em um site remoto [43]. No entanto, o papel potencial de miR-132 neste processo ainda precisa ser ainda ilustrada.

Em resumo, foram investigados o papel de miR-132 em desenvolvimento NSCLC. A nossa descoberta sugere que o miR-132 pode ser uma nova supressor de tumor miARN. MiR-132 bloqueia a migração e invasão de células NSCLC através visando o ZEB2 regulador de EMT. Os nossos dados fornecem uma nova visão sobre o mecanismo responsável pelo desenvolvimento de NSCLC humana. Além disso, o miR-132 pode servir como um candidato potencial terapêutico no tratamento de NSCLC.

Informações de Apoio

Tabela S1.

Primers utilizados no trabalho foram listados

doi:. 10.1371 /journal.pone.0091827.s001

(DOC)