Sumário

O receptor de estrogénio (ER) ERβ2 variante β é expresso no cancro da próstata resistente à castração agressivo e tem sido demonstrado que se correlacionam com a diminuição da sobrevivência global. A análise da expressão do genoma após expressão ERβ2 em células de câncer de próstata revelou que a hipóxia era um tema sobre-representados. Aqui nós mostramos que ERβ2 interage com e estabiliza a proteína HIF-1α em normoxia, induzindo assim uma assinatura de expressão gênica hipóxico. HIF-1α é conhecido por estimular a metástase através do aumento da expressão de TWIST1 e aumentam a vascularização, activando directamente a expressão de VEGF. Descobrimos que ERβ2 interage com HIF-1α e encavalita ao elemento de resposta do HIF-1α presente nas proximais TWIST1 VEGF e promotores. . Estes resultados sugerem que pelo menos parte dos efeitos oncogénicos da ERβ2 é mediada por HIF-1α e que a segmentação deste ERβ2 – interação HIF-1α pode ser uma estratégia para tratar o câncer de próstata

Citation: Dey P, Velazquez-Villegas LA, Faria M, Turner A, Jonsson P, Webb P, et al. (2015) Receptor de Estrógeno p2 induz hipóxia Assinatura do Gene Expression, estabilizando HIF-1α no câncer de próstata. PLoS ONE 10 (5): e0128239. doi: 10.1371 /journal.pone.0128239

Editor do Academic: Sonia Rocha, University of Dundee, Reino Unido

Recebido: 26 de novembro de 2014; Aceito: 23 de abril de 2015; Publicado em: 26 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Dey et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Dados Disponibilidade: Todos os arquivos de microarray estão disponíveis a partir do banco de dados Omnibus Gene Expression do NCBI (número de acesso GSE35095)

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela prevenção Instituto de Pesquisa de Texas (CPRIT) concede HIRP100680 e RP110444, o Fundo de Tecnologia Emergente Texas sob Convênio nº. 300-9-1958, o Robert A. Welch Foundation (Grant E-0004), as acções do Fundo Cancer sueco e Marie Curie FP7-PEOPLE-2011-COFUND (CRESCIMENTO 291795), através do programa de mobilidade VINNOVA para o Crescimento (para C. W.). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que nenhum interesse competindo existem

Introdução

O câncer de próstata é uma doença de progressão lenta, inicialmente tratável com terapia de privação de androgénio (ADT) [1], mas geralmente recorrentes de uma forma mais agressiva, que é independente de andrógeno [2, 3]. A maioria dos cancros da próstata agressivos expressam altos níveis de receptor de androgénio (AR) e, além disso, utilizar uma variedade de mecanismos para activar AR na ausência do seu ligando. Por exemplo, o câncer pode adquirir a capacidade de sintetizar ligantes AR, fosforilar AR ou, por splicing alternativo, criar um AR constitutivamente ativa [4]. Em contraste, a expressão da isoforma principal de β do receptor de estrogénio (RpE /ESR2), ERβ1, é reduzida durante a progressão do cancro da próstata [5-8]. ERβ1 foi mostrado para regular negativamente a expressão de AR, de modo que após a depleção de ERβ1, a expressão de AR é substancialmente aumentada [9]. Além disso, ERβ1 foi recentemente mostrado para induzir a apoptose em linhas celulares de cancro da próstata através da activação da via FOXO3a /PUMA [10]. ERβ1 também foi mostrado para inibir epitelial-mesenquimal-a transição (EMT) por upregulating prolil hidroxilase domínio 2 (PhD2 /EGLN1) e posteriormente diminuir os níveis de hipoxia 1α inducible factor (HIF-1α /HIF1A) [11, 12]. Pelo contrário, o RpE variante de splicing ERβ2 [13] é expresso no cancro da próstata metastático de fase tardia e a expressão nuclear ERβ2 correlaciona com a diminuição da sobrevivência geral [14]. ERβ2 contém um domínio truncado de ligação ao ligando (LBD) e uma sequência de aminoácidos C-terminal único codificado por um exão específico do ERβ2 chamado CX alternativo única [13]. Esta isoforma ERP não tem a capacidade de se ligar ao ligando, homodimerizar e ativar vias de expressão gênica ERβ1 canônicos, mas pode heterodimerizar com ERa inibindo assim a actividade ERa [13]. ERβ2 Nuclear aumenta a capacidade de invasão de células PC3 [14] e aumenta a proliferação celular e expressão de TWIST1 (TWIST1) e c-Myc (MYC) em ambas as células 22Rv1 PC3 e, indicando possíveis funções oncogénicas de ERβ2 no cancro da próstata [15].

Um tumor de proliferação é muitas vezes expostos a condições de hipóxia, por causa de suas necessidades metabólicas mais elevadas e falta de neo-vascularização manter-se com suas exigências. A hipoxia promove a diferenciação neuro-endócrina do tumor da próstata, o que aumenta a sua agressividade [16]. O factor de transcrição HIF-1α é um factor central na resposta das células a hipoxia. Em células com níveis normais de oxigénio, HIF-1α é hidroxilado pela prolil-hidroxilase, uma enzima que utiliza oxigénio como co-factor e é activo apenas sob condições de normóxia [17]. Prolil hidroxilação provoca HIF-1α para interagir com o factor de von Hippel Lindau (VHL), levando a ubiquitinação e degradação de HIF-1α pelo complexo de proteassoma [18-21]. Recentemente, vários estudos descobriram que a proteína HIF-1α pode ser estabilizado, sem uma diminuição na tensão de oxigênio por fatores que interferem com a degradação HIF-1α dependente de oxigénio [22-24]. Após estabilização, o HIF-1α transloca para o núcleo e activa a transcrição de genes envolvidos na angiogénese. Nos cancros, HIF-1α muda de expressão de genes que levam ao aumento do metabolismo do tumor e metástases, criando um tumor muito agressivo. Por exemplo, a regulação HIF-dependente 1α de expressão TWIST1 é um passo chave na metástase [25]. Desde ERβ2 tem um papel oncogénica sugerido no cancro da próstata, e a sua variante de splicing ERβ1 é um supressor de tumor conhecido por inibir a HIF-1α, que aqui investigaram se ERβ2 pode aumentar a estabilização de HIF-1α, e se este mecanismo subjacente a correlação dos dois factores com agressivo, metástase, câncer de próstata.

Materiais e Métodos

Reagentes e cultura de células

o 22Rv1 e linhas celulares PC3 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC). 22Rv1 células foram mantidas em meio RPMI-1640 (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Sigma, St. Louis, MO), tampão HEPES 25 mM e 2 mM de L-glutamina (Invitrogen Carlsbad, CA), enquanto que as células PC3 foram mantidas em meio RPMI-1640 (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Sigma, St. Louis, MO). Todos os experimentos células utilizado abaixo passagem 30.

HIG2 plasmídeo de luciferase foram descritos anteriormente [26], PXP2-TWIST1-LUC e PXP2-mTwist1-LUC foram descritos [25].

Construção de um sistema indutivel para ERβ2 e biotina ligase expressa células PC3 (PC3 BirA)

um sistema de transposão à base de mediar a expressão regulada de ERβ2-doxiciclina foi utilizado para transfectar de forma estável 22Rv1 e células de cancro da próstata PC3. Estas linhas celulares são descritos noutro local [15]. Para a construção de células PC3 que expressam biotina ligase, as células PC3 foram transfectadas com o plasmídeo que expressa pBirA

Escherichia coli

biotina holoenzima-sintetase (BirA) a partir do promotor de actina e seleccionadas com G418 a 500 ug /ml. Após duas semanas, os clones foram isolados e testados para a actividade de biotinilação.

preparação de extracto de proteína

Para preparar extractos de células completas, as células foram lavadas duas vezes com PBS, lisaram-se em 10 vezes o volume de células compactadas de lise tampão [0,1% de Nonidet P-40, KCl 250 mM, HEPES 5 mM, pH 7,9, 10% (vol /vol) de glicerol, NaF a 4 mM, ortovanadato de sódio 4 mM, EDTA 0,2 mM, EGTA 0,2 mM, ditiotreitol 1 mM, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, cocktail inibidor de protease, PhosStop (Roche, Indianapolis, IN)] durante 15 minutos em gelo e em seguida centrifugada a 14.000 x

g

durante 10 minutos.

Western blotting

Vinte microgramas de proteína foram carregadas sobre um gel de SDS-PAGE a 10% de gel de Bis-Tris com tampão de corrida Tris e transferido para uma membrana de nitrocelulose após a separação electroforética. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite magro em pó em tampão TBST 0,1% e sondado com anti-ERβ2 (produzido no laboratório), TWIST1 (SC-15393), e HIF-1α (SC-10790) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Os anticorpos primários foram utilizados a 1: 200-1000 diluições, e anticorpo secundário foi utilizado a 1:. 10000

extracção de RNA e PCR em tempo real

extracção de RNA foi realizada com o estojo de extracção de ARNm Qiagen de acordo com o protocolo padrão. O ADNc foi sintetizado a partir de 1 ug de ARN total com o primeiro sistema Strand acordo com o protocolo padrão (Invitrogen Inc., Nova Iorque). PCR em tempo real foi realizado com SYBR Green I tingir Master Mix (Applied Biosystems Foster City, CA). Iniciadores (DNA Integrated Technologies, Inc. Coralville, IA) foram: 18s rRNA para a frente (F), 5′-CCT GCG GCT TAA TTT GAC TCA-3 ‘e reverso (R), 5′-AGC TAT CAA TCT GTC AAT CCT GTC C-3; gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase F, 5’-TGA CAA CTT TAT TGG TGG AAG YCG G-3 ‘e R’, 5′-AGG CAG GGA TGA TGT TCT GGA GAG-3 ‘(genes de referência); ERβ2 F, 5-ACT TGC ACG CCG TGA TGA CC-3 e R, 5’-CCA TCG TTG CTT CAG ACG A-3 ‘; TWIST1 F, 5’-GGA GTC CGC AGT CTT ACG AG-3 ‘e R, 5′-TCT GGA GGA CCT GGT AGA GG-3’. qPCR reacções foram realizadas com um rápido 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) utilizando as condições optimizadas para a SYBR Green I tingir sistema: 50 C durante 2 minutos, 95 ° C durante 10 minutos, seguida de 40-50 ciclos de 95 C durante 15 segundos e 60 ° C durante 50 segundos. concentração do primário óptima foi determinada em experiências preliminares, e especificidade de amplificação confirmada por análise da curva de dissociação.

In vitro tradução e expressão bacteriana

HIF-1α e ERβ2 foram convertidas pela transcrição Juntamente TNT rápida /Sistemas de tradução (Promega Madison, WI). Resumidamente, 0,2 g de HIF-1α ou vectores de expressão ERβ2 (promotor de T7) foram adicionados a uma aliquota da mistura de TNT Quick Master e incubou-se num volume de 50 ul durante 60 minutos a 30 ° C. A síntese in vitro de proteínas foi verificada por SDS-PAGE. Para a expressão bacteriana células bacterianas BL21-DE3 foram utilizados para expressar His-LBD-ERa, His-LBD-ERβ1, His-LBD-ERβ2 e His-LBD-ERβ2ΔCX plasmídeos de expressão.

Puxe para baixo a partir PC3 ou HEK293 células

células PC3 foram transfectadas com 3 ug BirA (biotina ligase) plasmídeo de expressão, 3 ug de plasmídeo contendo biotinilação consenso com a tag receptores B7TEV-ERa, B7TEV-ERβ1, B7TEV-ERβ2 e B7TEV-ERβ5 juntamente com 3 ug pcDNA3 HA-HIF-1α “Addgene plasmídeo 18949” ou pcDNA3 HA-HIF-1α P405 /A-P564 /A “Addgene plasmídeo 18955” ou pcADN3-HA-HIF 1α Δ401-603 (pcDNA3 HA-HIF-1αΔODD) descrito por Kondo

et al Comprar e Yan

et al

. [27, 28] em uma placa de cultura de tecidos de 100 mm. Para as células HEK293 a biotina ligase foi transientemente transfectada. Após 48 h, as células foram raspadas, sedimentadas e lisadas em 300 ul de NETN (Tris 20 mM (pH = 8,0), NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, 0,5% de Nonidet P-40), brevemente sonicada e centrifugada para remover os detritos. grânulos de 10 ul de estreptavidina magnéticas (Pierce Rockford, IL), foram lavados em NETN e incubados com 300 ul de extracto celular durante 2 horas na câmara fria. As esferas foram lavadas (3 x 10 minutos de rotação) com 300 ul NETN e fervida com 20 ul de 2 x tampão de amostra [Tris-HCl 125 (pH 6,8), com glicerol a 4% de SDS, 20% (vol /vol), e 0,004 % azul de bromofenol] e submetidas a SDS-PAGE e transferidos para membrana de nitrocelulose por Western blot. A mancha foi sondada com anticorpo HIF-1α (Santa Cruz Dallas, TX) 1: 1000 de diluição e secundário anticorpo. 1: 10.000 diluição

In-vitro puxar baixos

2 ul

em vitro

proteína HIF-1α traduzido foi incubado com 25 ul de lisado bacteriano contendo His-ERβ2 (LBD) durante a noite, e os complexos foram adsorvidas em esferas de agarose de níquel durante 2 h. As esferas foram lavadas três vezes com NETN arrefecido com gelo (Tris 20 mM (pH = 8,0), NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, 0,5% de Nonidet P-40). Os complexos foram cozidos com 20 ul de 2 x tampão de amostra, submetidas a SDS-PAGE e transferidos para membrana de nitrocelulose para análises ocidentais. O blot foi sondado com anticorpo anti-HIF-1α (Santa Cruz). Os anticorpos primários estavam em diluição de 1: 1000 e o anticorpo secundário de 1:. 10000

2 de mamífero híbrido ensaio

ERβ2 foi clonado no plasmídeo de expressão Gal4DBD PM2 em grelha com o domínio Gal4DBD usando BamHI e locais de restrição HindIII fazendo PM2-ERβ2. O plasmídeo pVP16 (Clontech) foi usado para clonar o HIF-1α N-terminal (aminoácidos 1-401), domínio de desestabilização de oxigénio (aminoácidos 401-603) e o domínio C-terminal (aminoácidos 603-826) em grelha com o domínio de activação VP16 utilizando locais de restrição BamHI e PstI. Para os ensaios de interação em células PC3 o Gal4 repórter responsivo FR-LUC 300 ng, PM2-ERβ2 500 ng e VP16 fundido domínios HIF-1α 200 ng foi transfectadas utilizando o método PEI de transfecção como descrito por Longo et al. [29]

Microarray e bioinformática analisa

A análise microarray comparativa de duas cores cobre o transcriptoma de codificação de proteínas totalmente conhecida de 39.600 transcrições e variantes usando matrizes OpArray Humano adquiridos de Microarrays Inc. ( Huntsville, AL). A matriz foi complementado com 133 oligonucleotídeos especificamente sintetizados para análise detalhada e robusta de receptores nucleares, variantes de processamento, e coregulators. A análise de microarray foi realizada essencialmente como em Richter

et ai. [30]. Para cada síntese de cDNA, 20 ug de ARN total foram utilizadas, e cada comparação foi replicado e corante trocados. Bioinformatic análises foram realizadas utilizando GenePix, R, e software de Caminho Estúdio (Elsevier, Filadélfia, PA). Diferencialmente expressos genes foram definidos usando um p-valor de corte de p = 0,005, em combinação com um M-value (log2 de fold-change) de corte de +/- 0,3. análise de enriquecimento da ontologia gênica (GO) dos processos biológicos foi realizada com o teste exato de Fisher usando conjuntos de genes do software. Caminho imagens foram projetadas em Caminho Studio. dados de Microarray está disponível em Omnibus Gene Expression do NCBI sob o número de acesso GSE35095.

Cromatina imunoprecipitação (CHIP)

PC3 Sub-confluentes e células 22Rv1 (90%) foram cultivadas em um prato de 150 mm e lavadas duas vezes com PBS frio e, em seguida, fixado em PFA (1%) durante 10 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS frio + inibidor de protease, raspadas com 150 ul de tampão de ressuspensão, e centrifugada (4000 rpm, 10 minutos). Os sedimentos foram ressuspensos em 750 ul de tampão ChIP de lise (HEPES 50 mM, NaCl 140 mM, Triton a 1%, inibidor de protease) e as células mantidas em gelo durante 30 minutos. Os lisados ​​celulares foram sonicadas (60 pulsos de, 30 segundos cada) com 30 segundos quebrar a 4 ° C. Após sonicação, 25 ul amostras foram recolhidas e armazenadas a -20 ° C (de entrada). O restante da fracção de lisado de células de 125 ul foi utilizado para os passos seguintes. As amostras foram pré-absorvidos em 20 ul de proteína G acoplado FLAG tag esferas magnéticas a 4 ° C durante 2 horas e sobrenadante recolhido. As amostras foram, em seguida, dividida em duas fracções e os anticorpos contra a bandeira (2,5 ug) ou IgG (2,5? G) foram adicionados e incubados durante a noite. No dia seguinte, as contas foram lavadas três vezes com tampão de ChIP de lise, uma vez com tampão de alto teor salino de lavagem de aparas (HEPES 50 mM, NaCl 500 mM, Triton a 1%), e finalmente uma vez com tampão de lavagem de aparas (10 mM de Tris, LiCl 250 mM, NP40 a 0,5%, EDTA 0,1 mM). As pérolas foram ressuspensas em 40 ul de tampão de eluição (Tris a 50 mM, SDS a 1%, EDTA 10 mM) e incubou-se a 65 ° C durante a noite com um pequeno orifício na tampa. A entrada recolhidos anteriormente, também foi colocada a 65 ° C. No dia seguinte, as amostras foram purificados utilizando o kit de purificação de PCR (Qiagen) e utilizados para análise qPCR utilizando os seguintes iniciadores. PHRE-TWIST1 promotor (F) 5′-CGGGGGAGGGGGACTGGAAAGC-3 ‘; (R) 5’-AGGCCTCCTGGAAACGGTGCCG-3 ‘, o promotor de VEGF: (F) 5′-ACAGACGTTCCTTAGTGCTGG-3′; (R) 5’-AGCTGAGAACGGGAAGCTGTG-3 ‘.

Estatísticas

Os valores são expressos como a média com intervalos de confiança de 95%. Um bicaudal não pareado

t

-test foi usado para comparar as diferenças entre dois grupos. O significado é apresentado como *

p Restaurant 0,05, ** p

Restaurant 0,005 e ***

p Restaurant 0,001, e não significativas diferenças são apresentados como NS.

resultados

Microarray e análise bioinformática de células de cancro da próstata expressando ERβ2 mostram aumento da expressão de genes envolvidos na resposta hipóxica

Temos anteriormente demonstrado que ERβ2 aumentou expressão de genes associados a EMT TWIST1 e Slug (SNAI2) em células de câncer de próstata [15]. Aqui, foi realizado um estudo transcriptomic para explorar os efeitos da ERβ2 de uma maneira imparcial. Nós comparamos células PC3 expressando estavelmente ERβ2 com células de controlo, e descobriu 585 genes ser significativamente alterados usando o nosso cut-off definido. Curiosamente, TGFB2, que é conhecida por ser estimulada por HIF-1α, estava entre os genes mais altamente regulados positivamente (quase 9 vezes, de acordo com o microarray). Analisando o enriquecimento de categorias ontologia gene entre os genes regulados, ‘

resposta à hipoxia

‘ foi a segunda função mais sobre-representados (p = 8.0e-6), perdendo apenas para “expressão do gene” (Tabela 1). O ‘

resposta à hipoxia

‘ grupo incluiu 17 genes significativamente regulados (TGFB2, EGLN1 (PhD2), EGLN3 (PHD3), Smad3, HSD11B2, gato, CCL2, CDKN1B, MMP13, PLOD2, IL1B, Plau, SCNN1G , CRYAB, IL18, itpr1, SOD2, ADM). Além disso, a sub-rede enriquecido, definida como sendo os genes alvo expressão do respectivo nó, ‘Vizinhos de HIF-1α’ foi a mais sobre-representados (p = 1.5e-09) com 41 membros regulamentados (Tabela 2). Além disso, muitos genes induzidos ERβ2 foram encontrados para ser envolvido na angiogénese (Tabela 2), o que também era um tema sobre-representados (p 0,05). Destes genes, SOD2, SCNN1G, CD24, HIG2, IGF2 e TGF-β2 são estimuladas por HIF-1α [26]. Também ‘

processo de metabolismo da glicose “

que HIF-1α é conhecido por regular, foi sobre-representados (p 0,007), incluindo 9 genes (PFKP, AKT1, IGF2, GOT2, PGM5, CRYAB, GBE1, UGP2, FABP5). Assim, a análise microarray claramente indicado hipóxia e função HIF-1α como os principais temas da função ERβ2 (Veja S1 figo por genes validados).

Para validar esses dados, analisamos a expressão de HIF-1α no PC3 e outro de células de câncer de próstata line-22Rv1, que são tanto sobre-expressar ERβ2. Observou-se um aumento no nível de proteína HIF-1α em ERβ2 expressar contra células de controlo, mas há mudanças no nível do mRNA correspondente (Fig 1A-1D). Isto está de acordo com os nossos resultados de microarray, que não detectar a mudança nos níveis de transcrição HIF-1α, mas indicou uma alteração nas funções de HIF-1α (com base em vias enriquecido). Além disso, o aumento ERβ2 dependente dos níveis de proteína HIF-1α foi confirmado para ser acompanhada por aumento ERβ2 dependente da actividade HIF-1α. A actividade de luciferase de um repórter conduzido pela hipoxia HIF-dependente 1α promotor induzível do gene 2 (HIG2 /HILPDA) (HIG2-A-Luc) [26], foi aumentada na presença do vector de expressão ERβ2 transfectadas (Fig 2A-2C). Em um estudo anterior, mostramos que ERβ2-expressando células PC3 ter aumento do nível de TWIST1 [15]. Aqui, mostramos que ERβ2 o aumento da actividade de um repórter de luciferase conduzida pelo promotor TWIST1 HIF-dependente 1α em células de cancro da próstata LNCaP e que este efeito foi dependente do elemento de resposta do HIF-1α (Fig 3A-3C). Isso demonstra que a atividade HIF-1α em geral é reforçada em células da próstata expressando ERβ2.

A. Western blot de extratos de controle e dois clones diferentes 22Rv1 e PC3 expressando ERβ2 ensaiadas com anticorpo HIF-1α. B. expressão de ARNm relativa de ERβ2 e HIF-1α nas ERβ2clones da linha celular 22Rv1. O gráfico mostra os dados como a mudança vezes, em comparação com o controle (média de três experiências separadas (± S.E.M.) Calculada utilizando

t

-teste, * p≤0.016 de Student). C. expressão de ARNm relativa de HIF-1α na ERβ2 # 2 clone da linha celular 22Rv1. O gráfico mostra os dados como a mudança vezes, em comparação com o controle (média de três experiências separadas (± SEM) calculada utilizando

t

-teste, ** p≤0.006 de Student).

A. esboço esquemático da construção do promotor HIG2 onde (X) está representando sequência de elementos de resposta de HIF-1α (HRE). B. quantidade crescente de transiente transfectadas ERβ2 plasmídeo de expressão em células PC3, sucessivamente, activa o promotor transitoriamente transfectadas HIG2 como mostrado por ensaio de luciferase de HIG2-A-LUC. O gráfico mostra os dados como um aumento da luminescência das células transfectadas com o aumento da concentração de ERβ2 (média de três experiências separadas (± S.E.M.) Calculada usando

t

-test, *** p≤0.0002 de Student). Comparação de concentrações-0μg a 1000 ug. C. A adição de plasmídeo de expressão de HIF-1α activa promotor HIG2 em linhas celulares PC3. O gráfico mostra os dados como um aumento da luminescência das células transfectadas com HIF-1α (média de três experiências separadas (± SEM) calculados usando Student

t

-teste, **** p≤0.0001).

A. Descrição das construções promotoras TWIST1 utilizado. B. células LNCaP transfectadas com o repórter-TWIST1 promotor-luciferase e o aumento da concentração do plasmídeo de expressão ERβ2. O gráfico mostra os dados como um aumento da luminescência das células transfectadas com o aumento da concentração de ERβ2 (média de três experiências separadas (± S.E.M.) Calculada usando

t

-test, ** p≤0.0034 de Student). C. Transfecção de repórter TWIST1-promotor-luciferase com (torção) ou mutado elemento (mTwist) de resposta do HIF-1α juntamente com plasmídeos de expressão de HIF-1α ou ERβ2 em células LNCaP. O gráfico mostra os dados como um aumento da luminescência das células transfectadas com o aumento da concentração de ERβ2 (média de três experiências separadas (± SEM) calculado usando

t

-test, **** p≤0.0001 de Student, # ## p≤0.002).

ERβ2 interage diretamente com HIF-1α causando estabilização

Desde ERβ2 aumenta a expressão da proteína HIF-1α, mas não mRNA, nós especulamos que HIF-1α estabilização ocorre por meio da interação proteína-proteína entre ERβ2 e HIF-1α. Para testar esta hipótese, eu prendi expressa em bactérias DNV de ERa, ERP e ERβ2 a um suporte sólido e determinado interações com

in vitro

traduzido HIF-1α. HIF-1a fortemente ligados aos ERβ2, mas não de quantidades equivalentes de tipo selvagem ERa ou RpE LBDs. Esta interacção foi independente de sequências específicas ERβ2 porque o truncamento dos aminoácidos codificados pelo exão específico do ERβ2 não eliminou HIF-1α ligação (ERβ2ΔCX) (Fig 4A). Pull-down de ERs marcado com biotina expressa em células PC3 revelou interação específica de transf HIF-1α com ERβ2 e ERβ2ΔCX e única interação modesto, com ERβ1 (Fig 4B). Desde ERβ5 tem a mesma sequência de aminoácidos e é truncada no mesmo aminoácido que ERβ2, isto é, apenas os pequenos péptidos do terminal C é diferente entre as duas variantes Decidimos testar esta variante e investigar a sua interacção com o HIF-1α. Como mostrado na Fig 4B, ERβ5 interage fortemente com HIF-1α.

. His-marcado LBD-ERβ2 puxar para baixo com contas de níquel agarose de

in vitro

traduzido HIF-1α comparação com His-marcado LBD-ERa, marcada com His LBD-ERβ1, marcada com His LBD-ERβ2 e His- marcado ERβ2ΔCX TNT é pista com ligado de reticulócitos única aliada. B. Expressão da ligase de biotina BirA, HA-HIF-1α, e o receptor de N-terminal de péptido de consenso biotina fundido constrói B7TEV-ERa, B7TEV-ERβ1, B7TEV-ERβ2, B7TEV-ERβ5, e B7TEV-ERβΔCX em células PC3. Os extractos celulares foram então sujeitas a suspenso com esferas magnéticas com estreptavidina e as proteínas separadas por SDS-PAGE seguida por detecção com o anticorpo HIF-1α.

O domínio de oxigénio desestabilizar (TDO) de HIF1α não é necessária para a interacção com ERβ2 e ERβ5

para investigar, se era necessário o oxigênio desestabilizar domínio de HIF-1α para a interação com ERβ2 construímos um plasmídeo de expressão de HIF-1α com aminoácidos 401-603 deletados conforme descrito anteriormente [31] . Em seguida, co-imunoprecipitada neste domínio excluído HIF-1α com ERβ2 biotinilado e ERβ5. Como pode ser visto na figura 5A o HIF-1α com ODD suprimido (Δ401-603) interage tão fortemente quanto o do tipo selvagem, indicando que o domínio TDO é dispensável para a interacção. Para mapear a interacção adicional que utilizado ensaio de duplo híbrido de mamífero em que o N-terminal, domínio TDO e C-terminal de HIF-1α foram fundidas com VP16 e transfectado em células PC3 juntamente com Gal4DBD fundido ERβ2 e um repórter com sítios de ligação de Gal4 em frente da luciferase. Como pode ser visto na figura 5B a interacção ocorre preferencialmente com o N-terminal de HIF-1α.

. células PC3 transfectadas com plasmídeos que expressam GFP, HIF-1α, HIF-1α ΔODD, BirA (biotina ligase), ERβ2 e ERβ5 com biotinilação consenso N-terminal. Os complexos foram puxados para baixo com pérolas magnéticas de estreptavidina. Puxado para baixo HIF-1α e HIF-1α ΔODD foi detectada utilizando anticorpo anti-HIF-1α. B. Transfecção de 200 ng de sozinha FR-luciferase, com 500 ng PM2-ERβ2 e 300 ng de ambos os VP16-N-termo de HIF-1a (aminoácidos 1-401), VP16- TDO HIF-1a (aminoácidos 401-603) , ou VP16-C-termo HIF-1α (aminoácidos 603-826). Medição da actividade de luciferase 24 h após a transfecção.

é bem conhecido que prolinas 405 e 564 de HIF-1α sob normoxia são hidroxiladas por hidroxilases prolina (PHD) e, em seguida, reconhecido pelo factor de VHL e subsequentemente alvo para a degradação de [32]. Queríamos descobrir se ERβ2 e ERβ5 interação com HIF-1α é dependente de hidroxilação destes prolinas para que a interação iria ocorrer até mesmo durante condições de normóxia. Na Figura 6, que mostrou que a WT e P405 /A-P564 /A mutada HIF-1α interagem fortemente com ERβ2 independentemente da destruição dos locais de hidroxilação prolil sugerindo que a interacção ocorre tanto durante a normoxia e hipoxia.

células PC3 transfectadas com GFP, HIF-1α, HIF-1α P405 /A-P564 /A, BirA (ligase de biotina), e ERβ2 ERβ5 com biotinilação consenso N-terminal. Complexos foram puxados para baixo com esferas magnéticas estreptavidina.

ERβ2 é recrutado para elementos de resposta HIF-1a do TWIST1 e promotores de VEGF

Finalmente, nós exploramos se ERβ2 pode ligar-se ao HIF elementos de resposta -1α usando o chip-qPCR. Detectamos aumento dos níveis de ERβ2 recrutados nos elementos de resposta HIF-1α sobre os promotores dependentes 1α no HIF TWIST1 e VEGF em ambas as células 22Rv1 PC3 e. No entanto, ERβ2 não se liga aos promotores de o elemento de resposta de estrogénio clássico no gene pS2 (Fig 7A e 7B).

Em células PC3 (A) e células 22Rv1 (B) que expressam expressão regulada ERβ2-doxiciclina , esta isoforma RpE liga-se a HRE (HIF-1α elemento de resposta no promotor TWIST1) e o promotor de VEGF (elemento de resposta do HIF-1α no promotor VEGF), mas não para a pS2 promotor (ERE). resultados ChIP-qPCR são mostrados com um IgG não específica e uma imunoprecipitação específica de anticorpo M2 anti-FLAG. A ligação ERβ2 é enriquecido apenas no elemento de resposta do HIF-1α contendo TWIST1 e promotores de VEGF, mas não no promotor pS2 falta elemento de resposta do HIF-1α. O gráfico mostra os dados como um aumento na ligação de bandeira, às TWIST1 (PHRE) e promotor VEGF (média de três experiências separadas (± SEM) calculados usando Student

t

-teste, * p≤0.028, # # p≤0.041 (células PC3) e ** p≤0.0049, ## p≤0.0481 (22Rv1 células).

Em conclusão, nossos resultados indicam que ERβ2 se liga e estabiliza HIF-1α e Além disso, é co-recrutados para elementos chave de HIF-1α em HIF-1a genes regulados aumentando assim a actividade de HIF-1α durante condições normóxicas em células de cancro da próstata.

Discussão

resposta do normal tecidos a hipóxia é crucial para vascularização adequada e para o fornecimento de sangue posterior para oxigenar e proporcionar nutrientes para o tecido. um tumor em crescimento torna-se hipóxico quando se atinge mais que 1 mm de tamanho [33]. a resposta imediata a hipoxia é uma diminuição da prolil-hidroxilação de HIF-1α levando a um aumento de estabilização desta proteína. este é por causa de VHL, o que induz a ubiquitinação e subsequente degradação de HIF-1α sob condições de normóxia, não se pode ligar ao HIF-1α na ausência de prolil-hidroxilação. Estabilização do HIF-1α permite a regulação de genes envolvidos na angiogénese, tais como VEGF, que é segregada a partir do tumor, atraindo células endoteliais através da ligação aos seus receptores para o VEGF da superfície, permitindo assim um aumento da vascularização do tumor e o crescimento. HIF-1α também aumenta a expressão de genes envolvidos na glicólise, para adaptar o tumor para sobreviver em condições de baixo teor de oxigénio [34], e genes envolvidos na invasão e metástase, tais como TWIST1 [25].

Expressão de ERβ2 correlaciona-se com pior prognóstico no câncer de próstata [14] e do cancro da mama ERa-negativos [35], mas possíveis ações oncogênicos de ERβ2 não são compreendidos. Mostramos aqui que existe uma forte correlação entre a expressão ERβ2 e nível de proteína HIF-1α, mas não nível de mRNA no cancro da próstata linhas celulares PC3 e 22Rv1. ERβ2 aumenta a atividade de promotores dependentes de HIF-1α e é recrutado para os promotores TWIST1 e VEGF, prováveis ​​amarrados a HIF-1α. Juntos, os resultados acima descritos sugerem que HIF-1α medeia o efeito oncogênico de ERβ2 através de uma via de sinalização não-clássica em que ERβ2 liga-se a, e estabiliza HIF-1α em condições de normóxia. Isto está de acordo com outros estudos que mostram que HIF-1α interagindo proteínas estabilizar HIF-1α, bloqueando a sua degradação [22-24].

Surpreendentemente, embora descobrimos que ERβ1 não interage de forma eficiente com HIF-1α, correlacionando-se com a sua incapacidade para induzir genes responsivos HIF-1α, o último exão única de ERβ2 não é necessária para a ligação de HIF-1α. Aparentemente, o truncamento do ERβ1 C-terminal expõe uma superfície de novas proteínas mediar a interação com HIF-1α.

Ele continua a ser mostrado se expressão ERβ2 se correlaciona com níveis de torção 1 ou outros genes alvo de HIF-1α em clínica amostras. Um estudo recente da Ragnum et al. [36] mostra que a terapia de privação de androgénio-(TSA) provoca uma redução da expressão de muitos genes ligados a hipóxia. Propomos que a expressão de ERβ2 ou ERβ5 poderia contrariar o efeito de ADT em genes ligados por hipoxia em um tumor da próstata e, assim, causar resistência castração resultando em um pior resultado. De facto, as nossas constatações de estabilização não-hipóxica de HIF-1α sugerem que pode ser possível desenvolver uma pequena molécula interferir com a estabilização de HIF-1α-induzida ERβ5 ERβ2 e para uso na terapia de certas formas agressivas de cancro da próstata. Uma visão geral dos resultados descritos é mostrado na Figura 8.

O modelo proposto de como ERβ2 estabiliza HIF-1α e é recrutado para VEGF e TWIST1 promotores.

Em conclusão, expressão de o RpE variantes ERβ2 e ERβ5 foi previamente demonstrado que se correlacionam com cancro da próstata agressivo.