Abstract

Introdução

A quimioterapia dano endotelial -relacionados contribui para o desenvolvimento inicial da morbilidade cardiovascular em doentes com cancro testicular. Nós teve como objetivo identificar os mecanismos relevantes do e busca de biomarcadores candidatos para este dano endotelial.

Métodos

As células humanas micro-vascular endotelial (HMEC-1) foram expostos a bleomicina ou cisplatina com amostras não tratadas como controlo. foram utilizados microarrays de cDNA 18k. diferenças de expressão gênica foram analisados ​​ao nível de um único gene e em conjuntos de genes agrupados em vias biológicas e validados por qRT-PCR. Os níveis de proteína de um biomarcador candidato foram medidos em cancro testicular plasma do paciente antes, durante e após a quimioterapia bleomicina-etoposido-cisplatina, e relacionada com endoteliais biomarcadores de danos (Factor de von Willebrand (vWF), de alta sensibilidade a proteína C-reactiva (hsCRP)) .

resultados

dados de microarranjos identificados vários genes com expressão altamente diferencial; por exemplo. Diferenciação de Crescimento Fator 15 (

GDF-15

), ativando Fator de Transcrição 3 (

ATF3

) e Amphiregulin (

AREG

). análise de caminho revelou fortes associações com ‘p53’ e conjuntos de genes “Diabetes Mellitus”. Baseado em função conhecida, medimos GDF-15 níveis de proteína em 41 pacientes testiculares durante o acompanhamento clínico. Pré-quimioterapia de GDF-15 níveis igualou controlos. Ao longo de quimioterapia GDF-15, os níveis de vWF e hsCRP aumentaram, e foram correlacionadas em diferentes pontos de tempo.

Conclusão

Uma abordagem imparcial em um modelo pré-clínico revelou genes relacionados com a lesão endotelial induzida pela quimioterapia , como

GDF-15

. Os aumentos de plasma GDF-15 níveis em pacientes com câncer testicular durante a quimioterapia e sua associação com vWF e hsCRP sugerem que GDF-15 é um biomarcador potencialmente útil relacionada com a lesão endotelial

Citation:. Altena R, Fehrmann RSN, Boer H, de Vries EGE, Meijer C, Gietema JA (2015) Growth Differentiation factor de 15 (GDF-15) Os níveis plasmáticos aumentam durante Bleomycin- e cisplatina-Based Tratamento de pacientes com câncer de testículo e se relacionar com lesão endotelial. PLoS ONE 10 (1): e0115372. doi: 10.1371 /journal.pone.0115372

Editor do Academic: Ramon Andrade de Mello, Universidade do Algarve, PORTUGAL

Recebido: 27 de maio de 2014; Aceito: 21 de novembro de 2014; Publicação: 15 de janeiro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Altena et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. o apoio foi fornecido por TAPETE 2009-4365 do Cancer Society holandês. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A introdução de quimioterapia baseada em platina no final dos anos setenta resultou em altas taxas de cura em pacientes com câncer testicular metastático. No entanto, esta quimioterapia provoca efeitos colaterais, o que resulta em morbidade nos sobreviventes tratados com sucesso [1]. questões relevantes são os riscos aumentados para segundas neoplasias e doenças cardiovasculares (DCV) [2-5]. CVD podem surgir durante ou logo depois do tratamento [6, 7], bem como para anos posteriores décadas [3-5, 8-11].

Um dos mecanismos envolvidos no desenvolvimento desta relacionado com o tratamento CVD é o dano endotelial direto. Em adição à indução de morte celular endotelial [12-14], ambos bleomicina [14-16] e cisplatina [14, 17-19] influenciar indirectamente a função das células endoteliais, v.g. através da interferência com fatores inflamatórios e fibrinolítico. Em última análise, esta activação celular induzida pela quimioterapia pode progredir para a disfunção endotelial, aterosclerose acelerada e DCV manifesta.

O reconhecimento precoce e possivelmente prevenção destas complicações relacionadas ao tratamento são fundamentais para manter um estado de saúde óptimo de sobreviventes do cancro testicular. O desenvolvimento de DCV é um processo gradual, e as intervenções precoces ou reforçado de despistagem pode retardar ou parar a progressão para morbidade clínica evidente. Biomarcadores para lesão endotelial relacionada com o tratamento pode identificar os pacientes com maior risco para DCV.

Neste estudo, back-traduziu o achado clínico que a bleomicina e cisplatina induz à lesão endotelial. Usamos uma abordagem imparcial, analisando resultados cDNA microarray para identificar genes novos associados com a lesão endotelial relacionada com a quimioterapia. perfis de expressão de genes foram geradas a partir da linha de células endoteliais microvasculares humanas (HMEC-1) antes e após o tratamento com bleomicina e cisplatina em diferentes pontos de tempo e concentrações. Quantitative PCR em tempo real (qRT-PCR) foi realizada para confirmar genes com diferenças significativas na expressão de várias configurações experimentais. Em seguida, com base na função conhecida destes genes na literatura, que seleccionado um destes genes candidatos para uma validação adicional como prova do princípio ao nível da proteína em um paciente com cancro testicular coorte. Com esta abordagem translacional que teve como objetivo identificar os mecanismos de e potenciais biomarcadores para lesão endotelial relacionada com a quimioterapia.

Materiais e Métodos

modelo de linha celular

HMEC-1 é um imortalizado dérmica humana micro-vascular linha de células endoteliais que retém suas características morfológicas e funcionais de células endoteliais durante várias passagens [20]. As células foram cultivadas como uma monocamada em meio MCDB-131 (Invitrogen, Merelbeke, Bélgica) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (Bodinco, Alkmaar, Países Baixos), 10 mM de L-glutamina (Invitrogen, Merelbeke, Belgium), 1 ug /ml de hidrocortisona (Sigma-Aldrich, Amsterdão, Países Baixos) e 10 ng /ml de factor de crescimento epidérmico humano (R D Systems, Abingdon, Reino Unido), e foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2. Os experimentos foram realizados entre as passagens 15-30.

Em um cenário -exposure “aguda”, HMEC-1 foram deixados sem tratamento como controlos, ou foram tratados com 0,3 (IC

50 (concentração que inibe a sobrevivência celular por 50%)) ou 1,5 g /ml (

90) bleomicina IC e 2,6 (IC

50) ou 12,9 mM (IC

90) cisplatina para 6, 24 e 48 horas (S1A fig.) . Os valores de IC50 para ambos bleomicina e queda cisplatina dentro das concentrações fisiológicas do plasma destas drogas em pacientes durante o tratamento activo [14, 21-22]. Além disso, num ambiente -exposure “crónica”, doses mais baixas foram administrados (IC

10; bleomicina 0,06 ug /mL de cisplatina ou 0,52? M) duas vezes por semana; As células foram coletadas para análise no dia 30 (S1B Fig.). Administração de cisplatina teve de ser retido na 7

th administração por causa da morte celular considerável, mas foi mantida a dose completa depois disso. A bleomicina pode ser administrado sem interrupção.

experiências cDNA microarray

O ARN total foi isolado a partir de HMEC-1 por um kit RNeasy (Qiagen, Venlo, Países Baixos) e reunidas para cada ponto de tempo e droga a partir de 2 expericias independentes. Após purificação (PCR QIAquick kit de purificação, Qiagen, Venlo, Países Baixos), amplificados de ARN (ARNc) amostras foram transformadas em cDNA com transcriptase reversa, independentemente marcado com Cy3 (verde) e Cy5 (vermelho), e aleatoriamente hibridadas com o custom- feitas microarrays de cDNA 18K. As imagens fluorescentes das lâminas de microarranjo foram obtidos com o scanner Affymetrix GMS428 (Affymetrix, Santa Clara, CA) para ambos os fluoróforos, intensidades de sinal de cada mancha foram quantificados por dedicado Imagene 5.6 software (Biodiscovery, Marina Del Rey, CA).

normalização Quantile foi aplicada a lOG2 transformado intensidades Cy3 e Cy5. Operon v2.0 (Human Genome Oligo Set V2) identificadores de sonda foram convertidos para símbolos oficiais de genes de HUGO. valores de expressão de múltiplas sondas destinada a um único gene foram em média, resultando num total de 15.950 genes únicos. Posteriormente, os dados de expressão obtidos a partir de vários hibridações (

n

= 4) dos mesmos HMEC-1 espécime foram em média.

Os dados foram depositados em Gene Expression Omnibus NCBI (GEO) e são acessíveis através do número Adesão GEO Series GSE62523 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE62523).

comparação Classe

a definição de exposição “aguda”, genes diferencialmente expressos entre HMEC-1 amostras não tratadas e as amostras expostas a diferentes doses de droga (ie IC

50 e IC

90) foram testados com o teste Cuzick não paramétrico de tendência linear , resultando em um

Z

pontuação e um

P

valor. Este teste foi feito para as células coletadas após 6 (

t

= 6), 24 (

t

= 24) e 48 (

t

= 48) horas. Para todos os três pontos de tempo ao

Z

pontuação resultante da Cuzick testes de tendência linear foi resumido (ou seja,

esZ

=

Z

t = 6

+

Z

t = 24

+

Z

t = 48

); seleccionando assim em genes com a restrição de que as alterações na expressão numa direcção consistente com concentrações crescentes ao longo do tempo. Genes foram classificados de acordo com a sua

esZ

pontuação.

Na exposição “crónica” configuração, a T-teste foi realizado em níveis de expressão de genes obtidos a partir de amostras expostas às drogas (IC

10 cisplatina ou IC

10 bleomicina) versus as amostras de controlo não tratadas que foram recolhidos após 30 dias de incubação. Os resultados destes genes foram classificados de acordo com

P-

valor.

Gene Set Análise de Enriquecimento

Gene Set Análise de Enriquecimento (GSEA) [23] foi executado com software GSEA 2.0 pacote (Broad Institute, Cambridge, MA). dados de expressão de todos os genes de 15.950 foram comparados contra define gene funcional para determinar se qualquer um destes conjuntos foram enriquecidas em HMEC-1 tratadas com bleomicina ou cisplatina no “aguda”, bem como o ajuste de exposição “crónica”. A comparação foi realizada utilizando 169 conjuntos de genes de Kyoto Encyclopedia of Genes e banco de dados de genomas (KEGG; https://www.genome.jp/kegg/). A significância estatística de enriquecimento foi determinada utilizando um teste de permutação com base em genes empírica usando 1000 permutações. foi calculada uma taxa de descoberta de falsas (FDR) para cada conjunto de genes funcionais, que representam a probabilidade estimada de que uma determinada pontuação enriquecimento representa um achado falso positivo. Relatamos conjuntos de genes com um FDR ≤ 0,10 e

P

≤ 0,025.

Quantitative PCR em Tempo Real

A expressão diferencial de três genes foi validado por qRT-PCR. Para este efeito, foram utilizadas amostras de RNA incluídos na análise de cDNA microarray. Além disso, duas experiências independentes foram realizados em que HMEC-1 foi exposta a cisplatina e bleomicina de acordo com a configuração -exposure “agudo”. As amostras de RNA foram isolados após 6, 24 e 48 horas de exposição à droga (Fig S1A.). Todas as amostras de RNA foram tratadas com DNase para eliminar a contaminação de ADN genómico, e subsequentemente, o ARN foi transcrito reversamente em ADNc. qRT-PCR foi efectuada utilizando ensaios de TaqMan da Applied Biosystems, de acordo com o protocolo do fabricante. Mistura de PCR, os iniciadores e sondas TaqMan foram adquiridos à Applied Biosystems (Nieuwerkerk a d IJssel /, Países Baixos). Três genes, com expressão altamente diferenciado em três das quatro configurações experimentais, foram considerados candidatos plausíveis para validação de qRT-PCR. Os genes e os respectivos números de ensaio a expressão do gene respectivo Taqman foram Diferenciação de Crescimento Fator 15 (

GDF-15;

Hs00171132_m1), ativando Fator de Transcrição 3 (

ATF3;

Hs00231069_m1), Amphiregulin (

AREG;

Hs00155832_m1); na expressão adição do gene housekeeping gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (

GAPDH

; Hs02758991_g1) foi determinada. Todas as experiências foram realizadas em triplicado utilizando ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System, com as seguintes condições de ciclo: 2 min a 50 ° C, 10 min a 95 ° C, seguido de 40 ciclos de 15 seg a 95 ° C e 1 min a 60 ° C. Quantidade relativa de genes alvo foi calculada dividindo o limiar significativo ciclo (CT) para o gene de interesse pela média CT-valor para o gene de manutenção

GAPDH. de expressão de diferenças relativas foram calculados comparando a expressão para-ponto de tempo inicial (t = 6, S1A Fig.). Dois lados t-teste foi utilizado para comparar as diferenças na expressão. Os valores P 0,05 foram considerados para indicar uma diferença significativa.

Os níveis de proteína no cancro testicular plasma do paciente durante e após bleomycin- e baseada em cisplatina quimioterapia

Para clinicamente validar os resultados da linha de células 15 GDF- modelo, utilizamos uma coorte de 41 pacientes com câncer testicular que participaram de um estudo prospectivo sobre alterações cardiovasculares relacionados com a quimioterapia início durante regimes bleomycin- e baseados em cisplatina. Os pacientes elegíveis para o estudo tinha câncer testicular metastático, foram 18-50 anos de idade e estavam a receber primeira linha quimioterapia à base de cisplatina na Universidade Medical Centre Groningen, na Holanda. Os critérios de exclusão foram a quimioterapia ou radioterapia, presença de DCV, o uso de eritropoietina e taxa de filtração glomerular 60 mL /min. O comitê de ética local aprovou o estudo, e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes. Dependendo do Grupo Colaborativo Câncer (IGCCCG) grupo prognóstico sua Cell International Germ, os pacientes receberam três ou quatro cursos BEP duração de 3 semanas cada (bleomicina-30 USP, dias 2, 8 e 15; etoposídeo-100 mg /m

2 , dias 1-5) e cisplatina-20 mg /m

2, dias 1-5). Durante os primeiros 6 dias os pacientes foram hidratados com 4 L de NaCl 0,9% /dia e recebeu terapia diária anti-emético (dexametasona, ondansetron). Amostras de sangue foram colhidas no dia 1, 8 e 15 do primeiro curso da quimioterapia, dia 1 e 8 do segundo e terceiro curso, (c1d1 (= linha de base), c1d8, c1d15, c2d1, etc.), um mês após a conclusão e um ano após o início da quimioterapia. O plasma com EDTA foi serialmente recolhido e armazenado em -20 ° C até à análise. Os dados de referência foram obtidos a partir irmãos do sexo masculino saudáveis ​​de sobreviventes de câncer infantil para adultos, que participaram como sujeitos de controle em um estudo transversal sobre sequelas cardiovasculares tardio do tratamento para o cancro da infância [24]. Fora destes irmãos saudáveis ​​do sexo masculino, um grupo de controle com uma idade mediana comparável como os doentes com cancro testicular foi selecionado. As medições nos controles foram realizados como descrito acima

Plasma de GDF-15 os níveis de proteína foram determinadas por enzima-ligada sanduíche de ensaio imunoenzimático (ELISA) com um kit disponível comercialmente (R D Systems, Abingdon, Reino Unido).. Além disso, estes níveis de proteína GDF-15 estavam relacionados com marcadores de plasma quanto a danos endoteliais (factor de von Willebrand (vWF), medido como descrito anteriormente) [25], e a inflamação sistémica (de alta sensibilidade a proteína C-reactiva (hsCRP), como descrito anteriormente ) [26]. Para a análise de alterações nesses marcadores, os dados não distribuídos normalmente são representados como mediana (intervalo). Para comparações entre os grupos foi aplicado o teste não paramétrico de Mann-Whitney; teste de classificação assinado de Wilcoxon foi utilizado para alterações emparelhados. Foram considerados dois lados valores de P ≤ 0,05 para indicar significância, SPSS versão do pacote de software 22 (SPSS Inc., Chicago, IL) foi utilizado.

Resultados

cDNA microarray

comparação Class. A 50 parte superior da maioria dos genes diferencialmente expressos em a exposição “aguda” e “crónica” configuração de bleomicina e cisplatina são resumidos na Tabela 1. A Fig. 1 mostra um diagrama de Venn dos genes sobrepostos no top 50 da das quatro configurações de exposição diferentes. A partir desta análise de três genes, v.g.

GDF-15

,

ATF3

e

AREG

, foram encontrados no top 50 de três em cada quatro configurações de exposição. Devido a esta sobreposição nas diferentes configurações de exposição consideramos estes três genes candidatos plausíveis, e selecionou estes para validação por qRT-PCR.

cDNA microarray-GSEA. Vias enriquecidas em um FDR ≤ 0,10 e

P

≤ 0,025 no GSEA estão resumidos na Tabela 2. No “aguda” -exposure definindo a bleomicina, seis vias foram enriquecidos (todos sobre-regulada), enquanto que nenhuma vias foram enriquecidos na “crónica” o ajuste com os critérios estabelecidos para FDR. exposição a cisplatina resultou em 12 vias enriquecido no ambiente -exposure “aguda” (sobre-regulada n = 3, sub-regulada n = 9), enquanto seis vias foram enriquecidos na configuração -exposure “crónica” (todos os sub-regulada). O ‘p53’ e conjuntos de genes da “Diabetes Mellitus Tipo I” foram enriquecidos em três dos quatro configurações de exposição; genes incluídos neste conjunto de genes estão resumidos na Tabela S1.

qRT-PCR

Para validar as alterações na expressão de

GDF-15

,

ATF3

e

AREG

qRT-PCR foi realizado. Na configuração -exposure “aguda”, o ARNm-expressão de todas as três genes aumento no tempo após a exposição a bleomicina e cisplatina, em concordância com os dados de microarray. Após 48 horas de exposição a ambos os fármacos, a expressão de ARNm de todos os três genes foi significativamente maior em comparação com células de controlo não tratadas. Não houve alteração na expressão de ARNm destes três genes ocorreu em células de controlo não tratadas em tempo (Fig. 2).

Plasma de GDF-15 os níveis de proteína em pacientes com cancro testicular tratados com quimioterapia BEP-

com base em dados da literatura foram selecionados GDF-15 para uma validação adicional no nível de proteínas no plasma do paciente com câncer testicular durante e após o tratamento, e relacionados GDF-15 níveis para plasma conhecido biomarcadores de dano endotelial (vWF, PCR-US) [25 , 26]. As características basais dos doentes estão resumidos na Tabela 3. Embora curto de significância (p = 0,06), de linha de base (isto é, antes do início da quimioterapia) os níveis da proteína GDF-15 em pacientes de cancro testicular não eram diferentes dos machos saudáveis ​​de idade (Fig. 3A). Os pacientes no grupo de bom prognóstico IGCCCG teve GDF-15 níveis ligeiramente inferior de base de proteína do que os pacientes em grupos de prognóstico intermediário ou pobres (bom prognóstico: média 362,9 pg /mL (intervalo 197,6-1.059,5; n = 33), intermediário /mau prognóstico: média 689,1 pg /ml (intervalo 186,8-1.935,0; n = 8);

P

= 0,04). baseline mediana GDF-15 de nível não foi relacionada com o estágio do tumor (fase 2 da doença: a média de 373,0 pg /mL (intervalo 197,6-1.935,0; n = 30), a fase 3 4 doença: a média de 486,4 pg /mL (intervalo 186,8-1.875,9; n = 11);

P

= 0,40). níveis pré-quimioterapia GDF-15 proteína não estavam relacionadas com a idade (r

s = 0,08;

P

= 0,61).

A. os níveis de proteína GDF-15 em pacientes com cancro testicular metastático (n = 41) antes do início da quimioterapia e bleomycin- à base de cisplatina, em comparação com os homens da mesma idade saudáveis ​​(n = 10); B. Plasma GDF-15 níveis de proteína antes, durante e após a conclusão da quimioterapia bleomcyin- e baseada em cisplatina para o cancro testicular. A amostra em c1d1 é desenhado antes do início da quimioterapia. (*) P 0,05 em relação ao valor de referência ou ponto de tempo indicado.

Durante BEP-quimioterapia, GDF-15 níveis de proteína aumentou em relação à linha de base, com níveis significativamente mais elevados 1 meses e 1 ano pós-quimioterapia ( A Fig. 3B, a Tabela 4). Em comparação com pré-quimioterapia, os níveis plasmáticos de FvW e hsCRP mudou significativamente durante o tratamento (Tabela 4). Após a conclusão da quimioterapia, VWF níveis permaneceram persistentemente elevado, ao passo que hsCRP retornou aos valores-quimioterapia pré. No início do estudo, os níveis de GDF-15 estavam relacionados com níveis de vWF (r

s = 0,35;

P

= 0,03) e hsCRP (r

s = 0,39;

P

= 0,014). Durante a quimioterapia, os níveis de GDF-15 correlacionaram com a c1d8 hsCRP (r

S = 0,44;

P

= 0,01) e com o vWF no c3d8 (r

S = 0,40;

P

= 0,017). Na visita de acompanhamento de um mês após o término da quimioterapia, os níveis de GDF-15 e vWF foram fortemente correlacionados (r

s = 0,56;

P

= 0,001), ao passo que essa relação não foi encontrada para GDF-15 e hsCRP (r

s = 0,18;

P

= 0,28). Um ano após o início da quimioterapia, não há relação entre GDF-15 níveis e vWF ou hsCRP (r

s = 0,28;

P

= 0,12; r

s = 0,10;

P

= 0,57) foi encontrado.

Discussão

neste estudo foi utilizada uma abordagem translacional imparcial com cDNA microarray como uma ferramenta para encontrar novos mecanismos relacionados e selecionar candidatos a biomarcadores envolvidos em quimioterapia induzida por lesão endotelial. Com este

in vitro

estratégia, encontramos vários genes individuais com mudanças significativas na expressão após a exposição a bleomicina e cisplatina. Três genes com diferenças forte expressão em três das quatro configurações experimentais,

GDF-15

,

ATF3

e

AREG

, foram validados por qRT-PCR. Além disso, revelou GSEA aglomerados de genes envolvidos em várias vias, incluindo “p53” e conjuntos de genes “Diabetes Mellitus Tipo I ‘, que foram afectados neste modelo. Além disso, mostramos que a BEP-quimioterapia. (Bleomicina; Etoposide; cisplatina), de fato, afetar plasma GDF-15 níveis de proteína em pacientes com câncer de testículo e que estes níveis relacionados com conhecidos biomarcadores de danos endoteliais, como vWF e hsCRP

na análise de um único gene vários genes foram significativamente diferencialmente expressos nas diferentes configurações experimentais na HMEC-1

in vitro

modelo. Os genes

GDF-15

,

ATF3

e

AREG

estavam no top 50 da maioria dos genes diferencialmente expressos em três ou quatro configurações de exposição.

a citocina de GDF-15 (também conhecida como inibidoras de citocina macrófago 1 (gene activado MIC-1) ou NSAID (NAG-1)) é um membro da família β factor de crescimento transformante (TGF-p). GDF15 é induzida por todos os tipos de estímulos, incluindo citocinas, quimioterapia e /ou radioterapia e lesões em todos os tipos de diferentes células e tecidos [27-30]. A libertação de GDF-15 pode induzir efeitos anti-inflamatórios, anti-apoptóticos e anti-proliferativas, exercendo assim os mecanismos vasculoprotetores. Portanto, o aumento da GDF-15 níveis de plasma no grupo de doentes pode resultar de um aumento da produção pelas células e /ou macrófagos endoteliais, para compensar os danos induzidos por quimioterapia. Em um estudo avaliando as mudanças de expressão de genes em amostras de câncer de próstata pré e pós tratamento com docetaxel /mitoxantrona,

GDF-15

foi um dos maiores genes regulados positivamente pós-tratamento [31], ilustrando que citostáticos pode influenciar

GDF-15

expressão tanto em células malignas e não-malignas.

os níveis elevados de GDF-15, têm sido associados com o risco aumentado de doenças hipotetizadas como resultado de inflamação crónica [29, 32] e numerosos estudos mostraram que a GDF-15 é um biomarcador valiosa para doenças cardiovasculares [29, 30, 32-34]. GDF-15 é pensado para desempenhar um papel relevante na resposta danos cardiovasculares [35], possivelmente através de uma resposta pró-angiogénicos como foi demonstrado em um modelo pré-clínico com HUVEC [36]. GDF-15 é também descrito como biomarcador /preditor de albuminúria, como reflexo de micro-vascular danos estabelecida [37]. Além disso, vários estudos implicam GDF-15 em aspectos de distúrbios metabólicos, por exemplo, a resistência à insulina e obesidade [30, 38, 39]. Recentemente, altos níveis circulantes de MIC-1 /GDF-15 também foram associados com um risco aumentado de cancro colorectal apoiar um papel da inflamação crônica no desenvolvimento do cancro colo-rectal [40].

ATF3

é um membro a jusante da via de sinalização MAP-cinase, que codifica para um factor nuclear que estimula a transcrição sobre o stress celular. Rápido aumento da regulação do

ATF3

é uma resposta ao estresse central em diferentes modelos de células endoteliais, induzida por vários estímulos nocivos [41-46]. Interferência com células

ATF3

-levels protegidas de indução de apoptose, por exemplo, induzida por TNFa, em HUVEC, [47], por cisplatina em uma linha celular de glioblastoma humano [42], ou relacionados com a doxorrubicina em cardiomiócitos [48]. Curiosamente, imunohistoquímica medido

ATF3

-expression é aumentada em áreas ateroscleróticas das artérias ilíacas humanos [43]. Poucos estudos abordaram

AREG

, um membro dos receptores do factor de crescimento epidérmico que desempenha um papel importante na proliferação celular e sobrevivência. células de cancro da mama expostas a cisplatina secretada a AREG-proteína durante períodos de tempo prolongados, isto é, até 72 horas após a exposição [49].

Com base nos dados disponíveis, decidimos estudar os níveis de proteína do plasma de GDF-15 em doentes com cancro testicular antes, durante e após o tratamento com BEP por quimioterapia, e relacionar alterações aos níveis de biomarcadores de danos endoteliais conhecidos [25, 26]. Os aumentos de GDF-15 durante todo o tratamento, bem como pós-quimioterapia pode, em parte, referem-se a mecanismos relacionados com o cancro, como o nível de proteína GDF-15 wasslightly maior em pacientes com estágio mais avançado da doença medida pelo escore IGCCCG, que podem dizer respeito a liberar de GDF-15 a partir de células tumorais apoptóticas. No entanto, o seu papel na lesão endotelial é apoiada pelo facto de que o GDF-15 correlacionaram-se com os níveis de proteínas conhecidas para reflectir danos endoteliais relacionadas com a quimioterapia em doentes com cancro testicular, o vWF e hsCRP [25, 26]. Portanto, é concebível que o aumento observado na GDF15 plasma está envolvida na lesão endotelial relacionados com a quimioterapia, no entanto, não é provavelmente devida à lesão endotelial sozinho. Uma vez que esta proteína é mecanisticamente relacionadas com danos endoteliais relacionadas com a quimioterapia pode ser um biomarcador potencialmente sensível para a detecção deste dano. Uma análise mais aprofundada prolongado de níveis GDF15 em combinação com fenotipagem de fatores de risco cardiovascular em uma coorte maior de pacientes se justifica. Embora neste estudo não houve relação entre os níveis de pré-tratamento de GDF15 e idade, sabe-se que é esse o caso na população normal e deve ser tomado em conta quando se analisa os níveis GDF15 no tempo. Além disso, o facto de o TGF-via está envolvido neste danos pode ser uma pista para intervenções que diminuem a quantidade de danos endoteliais relacionadas com o tratamento com bleomicina e cisplatina.

GSEA mostraram significativamente enriquecida de várias vias, incluindo “p53” e “Diabetes Mellitus Tipo I” na exposição “aguda” a bleomicina e cisplatina, ea exposição “crónica” a cisplatina. A constatação de que genes relacionados com a p53 foram afetados pela bleomicina, bem como cisplatina ilustra a validade da nossa abordagem, como ambas as drogas exercem o seu efeito terapêutico chave por indução de apoptose celular. O conjunto de genes “Diabetes Mellitus Tipo I ‘enriquecido inclui vários genes envolvidos em processos inflamatórios, por exemplo, Human Leucocyte Antigen-moléculas, interleucinas e TNF, indicando que a bleomicina e cisplatina induz uma resposta inflamatória nas células endoteliais. Este achado é completamente em linha com estudos em pacientes com câncer testicular tratados com regimes baseados em cisplatina, que apresentaram taxas mais elevadas de inflamação sistêmica e disfunção endotelial [25, 26, 50]. Como platina em circulação permanece detectável nos anos de circulação para décadas após o tratamento com cisplatina [51-52], sobreviventes de câncer testicular longo prazo podem muito bem ter dano vascular em curso e inflamação endotelial baixo grau crônica. Quando as respostas inflamatórias crónicas provar ser um factor patogénico importante para o desenvolvimento de lesão endotelial induzida pela quimioterapia, a intervenção com medicamentos anti-inflamatórios é uma abordagem racional para aliviar estes efeitos.

Em conclusão, nós utilizamos a cDNA microarray detectar em uma genes forma imparcial e vias associadas à lesão endotelial relacionada com a quimioterapia, para encontrar biomarcadores para e mecanismos envolvidos nessa danos. Em HMEC-1 expostas a bleomicina e cisplatina, vários genes foram fortemente expressos diferencialmente, por exemplo,

GDF-15

,

ATF3

e

AREG

. Em GSEA, aglomerados de genes envolvidos na morte celular e inflamação foram afectados. As alterações observadas no plasma de GDF-15 os níveis de proteína em pacientes com cancro testicular induzidos por quimioterapia cisplatina e contendo bleomicina indicam que esta abordagem de pré-clínico informativo pode ser traduzido para um ambiente clínico, e que o GDF-15 pode ser um biomarcador potencial de juros que é mecanicamente envolvidos em danos tecido saudável quimioterapia relacionadas com tais como lesão endotelial. Além disso

in vitro

e

in vivo

exploração é garantida. Isso facilita o raciocínio no sentido de seleção de alvos de intervenção, com biomarcadores substitutos precoce para lesão endotelial relacionada com a quimioterapia.

Informações de Apoio

S1 Fig. O delineamento experimental.

A. exposição “aguda” configuração: imortalizadas HMEC-1 foram expostas a bleomicina (0,3 ug /mL (IC50), 1,5 ug /mL (IC90)) ou de cisplatina (2,6 uM (IC50), 12,9 uM (IC90)) para 6, 24 e 48 horas; B. exposição “crónica” configuração: ao longo de 30 dias HMEC-1 foi exposta a 0,06 ug /mL de bleomicina (IC10) ou 0,52 pM de cisplatina (IC10) duas vezes por semana). Em ambas as experiências amostras não tratadas serviram como controle. (*) experimentos de RNA-isolamento e cDNA microarray; (†) isolamento do RNA e qRT-PCR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0115372.s001

(TIF)

S1 Table. Genes incluído no ‘p53’ e conjuntos de genes “Diabetes Mellitus Tipo I ‘no banco de dados KEGG, classificados em ordem alfabética

doi:. 10.1371 /journal.pone.0115372.s002

(DOC)

Reconhecimentos

Agradecemos a Kevin Bouma, Gert Jan Meersma, Haukeline Volders e Nynke Zwart por sua assistência técnica e para a recolha de amostras de doentes.