Abstract
mediada por Nonsense mRNA Decay (NMD) degrada mRNAs mutante contendo códon de terminação prematura (PTC-mRNAs). Aqui nós avaliar a consequência da actividade NMD nos cancros colo (CRCs) que mostram instabilidade de microssatélites (MSI), cuja progressão é associado com o acúmulo de PTC-mRNAs que codificam proteínas imunogênicas devido a mutações frameshift em sequências codificantes de repetição. A inibição da UPF1, um dos principais factores de NMD, foi conseguida por siARN na linha celular MSI CRC HCT116 e as resultantes alterações na expressão de genes foram estudados utilizando microarrays de expressão. O impacto da actividade de NMD também foi investigado em CRCs MSI primárias pela quantificação da expressão de vários ARNm em relação ao seu estado mutacional e a UPF1 endógena e expressão UPF2. a imunidade do hospedeiro contra as células cancerosas desenvolveram MSI foi apreciado por quantificação do número de linfócitos que se infiltram no tumor CD3ε-positivas (TIL). UPF1 silenciamento levaram à sobre-regulação de genes em HCT116 1251, entre os quais uma proporção delas (ou seja, 38%) significativamente mais elevada do que o esperado por acaso continha um microssatélite codificação (
P
2 × 10
-16). Em MSI CRCs primários, UPF1 foi significativamente sobre-expressos em relação a mucosa adjacente normal (
P Art 0,002). Nossos dados forneceu evidências para a deterioração diferencial da PTC-mRNAs em comparação ao tipo selvagem que foi positivamente correlacionada com UPF1 nível de expressão endógena (
P
= 0,02). Foi observado um efeito negativo de expressão UPF1 e UPF2 na resposta anti-tumoral do hospedeiro (
P Art 0,01). No geral, nossos resultados mostram que NMD influencia profundamente tumorigênese MSI-driven no nível molecular e indicam um impacto negativo funcional deste sistema sobre a imunidade anti-tumor cuja intensidade foi recorrentemente demonstrado ser um fator independente de desfecho favorável para CRCs.
Citation: El-Bchiri J, Guilloux A, Dartigues P, Loire E, Mercier D, Buhard O, et al. (2008) Nonsense-Mediated mRNA Decay Impactos MSI-Driven Carcinogênese e Anti-Tumor Immunity em cânceres colorretais. PLoS ONE 3 (7): e2583. doi: 10.1371 /journal.pone.0002583
editor: Cathal Seoighe, Universidade de Cape Town, África do Sul
Recebido: 02 de abril de 2008; Aceito: 28 de maio de 2008; Publicação: 09 de julho de 2008
Direitos de autor: © 2008 El-Bchiri et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente financiado por doações da Association pour la Recherche contre le Cancer (número de crédito 3946). JEB, EL e PDLG eram beneficiários de uma bolsa da Ministère Français de la Recherche (MRT)
Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
mediado por mutações nonsense ARNm decaimento (NMD) é um mecanismo de controlo do ARNm evolutivamente conservadas que reconhece e elimina mRNAs aberrantes que albergam codões de terminação prematuros (PTC), evitando assim a acumulação de proteínas truncadas potencialmente nocivos em células eucarióticas [1]. Após pré-mRNA splicing, NMD alvos são reconhecidos por meio de um complexo multiproteico exão-junção (EJC) que é depositado de 24 nucleótidos a montante de cada junção exão-exão. Como regra geral, que tenha sido estabelecido que os ARNm contendo aberrantes PTC localizados quer a menos de 50-55 nucleótidos a montante do último junção exão-exão ou no último exão não são degradados por NMD (NMD-irrelevante) [2]. O núcleo de efectores NMD compreende as proteínas evolutivas-UPF, conservada UPF1 /RENT1, UPF2 /RENT2, e dois parálogos de UPF3, UPF3 (também chamado UPF3a) e UPF3X (também chamado UPF3b). UPF1 é um RNA helicase cuja actividade é regulada por ciclos de fosforilação /desfosforilação. A fosforilação de UPF1 requer UPF2 e UPF3 e é catalisada por SMG1, uma cinase de proteína relacionada com a família fosfoinositide-3-quinase. UPF1 fosforilação por SMG1 tem sido mostrado para ser o passo limitante da velocidade na NMD [3], [4]. É digno de nota que a actividade SMG1 não só é dedicado a NMD mas também desempenha um papel na sinalização de danos de ADN e de reparação, nomeadamente por fosforilação de p53 [5]. A desfosforilação de UPF1 é mediada por SMG5, SMG6 e SMG7, três proteínas que actuam como adaptadores fosforilados entre 2A UPF1 e proteína fosfatase [3]. UPF1 função é crucial na NMD, enquanto UPF3 e UPF3X são parcialmente redundantes [6] e UPF2 é dispensável em alguns casos, o que sugere a existência de uma via independente de NMD UPF2 [7]. UPF1 actua não só na degradação mediada por NMD de transcritos aberrantes, mas também na deterioração fisiológica de vários ARNm, que regula a expressão de 3-10% do transcriptoma [8], [9]. O silenciamento de UPF1 e, em menor extensão UPF2 foi reportado para modular o nível de um certo número de substratos fisiológicos, incluindo NMD de transcritos com grelhas de leitura aberta a montante da região 5 ‘não traduzida, transcritos contendo um intrão dentro da sua expressão 3’- região não traduzida assim como transcrições derivadas a partir de transposão ou retrovírus endógenos [8], [10]. NMD também tem sido proposta para desempenhar um papel na regulação de eventos de splicing alternativo, uma vez que as análises de sequência com base em prever que cerca de 35% dos eventos de splicing alternativo de mamífero produzir PTC contendo variantes de splicing. No entanto, recentemente, tem sido relatado que a maioria dos PTC contendo variantes de splicing são produzidos em níveis baixos em células de origem humana, independentemente da acção de NMD, sugerindo que a maioria de tais eventos PTC-introduzem não estão sob pressão de selecção positiva e, por conseguinte, não são espera-se contribuir importantes papéis funcionais [11].
até o momento, as consequências da atividade NMD foram principalmente investigada em doenças hereditárias monogênicas, incluindo tumores hereditários [12]. NMD foi reportado para proteger portadores heterozigotos dos efeitos deletérios de algumas aberrantes PTC-ARNms que codificam as proteínas truncadas com a actividade dominante negativa [12]. Por outro lado, a incapacidade de NMD na degradação de transcritos NMD-irrelevantes tem sido proposto para favorecer a expressão fenotípica das doenças hereditárias dominantes [12]. Uma vez que as células cancerosas são geneticamente instáveis e acumular numerosas mutações frameshift somáticas em genes que desempenham um papel na transformação de células esperado, o sistema de NMD tem sido proposto para desempenhar um papel no desenvolvimento de tumores [12]. No entanto, a avaliação do seu impacto global sobre este processo tem sido pouco descrita e continua a ser difícil de definir, uma vez que depende da natureza e do número de mutantes acumulados em células cancerosas durante a progressão do tumor. Até à data, a inibição NMD tem sido utilizado com sucesso como uma estratégia de
in vitro
para descobrir novos genes relacionados com o cancro que abrigam truncando mutações, sugerindo que ele pode de fato ter um papel na favorecendo a selecção de alguns eventos mutacionais frequentes em vários tipos de tumores [13]. É digno de nota que a actividade NMD foi mostrado ser altamente variáveis, conduzindo à deterioração incompleta e diferencial de ARNm NMD-relevantes putativamente contendo um PTC (referido como NMD-fuga) [14], [15], [16].
tumores MSI abrigando deficiência de reparo incompatível (MMR) são frequentes em humanos. Eles representam cerca de 15% dos colorretal esporádico, gástrica e tumores endometriais e incluem neoplasias que surgem na síndrome hereditária polipose Cancer Non colorretal (HNPCC). Dezenas de mutações que afectam genes que contêm sequências de repetição de codificação foram relatados nestes tumores, que define a assim chamada via mutadora cujo papel é suspeito de ser crucial na tumorigénese MSI-driven [17]. Até o momento, um grande número de publicações relataram mutações frameshift em genes envolvidos em várias vias biológicas, tais como regulação do ciclo celular (por exemplo,
TGFBR2
,
IGF2R
,
TCF4
,
AXIN2
,
PTEN
,
RIZ
), a apoptose (por exemplo,
BAX
,
CASP5
,
BCL10
,
APAF1
,
FAS
), DNA reparação de danos (por exemplo,
ATR
,
DNA-PKcs
,
RAD50
,
MSH3
,
MSH6
,
MBD4
,
MLH3
,
BLM
,
CHK1
) e outros [17]. Nós informou recentemente que a decadência de mRNAs derivados de mutação frameshift seguinte
in vitro
silenciamento de UPF1 e /ou UPF2 em um painel de linhas celulares MSI CRC foi diferencial e incompleta [14]. Se não totalmente degradado, os ARNm mutantes frameshift codificam proteínas contendo caudas C-terminais aberrantes, entre as quais algumas foram mostrados para exibir propriedades imunogénicas [18], [19]. Vários estudos têm enfatizado o fato de que, de acordo com este processo, os tumores MSI foram acentuadamente infiltrada por linfócitos citotóxicos intra-epiteliais se infiltram no tumor T (TIL) e que uma resposta imune tais celular foi preditivo de um resultado relativamente favorável independentemente da inicial estágio do tumor e outros fatores clínicos [20]. Por conseguinte, a actividade NMD pode interferir com a imunidade anti-tumor, limitando a expressão de algumas destas proteínas aberrantes. Usando câncer colorretal MSI como um modelo, buscamos aqui investigar ainda mais o papel do NMD na oncogênese.
Resultados
transcriptoma alterações secundárias à UPF1 silenciamento em células HCT116 CRC e sua relação com microssatélites instabilidade
Usando Affymetrix GeneChip® Exon Human 1.0 ST matrizes de expressão do gene, a expressão de genes 1363 foi encontrado para ser significativamente desregulamentado mediante silenciamento UPF1 na HCT116 linha de células (MSI) CRC, com uma mudança vezes ≥1.5 comparação com células não tratadas (Tabela S1). Com 111 outros, UPF1 foi, como esperado, um dos genes a ser significativamente regulada negativamente. O nível de inibição foi significativa ( 75%) e concordou muito bem com os dados obtidos por em tempo real quantitativa de RT-PCR (dados não mostrados). No geral, 1251 genes foram sobre-reguladas após o silenciamento UPF1 (1251/1363, ou seja, 92% de todos os genes desregulados sob estas condições), entre os quais 472 (38%) continha uma sequência de mononucleótido de repetição de pelo menos 7 pares de bases na região de codificação (Tabela S2). De interesse, o número total de genes no genoma humano com uma ≥7N codificação de repetição é tracto inferior (4470/22218;. 20% dados não apresentados), tornando significativamente mais elevada do que o esperado por acaso o número total de tais genes alvo para cima regulamentada em HCT116 em cima silenciamento UPF1 (
P Art 2 × 10
-16; Chi2 teste).
Entre os acima mencionados 472 genes em células HCT116, 22 genes contendo um mononucleótido codificação repetição de 7 a 10 nucleótidos foram escolhidas devido ao seu papel putativo na carcinogénese colorrectal e rastreadas quanto a mutações de inserção /deleção no estas células (Tabela 1). Todos esses genes, mas 3 (
MBD4
,
MSH3
,
TGFBR2
) nunca tinha sido relatada a ser mutado em MSI CRCs (Tabela 1). Usando essa abordagem, foram detectados ou confirmado mutações homozigotos no
SLC35F5
,
TGFBR2
,
ARV1
,
MSH3
,
SMAP1
genes e mutações heterozigóticas no
MBD4
,
Efhc1
,
TTC3
, e
WDR19
genes (Figura 1a). Todos os correspondentes mRNAs mutante nutria uma PTC localizados em regiões que podem estar propensas a NMD codificação. Além disso, observou-se que 4 outros genes alvo com descrito anteriormente mutações frameshift heterozigotos em HCT116 (
BAX
,
RECQL
,
RAD50
e
MSH6
) não foram significativamente re-expresso na sequência UPF1 silenciamento (Figura 1a). As taxas de re-expressão de PTC-mRNAs induzidos por UPF1 silenciamento em HCT116 são mostradas na Figura 1A e realçar o facto de que, como descrito [14], mediada por UPF1 decaimento do ARNm é altamente variável dentro de uma série de endogenamente mutado PTC-mRNAs embora ensaios de expressão específicas de alelos não foram usados para diferenciar entre mRNAs de tipo selvagem mutantes e, no caso de alterações do quadro de leitura heterozigotos.
TGFBR2
,
SLC35F5
,
ARV1
,
MSH3
,
SMAP1
,
TTC3
,
Efhc1
,
MBD4
,
WDR19
,
BAX
,
RECQL
,
RAD50
e
MSH6
abrigar mutações frameshift homozigotos ou heterozigotos na linha de células MSI CRC HCT116. Usando matriz expressão, dobrar alterações na expressão dos mRNAs correspondentes relativos ao silenciamento UPF1 foram determinadas (dobre mudança = E
ARNm em células tratadas com um siRNA UPF1 /E
ARNm em células tratadas com ARNsi de controlo). Os genes que estão sublinhadas são aquelas cuja re-expressão foi significativa nessas condições (1,5 fold-mudam-se com um valor-p ≤0.005). Evidência para a sensibilidade variável à deterioração mediada por UPF1 de tal PTC-mRNAs poderia, portanto, ser obtido, embora alelos ensaios de expressão específicos não foram usados para diferenciar entre mRNAs mutantes e do tipo selvagem no caso de alterações do quadro de leitura heterozigotos. b. Codificação mutações frameshift em genes alvo em relação ao NMD-estado MSI CRCs primárias. Frequências de mutações frameshift da mesma série de 13 genes-alvo para a instabilidade em 44 MSI CRCs primários estão representados. genes-alvo cujas mutações frameshift são frequentemente seleccionadas para durante a progressão MSI CRC abrigar diferentes sensibilidades a decadência mediada por UPF1.
mutações de enquadramento na MSI CRCs primários de acordo com o seu estado NMD
Todos os genes alvo mutantes em HCT116 para o qual anteriormente tinha sido determinado o impacto de NMD foram rastreados para mutações frameshift em sequências de codificação de microssatélites em uma série de primário MSI CRCs (n = 44). Isto inclui genes cuja mutação mRNAs são mais ou menos sensíveis ao NMD (
TGFBR2
,
SLC35F5
,
ARV1
,
MSH3
,
TTC3
,
Efhc1
,
MBD4
,
SMAP1
,
WDR19
,
BAX
,
RECQL
,
RAD50
,
MSH6
) (Figura 1a). As frequências de mutação desses 13 genes que representam possíveis alvos para a instabilidade MSI-driven foram muito variáveis nestes tumores (Figura 1b). Com base na sua alta frequência de mutação,
SLC35F5
,
ARV1
,
TTC3
, e
SMAP1
representam novos genes alvo em que as mutações frameshift ainda não tenham foram relatados em MSI CRC. Eles foram mutados em 48% (21/44), 23% (10/44), 32% (14/44) e 73% (32/44) dos tumores, respectivamente (Figura 1B).
a sobre-expressão de ARNm no MSI UPF1 primárias CRCs
ao medir os níveis de ARNm UPF2 UPF1 e por em tempo real quantitativa RT-PCR em uma outra série independente de MSI CRCs primários para os quais nós também obtidas as amostras correspondentes ao correspondentes de mucosa normal, observou-se a cerca de 7 vezes a sobre-expressão de UPF1 em tumores (n = 25) comparado com a mucosa normal (
P
= 0,0015; teste-t emparelhado) (Figura 2). Desde a quantificação (7 vezes) da sobre-expressão tem de ser tomado com cautela, devido à pequena quantidade de dados, verificamos que mRNA UPF1 estava realmente sobre-expressos em MSI CRCs primários através da realização de um teste qui-quadrado qualitativa, que é robusto para valores extremos. Usando essa abordagem, o número de casos em que a expressão UPF1 foi maior nos tumores comparado a correspondência mucosa normal (N = 20/25) foi significativamente diferente do que o esperado por acaso (
P
= 0,009; teste do qui-quadrado ). Estes dados estão ilustrados na Figura 2, em que 20 5 e os círculos abertos representam amostras de tumor que sobre-expressam MSI UPF1 ou não, respectivamente, são representados acima de uma linha pontilhada simbolizando a expressão deste factor NMD em mucosa normal. De interesse, uma tendência para a sobre-expressão deste factor também foi observada em não-MSI (MSS) CRCs (n = 31) nas mesmas condições (
P
= 0,08; teste-t emparelhado) (Figura 2). Em contraste, não foi UPF2 diferencialmente expresso em CRCs MSI ou MSS comparado com correspondentes de mucosa normal (
P
= 0,56 e 0,83, respectivamente; teste t emparelhado). (Figura 2)
em 25 e 31 MSI CRCs MSS comparou-se a expressão de UPF1 e UPF2 entre os tumores e combinados mucosa do cólon normal em tempo real quantitativa de RT-PCR. Em todos os casos, mas 5, a sobre-expressão de UPF1 foi observado em tumores MSI CRC. Considerando-se todas as amostras, a sobre-expressão de UPF1 em tumores MSI foi estatisticamente significativa (
P
= 1,5 × 10
-3; teste t pareado). Em MSS CRCs, uma tendência para a sobre-expressão desse fator foi observada nas mesmas condições (
P
= 0,08; teste t pareado). Em pacientes com MSI ou MSS CRCs, UPF2 não foi diferencialmente expressos entre o tumor e combinando mucosa normal (
P
= 0,56 e
P
= 0,83, respectivamente; teste t pareado).
deterioração significativa de mRNAs derivados de mutação frameshift que dependem de expressão UPF1 na MSI principal CRCs
em nossa série de 44 primário MSI CRCs, determinou-se ainda mais a relação
In vivo
expressão de 18 genes alvo MSI por quantitativa em tempo real RT-PCR usando condições experimentais que previamente determinados em uma série de linhas celulares de CRC (
ATR
,
BAX
,
BLM
,
CBF2
,
CDX2
,
GRB14
,
GRK4
,
IGF2R
,
MBD4
,
MSH3
,
MSH6
,
RAD50
,
RBBP8
,
RECQL
,
RIZ
,
TCF4
,
TFDP2
,
TGFBR2
) (Figura 3 e também a Tabela S3 para o estado mutacional desses 18 genes em MSI CRCs) [14]. Para todos os genes, exceto 3 (
CDX2
,
GRB14
,
TFDP2
), observou-se uma tendência para a deterioração do mutante em comparação com mRNAs de tipo selvagem. O decaimento do ARNm mutantes em comparação com os tipos selvagens-era significativo para MSH6 (
P
= 0,02; teste t de Student) e quase significativa para alguns outros só, v.g. BAX (
P
= 0,08), CDX2 (
P
= 0,10), MSH3 (
P
= 0,10), RIZ (
P = 0,10
) e TFDP2 (
P
= 0,10), proporcionando evidência para o decaimento diferencial de PTC-ARNm em comparação com o tipo selvagem na nossa série de CRCs primárias, como já foi descrito numa série de linhas celulares de CRC MSI [14] (Figura 3). No geral, houve uma deterioração muito significativa do PTC-mRNAs nos CRCs primários MSI (
P Art 10
-4, t de Student; seção ver os “Materiais e Métodos” para análises estatísticas ). Como prova indireta da contribuição da NMD, a intensidade geral deste processo no MSI CRCs primários foi positivamente correlacionada com o nível de expressão UPF1 endógena (
P
= 0,02, teste t de Student; consulte a seção “Materiais e Métodos “seção para análises estatísticas), ao passo que o impacto da UPF2 não foi significativa (
P
= 0,72, teste t de Student) (dados não mostrados).
os valores ∂Ct são indicados em relação à o estado mutacional de cada gene na 44 MSI (CRCs primários de tipo selvagem e mutados amostras tumorais são indicados por círculos brancos e triângulos pretos, respectivamente). Para cada gene, foram calculados os valores médios de ∂Ct relacionados com o tipo selvagem (seta branca) ou amostras de tumores mutantes (seta preta). Para todos os genes, exceto 3 (
CDX2
,
GRB14
,
TFDP2
), uma tendência para a deterioração do mutante em comparação com mRNAs de tipo selvagem foi observada (valores ∂Ct são inversamente proporcional à expressão do gene). No geral, os dados fornecem evidências de deterioração significativa da PTC-mRNAs em comparação com o tipo selvagem mRNAs
in vivo
na MSI CRCs primários (
P Art 10
-4, estudante
t
-teste).
UPF1 e UPF2 são fatores preditivos negativos da resposta imune do hospedeiro contra a MSI CRCs
Com a exceção de
TCF4
, há uma correlação positiva significativa foi encontrada entre a expressão endógena de PTC-mRNAs ea presença de TIL CD3ε-positivos em tumores (
P
TCF4 = 0,06; bootstrapped t-test) (dados não mostrados ). A ligação entre o número de TIL ea expressão de UPF1 e UPF2 não era linear, mas log-linear. Assim, a influência de UPF1 e expressão UPF2 sobre o número de TIL foi investigada
via
um teste de Wald e os coeficientes no modelo de regressão de Poisson foram estimados via mínimos quadrados iterativamente re-ponderados. Com base nestas observações, foi demonstrado um efeito negativo de UPF1 e expressão UPF2 sobre o número total de TIL CD3ε-positivo (
P Art 0,01 para UPF1 e UPF2, teste de Wald). Um modelo matemático correlação entre o número de TILs CD3ε-positivos com a expressão destes factores NMD em MSI CRCs foi estabelecida, prevendo que TILs aumentou em cerca de 30% quando a expressão de UPF1 foi reduzida a metade.
Estes dados estão ilustrados para UPF1 e UPF2 na Figura 4; amostras de tumores em que UPF1 e expressão UPF2 são baixas (abaixo da média) apresentaram taxas variáveis de CD3ε positiva-TIL enquanto as amostras tumorais em que UPF1 e expressão UPF2 são elevados (acima da média) foram encontrados para ser quase sempre caracterizada por uma baixa contar CD3, tornando UPF1 e UPF2 possíveis marcadores de imunidade anti-tumor pobres em MSI CRCs primários.
o número total de CD3ε positiva-TIL foi significativamente relacionado à expressão endógena de UPF1 e UPF2 nesta série de 44 MSI CRCs primárias (
P Art 0,01; teste de Wald). De interesse, enquanto as amostras tumorais em que UPF1 e UPF2 expressão era baixa (abaixo da média) apresentaram taxas variáveis de CD3ε positiva-TIL, amostras de tumores em que UPF1 e UPF2 expressão foi alta (acima da média) foram quase sempre caracterizado com baixa contagem de CD3 (macarrônico CRCs imunogénicas). Estes dados fazem UPF1 e UPF2 marcadores específicos de imunidade anti-tumor pobres em MSI CRCs primários. imunocoloração da proteína CD3 são apresentados para 2 amostras MSI principal CRC mostrando quer contar baixo CD3 e alto UPF1 e expressão UPF2 (esquerda) ou alta CD3 contam, em conjunto com baixa UPF1 e expressão UPF2 (direita).
Discussão
ao avaliar um grande número de genes alvo que foram mutados com taxas variáveis nas suas sequências de codificação de repetição, que mostram uma deterioração significativa do correspondente ARNm mutantes em comparação com o tipo selvagem em MSI CRCs primárias com um impacto significativo da expressão endógena de UPF1 neste processo, com UPF2 jogando um papel menor no processo, como foi recentemente descrito por nosso grupo de uma série de linhas celulares de CRC MSI [14]. Tomado um por um, observou-se uma decomposição significativa ou quase significativa de apenas alguns mRNAs mutantes em comparação com wild-tipos e isto não é surpreendente uma vez que: (i) tal como recentemente publicado pelo nosso grupo, impacto NMD sobre a expressão da grelha de leitura mutação derivada ARNm é altamente variável de um mutante de outra [14]; (Ii) as frequências das alterações de genes alvo foram muito variáveis e, por vezes, muito baixa em nossa série tumor; (Iii) alguns mutantes, em particular,
(TCF4) Quais são NMD-irrelevante. No presente estudo, nós também investigar mudanças de expressão de genes em grande escala em células MSI CRC no contexto de inibição NMD usando um método específico, mostrando que levaram à sobre-regulação de 1251 genes em HCT116, entre os quais uma proporção deles significativamente maior do que o esperado por acaso continha um microssatélite codificação. Embora nem todos eles são esperados para ser mutado em células MSI CRC, como mostrado aqui em uma curta série de genes alvo regulado para cima, que pode ser avançada que UPF1 é particularmente relevante para a modulação da expressão de dúzias de genes mutantes em MSI CRC células. Em geral, estes dados confirmam pela primeira vez, tanto
in vitro
e
in vivo
, que NMD influencia profundamente tumorigênese MSI-driven no nível molecular.
Como possível conseqüência funcional da atividade NMD
in vivo
na MSI tumorigênese, investigamos se a atividade deste sistema modula a imunidade anti-tumor. De interesse, a única mutação frameshift cuja presença foi significativamente associada com um maior número de TIL no MSI CRCs estava em
TCF4
, o único gene alvo NMD-irrelevante estudado em nossa série como a sua codificação de sequência de repetição está localizado dentro seu último exão. Além disso, foi observada uma correlação inversa entre UPF1 e expressão UPF2 eo número de TIL CD3ε-positivo na MSI CRCs, e um modelo matemático que liga o número de TIL CD3ε-positivas para a expressão de fatores NMD em MSI CRCs previu que TIL aumentou cerca de 30% quando a expressão de UPF1 ou UPF2 foi reduzida a metade. Estes dados indicam que NMD pode impactar negativamente a imunidade do hospedeiro contra as células tumorais MSI de um modo cumulativo
através
a degradação contrastado e incompleto de transcritos que codificam péptidos mutantes imunogénicos. Pode ser especulado que, neste contexto, factores UPF podem ser marcadores específicos de imunidade deficiente em MSI CRCs primárias. À luz destes resultados, pode, assim, ser avançado que o impacto negativo acima mencionado de NMD sobre o processo imunológico desenvolvido pelo hospedeiro contra as células tumorais MSI seria eficiente apenas quando fatores NMD são sobre-expressos e altamente ativo na degradação das inúmeras PTC- ARNm que codifica para péptidos imunogénicos que são sintetizados em MSI CRCs. Em contraste, pode-se supor que, quando expressa em taxas mais baixas, factores NMD seria ineficaz na prevenção do desenvolvimento de uma resposta imune anti-tumor cuja intensidade irá depender da quantidade e da natureza da alteração do quadro de leitura acumulados em células cancerosas MSI. Estes resultados podem ser de interesse clínico, pois, como mencionado anteriormente, a imunidade anti-tumor é geralmente considerado como um fator independente cuja intensidade tem sido consistentemente demonstrado ser preditivos de desfecho favorável independentemente do estágio do tumor de cólon inicial e outros fatores clínicos [20] .
uma vez que a eficiência de NMD para degradar os ARNm mutantes de genes alvo é altamente variável, foi recentemente proposto que NMD pode, por conseguinte, desempenham um papel importante na selecção de mutações no gene alvo com um papel funcional na carcinogénese MSI [14 ]. Vale ressaltar que entre os genes regulados mediante silenciamento UPF1, quatro ainda não publicado genes alvo (
SLC35F5
,
TTC3
,
ARV1
e
SMAP1
) são aqui demonstrado ser frequentemente mutado em nossa série de MSI CRCs primários. Entre eles,
SMAP1
, por estroma associado à membrana Proteína-1, foi previamente relatado para participar em rearranjos cromossómicos com
MLL
em malignidades hematológicas [21]. Com uma frequência de 73% de alterações de enquadramento na MSI CRCs primárias, incluindo mutações homozigóticas em cinco amostras de BF (dados não mostrados), que é um dos genes mais frequentemente mutado alvo em MSI CRCs em conjunto com o
TGFBR2
e
ACVR2
[17]. De acordo com nossos resultados anteriores e os obtidos por Ionov et
al.
Usando emethine como um inibidor não específico do sistema NMD [14], [22], confirmou-se neste estudo que
TGFBR2
PTC-ARNm é degradado por NMD em células MSI CRC. Em um artigo recente, você et
al.
[23] relatou dados contraditórios, alegando que este gene alvo, bem como
MSH3
escapar NMD na linha celular HCT116. Eles apresentaram resultados de uma série de PTC-mRNAs que mostram estas transcrições eram ou totalmente sensível ou completamente resistentes à NMD em células MMR-deficientes. Os dados foram obtidos através da realização de ensaios de expressão que não eram nem quantitativa nem específica de alelo. No mesmo estudo, os autores também sugeriram uma repressão translacional sistemática de proteínas truncadas de mRNAs derivados de mutação frameshift que escaparam NMD (NMTR para “Nonsense Mediated repressão translacional”) [23]. Verificou-se por Western blotting que a expressão das proteínas correspondentes para ambos os genes alvo mutantes homozigoticamente (
TGFBR2
,
MSH3
) não era detectável em células HCT116 (dados não mostrados). Ao contrário do que você et
al
, propomos que a perda de
TGFBR2
e
MSH3
expressão é principalmente devido ao NMD, em vez de uma via NMTR hipotética. É digno de nota que a existência de uma via NMTR não combina bem com as propriedades imunogênicas das células cancerosas MSI que dependem diretamente a acumulação de péptidos imunogénicos derivados de várias proteínas do quadro de leitura-relacionados cujos PTC-mRNAs são NMD relevantes na maioria dos casos [ ,,,0],18], [19], [20]. Independentemente das discrepâncias, todos estes dados argumentar a favor de um papel de NMD na modulação da expressão de vários genes cujas mutações foram já demonstrou
(TGFBR2
,
MSH3
,
MBD4)
ou espera-se que desempenham um papel importante durante a progressão MSI CRC [17]. esgotamento UPF1 com shRNA em células não-MSI HeLa Recentemente, foi relatado para induzir a paragem do ciclo celular na fase inicial S devido ao envolvimento deste fator na reparação do ADN [24]. Em contraste, silenciando transitória de UPF1 e /ou UPF2 em células de cancro colorectal MSI e MSS (HCT116, LoVo, Co115, LS174T, SW480, COLO320) não levar a alterações significativas de crescimento celular e /ou morte em nossas mãos (dados não mostrando). Mais estudos são agora necessários para determinar como a atividade NMD pode mudar o repertório de genes envolvidos na progressão tumoral carcinogênese e do impacto MSI utilizando modelos de ratos deficientes MMR em que a atividade UPF1 é modificado.
As nossas observações dizem respeito ao tumor primário mais frequente localização associada com MSI no humana, ou seja, do cólon. Eles indicam que NMD influencia profundamente a expressão de vários mutantes com um papel crucial esperado na tumorigênese MSI-driven e afeta negativamente a imunidade do hospedeiro contra as células cancerosas MSI. Tal função oncogénica putativo da NMD na MSI carcinogênese se encaixa bem com o fato de que nós também relatamos aqui pela primeira vez que UPF1 é significativamente sobre-expressos em CRCs MSI comparado a correspondência mucosa normal. Esta última observação baseou-se na medida do nível de ARNm UPF1. Como um ponto de vista, verificou-se agora a ser confirmado ao nível da proteína através de uma abordagem quantitativa tais como Western Blotting que aqui não foi realizada devido à falta de material tumoral adicional disponível. O desenvolvimento de ensaios clínicos deve agora ser desenvolvido para olhar se NMD pode ser considerada como um factor de mau prognóstico no MSI CRCs ou não. Pequenas moléculas inibidoras NMD estão agora disponíveis [25] e pode ser usado para obter mais conhecimentos sobre o papel NMD em cancros. Temos agora planeja usar essas drogas em MMR deficiente em ratos em desenvolvimento neoplasias MSI para avaliar se o mesmo pode constituir um novo alvo terapêutico para o tratamento desses tumores.
Materiais e Métodos
amostras do tumor e linhas celulares
a linha de células HCT116 de CRC foi adquirido da American Type Culture Collection e mantidas em DMEM (Life Technologies) contendo 10% de soro fetal de vitelo (Invitrogen) e glutamina sem antibióticos para permitir experiências de transfecção transiente com siARN. Quarenta e quatro MSI tumores primários foram obtidos de pacientes submetidos à cirurgia para câncer colorretal; todos os casos foram histologicamente confirmados como sendo adenocarcinomas. tumores coletados foram sistematicamente formalina-fixo e congelados após a cirurgia, sem qualquer incorporação prévia em nitrogênio líquido embebido em parafina. O estado MSI foi determinada por PCR multiplex fluorescente compreendendo 5 repetições mononucleotídicos quasimonomorphic (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 e NR-27), como descrito [26].