Abstract

O relógio circadiano central dentro do núcleo supraquiasmático (SCN) desempenha um papel importante na temporalmente organizar e coordenar muitos dos processos que regulam a proliferação de células cancerosas e o crescimento do tumor em sincronia com a luz diária ciclo /escuro, que pode contribuir para a prevenção do cancro endógeno. substratos bioenergéticos e intermediários moleculares necessários para a construção de biomassa tumor a cada dia são derivados de ambos glicólise aeróbica (efeito Warburg) e metabolismo lipídico. Usando xenoenxertos de cancro da mama humano isolado de tecidos cultivados em ratos nus, determinamos que circulam fatores sistêmicos no hospedeiro eo efeito Warburg, as atividades de captação de ácido /metabolismo e sinalização crescimento linoléico no tumor são regulados de forma dinâmica, coordenadas e integradas dentro da estrutura de tempo circadiano sobre uma luz de 24 horas /ciclo escuro por SCN-driven produção pineal noturna do hormônio melatonina anticancerígeno. luz fraca durante a noite (LAN) induzida por supressão de melatonina rompe este equilíbrio host /câncer circadiano-regulado entre vários mecanismos de sinalização de prevenção de câncer importante, levando a hiperglicemia e hiperinsulinemia no hospedeiro e glicólise aeróbica fugitivo, sinalização lipídica e atividade proliferativa no tumor.

Citation: Blask DE, Dauchy RT, Dauchy EM, Mao L, Encosta SM, Greene MW, et al. (2014) Exposição luz durante a noite Disrupts Anfitrião /Câncer circadianos reguladoras Dynamics: Impacto sobre o efeito Warburg, Lipid Signaling e Prevenção Tumor Crescimento. PLoS ONE 9 (8): e102776. doi: 10.1371 /journal.pone.0102776

editor: Shin Yamazaki, University of Texas Southwestern Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 25 Setembro, 2013; Aceito: 23 de junho de 2014; Publicação: 06 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Blask et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi generosamente apoiado pela Associação americana para a Ciência (www.aalas.org) Grants Laboratório de animais de Laboratório Ciência animal (GLAS) Adjudicação à IDT, Institutos Nacionais de Saúde (www.nih.gov) conceder R21CA129875 a DEB, Escola da Universidade de Tulane medicina (www.tulane.edu) e Louisiana Cancer Research Consortium (www.louisianacancercenter.org) Startup Grant 631.455 para DEB e National Institutes of Health conceder R01CA054152 a SMH. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o interesse renovado no metabolismo de crescimento do câncer [1] – [3] levou recentemente a uma re-avaliação intensiva do papel desempenhado pela glicólise aeróbica (por exemplo, o efeito Warburg) em crescimento maligno progressão [4 ]. A fim de satisfazer as suas necessidades bioenergéticos para apoiar a biossíntese dos blocos de construção moleculares e celulares necessários para aumentar rapidamente a biomassa do tumor, as células cancerígenas dependem principalmente no efeito Warburg, em vez de fosforilação oxidativa [1] – [4]. Na verdade, o efeito Warburg é caracterizada pela absorção celular robusta de glicose e seu metabolismo de lactato através de glicólise, apesar de um fornecimento abundante de oxigénio [1] – [4]. Estudos têm-se centrado na transdução de sinal e redes de transcrição, incluindo AKT [5], a hipoxia-inducible factor-1 alfa (HIF-1α) e c-myc [6] que dirige o efeito Warburg para redireccionar bioenergética de células de cancro para a geração de molecular intermediários para apoiar a divisão de células de cancro implacável [1] – [3]. proliferação de células cancerosas e do crescimento do tumor também contam com a absorção celular de ácido linoleico (LA), um ácido omega-6 essencial gordo (FA), que é a mais prevalente FA na dieta ocidental [7] – [9]. Em muitos tumores, células cancerosas tomar-se LA através de um mecanismo de transporte dependente de cAMP e metabolizar-lo para o ácido mitogénio 13-hydroxyoctadecadienoic (13-HODE) pela enzima 15-lipoxigenase-1 [9] – [12], a actividade de que é sobre-regulada por activação do factor de crescimento epidérmico (EGF) e factor de crescimento-1 (IGF-1) receptores [13], [14] do tipo insulina. Em muitos tumores, incluindo xenoenxertos de cancro humano [9], [11], [12], 13-HODE exerce um efeito de retroalimentação positivo sobre o EGF e o crescimento do receptor IGF-1 vias de sinalização para melhorar a fosforilação a jusante de ERK1 /2 e AKT levando a proliferação amplificada celular e respostas de sobrevivência [15]. Deve-se notar, porém, que em alguns outros sistemas modelo câncer e contextos experimentais de 13 HODE pode desempenhar um papel antiproliferativa [16].

processos homeostáticos que regulam a fisiologia de mamíferos e metabolismo das células, tecidos e órgãos para exposições ritmos circadianos que estão sincronizados pelo ciclo claro /escuro abrangendo cada dia de 24 horas. Isto é conseguido através da actividade endógena de cronometragem oscilatório do SCN no hipotálamo que recebe informações sobre o ciclo luz /escuro a partir dos olhos, principalmente por meio de células ganglionares da retina melanopsina-positiva intrinsecamente fotossensíveis com a entrada adicional de bastonetes e cones. Photic informação é então processado pelo SCN e transduzido para uma série de saídas hormonais e neurais aos tecidos-alvo periféricos [17]. Em humanos, a ruptura da regulação circadiana dos processos metabólicos, incluindo glicose e metabolismo lipídico induzida através do tempo anormal de luz pode levar a um aumento do risco de diabetes tipo 2, obesidade [18], [19] e várias doenças malignas, incluindo o cancro da mama como tem foi relatada em trabalhadores do turno da noite [20], [21]. O sinal do SCN que reflete de forma mais confiável atividade circadiano saída é a produção glândula pineal noturna de melatonina, que é suprimida pela LAN. O sinal circadiano da melatonina tem sido relacionada com a organização temporal e sincronização de numerosas actividades fisiológicas e metabólicas tais como a glucose e o metabolismo lipídico [19], [22], [23].

As saídas do SCN são acreditados para coordenar a temporização biológica de, e no caso de melatonina, modular os processos que regulam a iniciação do tumor, promoção e progressão incluindo a proliferação celular, síntese de DNA, a sobrevivência celular /apoptose, travessia do ciclo celular, danos no ADN /mecanismos de reparação, as actividades de supressores de tumor e células de tumor invasão /metástase [24] – [27]. Nós anteriormente demonstrado que a melatonina, em concentrações sanguíneas nocturnos fisiológicos, inibe directamente a síntese e o crescimento do ADN do tumor através da supressão da absorção de tumor dependente de AMPc de LA e o seu metabolismo para a molécula mitogénica 13-HODE [10], [12] por meio de um receptor de melatonina mecanismo mediada. No entanto, o potencial envolvimento de regulação circadiana e as consequências da sua perturbação no metabolismo do câncer, particularmente o efeito Warburg, nunca foram abordados desde que as investigações nesta área têm-se baseado, quase exclusivamente, em

in vitro

estudos em qual a influência do anfitrião câncer de regulação circadiana central é ausente. Postulamos que a bioenergética diária, sinalização metabólica, e actividades proliferativas necessária infra-estrutura para a construção de tumor apresentam ritmos circadianos dinâmicas em ambos o hospedeiro e tumor que contribuem para a prevenção do crescimento do tumor. Esses ritmos, que são dependentes da produção noturna de melatonina, um sinal de prevenção de crescimento do tumor circadiano, são interrompidos pela exposição do hospedeiro a LAN resultando em aumento do metabolismo e crescimento do tumor.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela Universidade Tulane Animal Care Institucional e Comitê de Uso (NIH Assurance # A4499-01). Todos os animais foram mantidos em um estabelecimento credenciado pela Associação para a Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care, International. Todos cirurgia foi realizada sob anestesia cetamina /xilazina, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Reagentes

cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) clorofórmio -grade, éter etílico, metanol, glacial cartuchos de ácido acético, heptano, hexano, e Sep-Pak C18 de HPLC para extracção de amostras foram adquiridos a Fisher Chemical (Pittsburgh, PA). ácido gordo livre, de ésteres de colesterol, triglicéridos, fosfolípido, padrões de éster metílico de óleo de colza, bem como trifluoreto de boro-metanol, cloreto de potássio, cloreto de sódio, perclórico e tricloroacético foram adquiridos a partir de Sigma Scientific (St. Louis, MO). Os padrões de HPLC, (+/-) 13 (S) -HODE 5-HETE e), bem como água ultrapura foram adquiridos a Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, Michigan).

Animais, condições de iluminação , a implantação do tumor, eo crescimento

ratos nus femininos desmamados (HSD: RH-

Foxn1 [rnu]

) entre 35 e 50 g foram alojados em gaiolas de policarbonato transparente (2 ratos /gaiola) em as câmaras de exposição instalação de laboratório luz em uma luz de 12 horas /12 horas escuro (LD, 12:12) ciclo (luzes acesas 0600-1800 horas ou tempo Zeitgeber ZT0-ZT12 a 23 ° C e 45-50% de umidade e permitiu para aclimatar a estas condições durante duas semanas. os ratos foram fornecidos água e comida (Purina Prolab RMH 1000) ad libitum durante toda a duração dos estudos. Após o período de aclimatização, os animais foram divididos aleatoriamente num grupo de controlo de 36 ratos que permaneceram na LD, 12:12 regime de iluminação (completa escuridão durante a fase escura) e outro grupo de 36 ratos mantidos em LD, 12:12 com a exposição para escurecer LAN durante a fase escura. a intensidade da luz durante a fase de luz de 12 horas em ambos os grupos foi fornecido por um sistema de um reator /lâmpada (GE Watt avarento, F34CW-RS-WM, lâmpada de 34 W) em cada câmara que forneceu um estímulo luz brilhante estável em animais nível dos olhos de 141 mW /cm

2 ( 345 lux). Na câmara proporcionando dim LAN, havia um segundo sistema de lastro /lâmpada (GE Starcoat, F32T8-SP-11, lâmpada de 32 W) que emitia constante estímulo luz fraca em animais nível dos olhos de 0,08 mW /cm

2 ( 0,2 lux) durante a fase de escuro de 12 horas [12]. Seis semanas mais tarde, os animais foram implantados com negativo do receptor de esteróide (SR) MCF-7 xenoenxertos de cancro da mama humano de um modo isolado para o tecido, como descrito anteriormente [12]. Estes tumores tinham evoluído ao longo de várias passagens de um subconjunto de SR + xenotransplantes que havia perdido a expressão de receptores de estrogênio e progesterona e tornou-se o estrogênio sem resposta. Estes xenoenxertos foram histopatologicamente caracterizado como pouco diferenciado, grau 3, infiltrando-se o adenocarcinoma ductal como previamente descrito [12]. Ao longo do estudo de crescimento circadiano /tumor, quando os tumores atingiram um tamanho suficiente para medição ratos foram submetidos a luz CO

2 narcose, e as dimensões do tumor foram medidas através da pele com um calibre de vernier a cada dois dias; dimensões do tumor foram convertidas em peso estimado do tumor usando uma fórmula de regressão linear e taxas de crescimento calculadas como anteriormente descrito [9], [12]. O peso final do tumor no estudo do crescimento tumoral foi determinada por pesagem, no final da experiência. No final de cada um dos períodos de crescimento do tumor, quando os tumores atingiram cerca de 5-6 g para ambos os grupos de controlo de LAN-expostos e, subconjuntos de 6 animais foram sacrificados ao acaso e os seus tumores foram recolhidas correspondentes a cada 4 horas durante um único 24 horas período de 6 pontos no tempo circadiano diferentes (por exemplo, 0800 horas = ZT2, 1200 horas = ZT6, 1600 horas = ZT10, 2000 horas = ZT14, 2400 horas = ZT18, e 0400 horas = ZT22), como descrito anteriormente [28]. Devido às taxas de crescimento do tumor muito acelerado no grupo de LAN, xenoenxertos (n = 36) atingiram o tamanho da colheita alvo de 5-6 g aproximadamente duas semanas antes de que os xeno-enxertos (n = 36) no controlo LD 12:12 grupo.

coleta de sangue arterial do tumor host Rats

Depois de duas semanas de esquemas de iluminação descritas acima, os animais foram submetidos a uma série de seis sangue baixo volume desenha via cardiocentesis para recolher ventricular esquerda de sangue arterial, tal como descrito anteriormente [9], [10], [12], [28] ao longo de um período de 30 dias antes do implante do tumor (ver acima). Resumidamente, coletas de sangue foram realizadas em intervalos de 4 horas designadas ao longo de um período de 24 horas com início às ZT2 (0800 horas), com cada animal que está sendo submetido a cardiocentesis apenas uma vez a cada 5 dias durante o período de 30 dias antes da implantação do tumor. Isso foi feito para que os animais para restaurar sua perda de volume de sangue pequena e minimizar o estresse e diminuir os efeitos potenciais do procedimento sobre a alimentação e morbilidade /mortalidade. Os animais foram levemente anestesiados com CO

2 inalação (70% CO

2/30% de ar); De 1 ml foram recolhidas amostras a partir do ventrículo esquerdo através de punção cardíaca (menos de 5% do volume total de sangue) através de uma seringa de tuberculina (calibre 25, em 3/8; Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) humedecido com heparina de sódio (1.000 U /ml; Elkin-Sinn, Cherry Hill, NJ), como descrito anteriormente. coleta de sangue durante a fase escura (ou seja, 2000, 2400, 0400 horas) foi realizada sob uma lâmpada vermelha safelight (Kodak 1A, modelo B, catálogo # 152 1517; 120 V, 15 W, Rochester, NY), a fim de preservar o aumento noturna de melatonina [9], [10], [12], [28]. exposição lâmpada vermelha animal ao nível dos olhos durante o breve procedimento cardiocentesis 45-sec não era maior do que 0,48 ± 0,01 lux (1,16 ± 0,04 mW /cm

2). Não houve complicações devido à anestesia ou cardiocentesis durante o período de coleta de sangue; a sobrevivência foi de 100% e os animais foram imediatamente activo seguindo o procedimento. As amostras de plasma foram armazenadas a -20 ° C até serem ensaiadas quanto à melatonina, insulina, glucose, lactato e ácidos gordos totais.

Recolha de sangue arterial de ratos doadores de tumor de perfusão

Antes do início do perfusões tumorais, 3-4 adulta nu ratas mantidas em LD 12:12 foram anestesiados utilizando solução de cetamina-xilazina (89,1 mg /kg e 9,9 mg /kg, IP). Os animais foram heparinizados jugular por meio de injecção de heparina de sódio (25 mg /kg; Sargent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL). Quarenta a 50 ml de sangue arterial foram recolhidas entre 0600 e 0900 horas (baixos níveis de melatonina) a partir da artéria carótida direita de ratos doadores através de cateter para as experiências de perfusão tumoral (3 a 4 perfusões por grupo), reunidas, filtradas através de uma 2 “× 2 “almofada de gaze (Kendall gurança Gauze esponja; Tyco Healthcare, Mansfield, MA), armazenada em um reservatório sob óleo mineral (Cat # M1180-500 ML;. Sigma Scientific, St. Louis, MO) e refrigeradas a 4 ° C em um reservatório de gelo e misturado suavemente através de um agitador mecânico (Modelo # 6975-171; Corning, NY) [9], [10], [12], [28]

tumorais isoladas-perfusão tecidual

In Situ

Quando (SR) MCF-7 xenoenxertos de cancro da mama humano atingiram 5-6 gm peso estimado do tumor, os animais foram preparados para medições de diferença artério-venosa de ácidos gordos totais (AGT), LA, 13-HODE, glicose, lactato, pO

2, CO

2 e pH entre 0600 e 1000 horas, quando os níveis de melatonina endógena eram baixos. xenotransplantes isolado de tecidos foram perfundidos

in situ

com doador rato de sangue total para que tanto a melatonina sintética (Sigma, St. Louis, MO) e /ou 13 (S) -HODE (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI), ou MT

1 /MT antagonista do receptor

2 melatonina S20928 (adicionou-se uma generosa oferta do Instituto de Recherches Internationales Servier, Courbevoie Cedex, França), como descrito anteriormente [9], [10], [12 ], [28]. Sets (3 ou 4 tumores /perfusão) de xenoenxertos de cancro da mama humano isolado de tecidos foram perfundidos

in situ Compra de 1 hr como descrito anteriormente [9], [10], [12], [28] com toda -sangue recolhidas de ratos dadores. A incorporação de [

3H] timidina no ADN do tumor foi iniciado 20 minutos antes do final de cada perfusão através da injecção de 20 ul de solução salina fisiológica contendo 2 uCi [metil-

3H] timidina /GM (New England Nuclear, Perkin Elmer, Boston, MA), o peso estimado do tumor para dentro do cateter arterial. Após a conclusão de cada perfusão, os tumores eram de congelamento e preso sob azoto líquido, pesado e armazenar a -85 ° C até análise.

Arterial glicose, lactato e Medidas /gás de ácido

Durante o curso deste estudo arteriais amostras de sangue total foram tomadas para medições de pH, pO

2, pCO

2, os níveis de glicose e lactato e hematócrito utilizando um Analisador iSTAT1 e CG4 + e CG8 + cartuchos (Abbott Laboratories, East Windsor, NJ). Os valores para glucose e lactato são relatados em mg /dL e mmol /L, e para o pedido

2 e pCO

2 como mm Hg. níveis de detecção mínimo para o pH, pO

2 e pCO

2, os valores de glicose e de lactato foram, respectivamente, 0,01, 0,1 mm Hg, 0,1 mm Hg, 0,2 mg /dL e 0,01 mmol /L.

a melatonina e insulina analisa

os níveis de melatonina no plasma arterial foram medidos através de radioimunoensaio utilizando o rato melatonina

125I – kit de radioimunoensaio (Trabalho Diagnostika Nord, Nordham, Alemanha) e analisados ​​utilizando um Packard Cobra 5005 Automated Contador Gama (Palo Alto, CA), como descrito anteriormente [10], [12]. os níveis de insulina no plasma arterial foram medidos usando um kit ELISA (Diagnostic Systems Labs., Webster, TX).

extração de ácidos graxos e análise

plasma arterial de ácidos graxos livres (FFA), triglicérides (TGA ), fosfolípidos (PL), e ésteres de colesterol (EC) foram extraídos a partir de amostras de 0,1 ml, como descrito anteriormente [9] – [10], [12], [28]. Antes da extracção do ácido heptadecanóico (100 ug), que tinha sido dissolvido em clorofórmio (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), foi usado como um padrão interno. Os ésteres metílicos de ácidos gordos (FAS) foram analisados ​​utilizando um Hewlett Packard (Paio Alto, CA) modelo 5890A Cromatógrafo de Gás equipado com um detector de ionização de chama (modelo # 7673 A) auto-injector (modelo # 7673 S), e um integrador (modelo # 3396A). Todas as separações foram realizadas usando um 0,25 mm × coluna capilar de 30 m (modelo # 2380; Supelco, Inc., Bellefonte, PA) a 190 ° C, com hélio como gás portador (velocidade linear de 20 cm /s; divisão 100:1). porta de injecção e detector foram ajustadas para 220 ° C. Todos os ésteres de metilo foram identificados com base na sua tempo de retenção, em comparação com a dos padrões conhecidos. O limite mínimo detectável para o ensaio foi de 0,05 ug /ml.

extracção do tumor lisado, extracção da proteína e análise por Western blot

tumores congelados foram pulverizados e homogeneizados manualmente em Hepes 50 mM, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1% de NP-40, 0,1% de SDS, 0,1% de desoxicolato de sódio, Na3VO4 1 mM, 100 nM de ácido ocadaico, e uma protease × jogo do cocktail inibidor I (Calbiochem /EMD Biosciences, Billerica, MA). Os lisados ​​de tumor foram centrifugadas a 15300 × g durante 20 minutos. Os sobrenadantes foram divididos em alíquotas e armazenado a -80 ° C. As concentrações de proteína dos sobrenadantes foram determinadas utilizando um kit de ensaio de proteína (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). A proteína total (80 ug por amostra) foi separado por electroforese num gel de SDS-poliacrilamida a 10% e electrotransferidas para uma membrana Hybond. Após incubação com leite magro a 5% em solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% de Tween, os imunoblots foram sondadas com anticorpos para fosfo-AKT (Ser

473), c-myc (Cell Signaling Tech., Inc., Danvers , MA) ou HIF-1α (BD Biosciences, San Jose, CA). As mesmas membranas foram retirados e re-sondada com anticorpos para AKT (Cell Signaling Technology, Inc.), tubulina ou GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato) (Millipore Corp., Billerica, MA).

Estatística análise

a presença de ritmos de tumor significativas durante o período de 24 horas e o grau de sua robustez em qualquer controle circadiano-regulado ou -disrupted grupos LAN-expostas foram determinados por análise Cosinor usando software periodograma (VBScript) . -Primas dados tumorais individuais recolhidos ao longo de um único período de 24 horas foram analisados ​​por este método com um período fixo de 24 horas. As diferenças estatísticas entre os valores médios no grupo LAN-expostos em relação ao grupo controle em cada momento circadiano foram avaliados pelo teste t de Student não pareado um. As diferenças estatísticas entre os grupos significa nos estudos de perfusão do tumor foram determinados por uma ANOVA one-way, seguido pelo teste de comparações múltiplas de Bonferroni para fazer as seguintes comparações múltiplas entre todos os grupos: controle versus melatonina; controle versus melatonina + 13-HODE; controle versus 13-HODE; melatonina melatonina contra + 13-HODE; melatonina + 13-HODE contra 13-HODE; e melatonina contra 13-HODE. Diferenças nas encostas de linhas de regressão (isto é, taxas de crescimento do tumor) entre os grupos foram determinadas por análises de regressão e testes de paralelismo (teste t de Student). Diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a p 0,05. teste t de Student, ANOVA one-way, seguido pelo teste post hoc de Bonferroni, e análises de regressão linear foram todos realizados utilizando GraphPad Prism 5 software.

Resultados

regulação circadiana e rompimento de factores do hospedeiro que circula

o primeiro examinadas potenciais dinâmica circadianos e a sua ruptura pela LAN em um certo número de factores do hospedeiro, incluindo os níveis plasmáticos de melatonina, o total de CC (AGT), LA, glucose, lactato e da insulina em ratos portadores de tecido isolado, esteróide negativo receptor (SR) MCF-7 xenoenxertos de cancro da mama humano em um claro /escuro (LD) 12:12 ciclo [12]. os níveis de melatonina no plasma foram baixos durante a fase de luz e marcadamente aumentou a amplitude de pico no meio da fase escura (Fig. 1A). Exposição de animais para escurecer LAN induzida uma supressão de 88% na amplitude noturna de melatonina sem afectar a sua fase circadiana (Fig. 1A). Plasma TFA (Fig. 1B) e LA (Fig. 1C) ritmos em controlos LD, que são dependentes de actividade alimentar noturna SCN-driven circadiano, foram conservadas em ratos LAN-expostos, indicando que a interrupção circadiano foi limitado a supressão da melatonina nocturna sinal. controlo circadiano dos níveis tanto de glicose no sangue e insulina independentes dos efeitos da ingestão de alimento foi avaliado em ratos [29]. os níveis de glucose no plasma aumentaram após as luzes acesas a pico na fase mid-luz seguido por um declínio até luzes apagadas (Fig. 1D). Seguindo luzes apagadas, as concentrações de glicose aumentaram inicialmente em seguida, diminuiu para um nadir na fase semi-escuros seguido por um segundo aumento durante o final do período de obscuridade. concentrações de lactato no plasma em animais mantidos em CE 12:12 foram geralmente baixas em toda a fase de luz seguido por um aumento durante o período escuro para atingir um pico duas horas antes de luzes acesas (Fig. 1E). Em condições LAN dim, os ratos se tornaram hiperglicêmicos com os níveis de glicose no sangue arrítmicos restantes marcadamente elevada em 50% acima dos níveis de controlo (Fig. 1D) enquanto que os níveis de lactato sanguíneo arrítmicos permaneceu consistentemente mais baixos do que os controles ao longo do período de 24 horas (Fig. 1E). Os níveis circulantes de insulina exibiram uma oscilação por dia, sob LD 0:12 (Fig. 1F), que geralmente espelhado o padrão de IGF-1 circulante concentrações previamente relatada [28]. LAN-expostos ratos tornou-se marcadamente os níveis de insulina com hiperinsulinemia reter um padrão oscilatório semelhante ao observado nos controlos CE 12:12 (Figura 1F.); IGF-1 circulante níveis foram também circadiano perturbado-elevada e sob condições de LAN [28].

(A-F), os níveis plasmáticos de melatonina (A), AGT (B), LA (C), glicose ( D), lactato de (e) e insulina (F) foram medidos em ratos fêmea hospedeira nus portadores de SR- xenoenxertos MCF-7 de cancro da mama humano isolado de tecidos sob LD, 12:12 (círculos pretos a cheio) ou DL, 12:12 + LAN (0,2 lux) (círculos vermelhos sólidos). Amostras de sangue arterial foram obtidas através de punção cardíaca em seis pontos de tempo circadiano diferentes durante um único período de 24 horas. O mesmo padrão único de 24 horas para cada analito plasma é exibida duas vezes para ilustrar a continuidade ritmo. Zeitgeber tempo (ZT) representa horas após luzes acesas (Zt0 ou 0600 horas); luzes apagadas em ZT12 (1800 horas). barras pretas no fundo de números indicam a fase escura e barras vermelhas indicam LAN. círculos pretos ou vermelhos sólidos são a média ± SD; n = 6 em cada ponto temporal. padrões rítmicos significativo no âmbito LD, 12:12 condições de A – F, p 0,001; significativa, mas interrompido padrões rítmicos sob dim LAN condições A – C e F somente, p 0,001 (one-way ANOVA). * P 0,01; ** P . 0,05 LAN vs LD, 00:12 (Student

t

test)

regulação circadiana e interrupção de glicose tumor e metabolismo do ácido linoleico

estamos próximos testaram se tumor de xenoenxertos-se exibiu ritmos circadianos em níveis de cAMP tumorais, captação de LA, a formação de 13 HODE eo efeito Warburg que poderia ser interrompido por supressão de melatonina induzida pela LAN. No presente estudo, o efeito Warburg é identificada como a absorção do tumor de glucose no sangue arterial juntamente com a libertação de lactato no sangue venoso do tumor [1] – [4]. Sob LD, 12:12 condições, os níveis de cAMP de tumor (Fig. 2A), TFA a absorção (Fig. 2B), LA (Fig. 2C) de fixação, e a formação de 13-HODE (Fig. 2D), o aumento durante a fase de luz atinge um pico duas horas antes de luzes seguido por uma redução, durante a fase escura para chegar a um ponto mais baixo de duas horas antes de luzes acesas. glicose tumor absorção (Fig. 2E) e produção de lactato (Fig. 2F) seguiu um padrão semelhante rítmica diariamente, aumentando durante a fase de luz para atingir um pico duas horas antes de luzes. Durante o período escuro houve um declínio progressivo na esses parâmetros com a captação de glucose atingindo um nadir no fim da fase escura e produção de lactato diminuindo de uma calha no período médio-escuro, seguido por um aumento até duas horas antes de luzes apagadas. Sob condições de LAN, no entanto, não só estes ritmos foram completamente ausente, mas os níveis de cada um destes parâmetros permaneceram significativamente elevados durante o período de 24 horas.

(A-H) Tumor níveis de AMPc (A) , a absorção de TFA (B), a absorção de LA (C), a formação de 13-HODE (D), a absorção de glicose (e), formação de lactato (F), [

3H] timidina em ADN (G), e o ADN conteúdo foram medidos sob LD, 12:12 ou LD, 12:12 + LAN; veja legenda para a Figura 1 para outras condições experimentais. (I) o crescimento tumoral em ambos os grupos foi medida ao longo do curso do experimento. círculos pretos ou vermelhos sólidos são a média ± SD peso estimado do tumor; N = 6 para o peso estimado do tumor. análise Cosinor revelou padrões rítmicos robustos e altamente significativos sob LD, 12:12 condições em analitos tumor; há padrões rítmicos diárias significativas foram detectadas em LAN dim (ver resumo Tabela 3). * P 0,01; ** P 0,05 LEN vs LD, 00:12 (

t

teste de Student). curvas de crescimento do tumor em I, p . 0,01 inclinação do crescimento do tumor no grupo LAN vs LD, 12:12 grupo (regressão linear)

regulação circadiana e interrupção de expressão tumoral de sinalização e fatores de transcrição

Foram abordados se AKT, c-MYC e /ou HIF-1α, principais reguladores da transcrição do efeito Warburg, exibem ritmicidade circadiana que é interrompido por LAN dim. Como um sinal estimulador fundamental para a sobrevivência de células tumorais /proliferação, e glucose e metabolismo LA, activação AKT [por exemplo, a fosforilação em serina 473 (S473)] foi a mais elevada durante a fase de luz e diminui depois disso para um nadir durante a fase semi-escuros. Os níveis de expressão de HIF-1α foram baixos durante a fase de luz, seguido por um aumento para o pico de expressão durante a fase escura (figura 3 E . F). No entanto, sob a exposição LAN dim, a expressão rítmica de ambos fosfo-AKT (pAKT

S473) e HIF-1α foi completamente interrompido (Fig 3 A . B e E F). Tumor de c-myc foi muito elevada durante toda a fase de luz seguida por uma diminuição acentuada para um nadir durante a segunda metade da fase escura (figura 3 C . D). Em resposta a supressão de melatonina induzida LAN, no entanto, uma expressão rítmica significativa, mas menos robusto de c-myc persistiu ao longo do período de 24 horas (Figs 3 C E . F).

(A-F ) níveis tumorais de fosfo-AKT

Ser473 (A B), cMyc (C D), e HIF-1α (e F) foram medidos sob LD, 12:12 ou DL, 00:12 + LAN; veja legenda para a Figura 1 para outras condições experimentais. círculos pretos ou vermelhos a cheio representam a média ± SD expressão relativa (derivado da quantificação densitométrica dos imunoblots) de qualquer das pAKT

Ser473, c-myc e HIF-1α em cada ponto de tempo circadiano; N = 3 amostras de tumor representativos em cada ponto de tempo. A expressão relativa de pAKT

Ser473 representa a relação entre pAKT

proteína Ser473 a total (t) proteína AKT; expressão relativa de c-myc e HIF-1α representa a proporção destas proteínas à tubulina e GAPDH, respectivamente. análise Cosinor revelou padrões rítmicos robustos e altamente significativos sob LD, 12:12 condições em analitos tumor; exceto para c-MYC, não há padrões rítmicos diárias significativas foram detectadas em LAN dim (ver resumo Tabela 4). As comparações estatísticas foram incapazes de ser feita entre os pontos de tempo correspondentes entre o LD, 12:12 e grupos LAN desde imunoblots foram realizados para os dois grupos, em ensaios separados. Apenas um único ciclo de 24 horas de imunomanchas foram executados e exibidos, enquanto que a representação densitométrica dos mesmos imunoblots foi exibida duas vezes para ilustrar a continuidade ritmo tal como indicado na legenda da Fig. 1.

regulação circadiana e interrupção de actividade tumoral proliferativa

À luz das conclusões acima referidas, postulamos a ocorrência de alterações circadianas da atividade proliferativa do tumor e conteúdo de DNA correspondente. Descobrimos que tumoral [

3H] timidina em ADN (Fig. 2G), bem como o teor de ADN (Fig. 2H) aumentaram durante a fase de luz pouco depois luzes acesas para atingir um pico duas horas antes de luzes apagadas. Durante a fase de escuro, no entanto, ambos [

3H] timidina e DNA conteúdo diminuíram para um nadir duas horas antes de luzes acesas (Figuras 2 G . H). As oscilações circadiano em [

3H] timidina e conteúdo de DNA sugerem que o número de células de tumor aumentou durante a fase de luz devido ao aumento da atividade proliferativa, enquanto durante o número de células fase escura diminuiu sugerindo que a perda celular por apoptose estava ocorrendo em paralelo com a diminuição de células proliferação. Os nossos resultados são consistentes com estudos anteriores em cancro mamário do rato transplantáveis ​​que mostram que os tamanhos de tumor brutas e as taxas de crescimento na verdade flutuar de forma circadiano ao longo de cada dia do período de crescimento do tumor líquido [30]. Em resposta à LAN, a oscilação diária no teor de ADN e actividade proliferativa foi anulada uma vez que estes parâmetros permaneciam persistentemente elevados ao longo do período de 24 horas (Figura 2 L . H). Em condições circadianos-regulada, o crescimento do tumor aumentou de forma constante ao longo de um período de duas semanas enquanto em condições circadianos-interrompeu a taxa de crescimento aumentou por duas vezes nos controles (Fig. 2?).

regulação melatonina Potencial da