Abstract

Relatório anterior mostrou que epidérmica factor de crescimento (EGF) promove a progressão do tumor. Vários estudos demonstraram que os fatores de crescimento pode induzir a heme oxigenase (HO) -1 expressão, proteger contra lesões celulares e proliferação de células cancerígenas. Neste estudo, nós investigamos o envolvimento dos c-src, NADPH oxidase, espécies reativas de oxigênio (ROS), PI3K /Akt e NF-kB vias de sinalização em HO-1 expressão induzida por EGF em HT-29 células cancerígenas do cólon humano . O tratamento de células HT-29 com EGF causada HO-1 para ser expressa em modos da sua concentração e dependentes do tempo. O tratamento de células HT-29 com AG1478 (um receptor de EGF (EGFR) inibidor), pequeno ARN interferente de EGFR (EGFR siRNA), um mutante negativo dominante de c-Src (c-Src DN), DPI (um inibidor de NADPH-oxidase) , glutationa (um inibidor ROS), LY294002 (um inibidor de PI3K), e um inibido DN Akt induzida por EGF de HO-1. A estimulação das células com EGF provocou um aumento da fosforilação de c-Src na Tyr406 de um modo dependente do tempo. Tratamento de HT-29 células com EGF induzido um aumento da p47

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translocação do citosol para membranas. A produção de ROS induzida por EGF foi inibido pelo DPI. A estimulação das células com EGF resultou num aumento da fosforilação de Akt Ser473 no, que foi inibida por c-Src DN, DPI, e LY 294002. Além disso, o tratamento de células HT-29 com um mutante negativo dominante de IkB (IκBαM) inibiu EGF induzida por HO-1. A estimulação das células com EGF induzido translocação p65 a partir do citosol para núcleos. O tratamento de células HT-29 com EGF induziu um aumento na actividade da luciferase-kB, que foi inibida por um c-Src DN, LY 294002, e um DN Akt. Além disso, a proliferação de células do cancro do cólon induzida pelo EGF foi inibido pelo Sn (IV) protoporfirina-IX (SnPP, um inibidor de HO-1). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a c-Src, vias de NADPH-oxidase, a sinalização de PI3K, AKT e desempenham um papel importante na activação do NF-kB induzida pelo EGF e HO-1 nas células HT-29. Além disso, a sobre-expressão da HO-1 medeia a proliferação de células do cancro do cólon induzida por EGF

Citation:. Lien GS, Wu MS, Bien MY, Chen CH, Lin CH, Chen BC (2014) Fator de Crescimento Epidérmico fator nuclear Estimula -κB Ativação e Heme oxigenase-1 Expression via c-Src, NADPH oxidase, PI3K e Akt em células cancerígenas do cólon humano. PLoS ONE 9 (8): e104891. doi: 10.1371 /journal.pone.0104891

editor: Chuen-Mao Yang, Chang Gung University, Taiwan

Recebido: 25 Março, 2014; Aceito: 29 de junho de 2014; Publicação: 14 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Lien et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão incluídos dentro do papel

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por subsídios (101TMU-WFH-02-1, 102TMU-WFH-01-1, e 103TMU-WFH-02-1) de Taipei Medical University Hospital-Wan fang. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Aproximadamente um milhão de casos de câncer de cólon são diagnosticados anualmente no mundo, e uma tendência de aumento na incidência de câncer de cólon em países asiáticos foi relatado nos últimos anos [1]. Relatórios anteriores indicam que a ingestão de carnes vermelhas e processados ​​está associado a um risco aumentado de cancro colo-rectal, porque a carne vermelha contém aproximadamente 10 vezes mais elevados níveis de heme que a carne branca [2]. heme oxigenase (HO) desempenha um papel vital na homeostase de ferro fisiológico, defesa antioxidante, e proliferação de células cancerígenas [3]. HO catalisa a conversão do heme para a biliverdina, libertando quantidades equimolares de monóxido de carbono, e a indução concomitante de ferro da ferritina-sequestrante [4]. Três isoformas de HO (HO-1, -2, e -3) foram identificados [5]. HO-1 é uma enzima induzível causada por factores de crescimento incluindo factor de crescimento transformante (TGF) e factor de crescimento -β epidérmico (EGF), o que reflecte o principal papel desta enzima na protecção contra lesão oxidativa [6], [7]. Além disso, HO-1 é muitas vezes altamente regulada no cancro do cólon em comparação com o tecido circundante normal, sugerindo que as células cancerosas que expressam fortemente HO desfrutar de uma vantagem de crescimento e fornecer a resistência celular contra espécies reactivas de oxigénio (ROS) terapias anticâncer mediados por [8] – [10 ].

a importância da EGF no desenvolvimento de câncer de cólon foi enfatizado nos últimos anos [11]. Um crescente corpo de evidência sugere que o EGF regula várias funções biológicas tais como a progressão de células de cancro, proliferação celular, e metástase [11]. O receptor de EGF (EGFR) foi mostrado para participar no desenvolvimento do cancro do cólon [11]. EGF se liga ao domínio extracelular do EGFR que activa as vias de sinalização a jusante, incluindo a vias Akt c-Src e fosfatidil-inositol 3-quinase (PI3K) /[12], [13]. Um relatório anterior indicou que a sobre-expressão de HO-1 desempenha um papel protector na atenuação da lesão celular e sobrevivência de células de cancro [6], [7]. No entanto, pouco se sabe sobre como EGF regula a indução de HO-1 expressão da proteína.

A expressão do

HO-1 | gene é regulada principalmente a nível da transcrição, ativando fatores de transcrição, incluindo nuclear fator (NF) -κB, ativando a proteína (AP) -2, eo elemento de calor sensível-choque (HSE) [14], [15]. NF-kB é um factor de transcrição importantes para regular a expressão de HO-1 [16]. Em repouso, a ligação a IκBα NF-kB impede a translocação nuclear de NF-kB e a actividade de transcrição [17]. No entanto, fatores de crescimento induzem ativação IkB quinase (IKK), fosforilação IκBα e degradação IκBα. Este processo libera activa NF-kB, que é depois translocado para o citosol a partir de núcleos, para ligar a região do promotor de HO-1 e induzir

HO-1

expressão de genes [16], [18]. Vários relatórios demonstraram que a activação induzida por EGF de NF-kB ocorre através de várias moléculas de sinalização dependentes de EGFR, incluindo PI3K, proteína quinase C (PKC), e as vias de sinalização de IKK [19]. O nosso estudo anterior revelou que o TGF-β induzida por HO-1 de expressão através da via PI3K /Akt dependente de NF-kB de sinalização [6]. No entanto, pouco se sabe sobre o evento de transdução de sinal; Em particular, o c-Src, da NADPH-oxidase, ROS, e PI3K /Akt vias, que levam à activação de NF-kB e a expressão de HO-1 por estimulação EGF, não estão bem descritos.

várias estudos demonstraram que a c-Src e NADPH-oxidase jogada papéis importantes na indução da expressão dos genes [20], [21]. Um relatório anterior demonstrou que a trombina induzida HO-1 e expressão era dependente da activação do NF-kB-C mediada por Src [20]. Foi recentemente descoberto que a geração de NADPH-oxidase de produção de ROS é uma resposta defensiva por um hospedeiro para a transformação celular e a apoptose [22]. oxidase NADPH é regulada por p47

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que é capaz de suportar ativação de NADPH oxidase [23]. É conhecido que o EGF estimula a atividade da NADPH oxidase para produzir superóxido, e o superóxido gerado é rapidamente dismutadas a H

respostas fisiológicas

2, levando a EGF induzidas-2O [24]. No entanto, há pouca informação disponível sobre o papel da NADPH oxidase na regulação da activação de NF-kB e HO-1 expressão após estimulação EGF em células cancerígenas do cólon humano. Os nossos resultados revelaram que o EGF desencadeamento da c-Src, NADPH-oxidase, ROS, e PI3K /Akt vias de sinalização que conduzem à activação de NF-kB desempenha um papel importante na expressão de HO-1 induzida por EGF em células de cancro de cólon humano do pulmão. Além disso, HO-1 está envolvida na proliferação de células de cancro do cólon induzida por EGF.

Materiais e Métodos

Materiais

EGF foi obtido a partir de Pepro Tech (Londres, Reino Unido). LY 294002, cloreto de diphenyleneiodonium (DPI), glutationa, e 2 ‘, 7’-diacetato dichloroflurorescein (DCF-DA) foram adquiridos a Sigma (St. Louis, MO, EUA). Um mutante negativo dominante (DN) de IκBα (IκBαM) foi adquirido em Clontech (Mountain View, CA, EUA). pGL2-ELAM-Luc (que está sob o controle de uma NF-kB sítio de ligação) e pBK-CMV-Lac Z foram gentilmente cedidas pelo Dr. Wan-Wan Lin (Universidade Nacional de Taiwan, Taipei, Taiwan). A DN da Akt (Akt DN) foi gentilmente cedido pelo Dr. Che-Ming Teng (Universidade Nacional de Taiwan, Taipei, Taiwan). O plasmídeo pcDNA foi fornecida pelo Dr. M.-C. Chen (University Medical Taipei, Taipei, Taiwan). A c-Src DN foi adquirido a partir de Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY, EUA). soro fetal de vitelo (FCS), penicilina /estreptomicina, e Lipofectamina Além disso reagente foram adquiridos a Life Technologies (Gaithersburg, MD, EUA). Sn (IV) protoporfirina-IX (SnPP) foi adquirida de Frontier Scientific (Logan, UT, EUA). Controlar pequeno RNA de interferência (si), EGFR siRNA, e anticorpos específicos para HO-1, c-Src, p47

phox

, Akt1 /2, EGFR, Na

+ /K

+ ATPase, p65, IκBα, e anti-rato e anti-imunoglobulina G de coelho (IgG) peroxidases de rábano -conjugated (HRPs) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, EUA). Akt Ser473 fosforilada no c-Src e fosforilada no Tyr416 foram adquiridas à New England Biolabs (Beverly, MA, EUA). Lamina A /C foi comprado de GeneTex (Ipswich, CA, EUA). AG1478 e kit de ensaio de proliferação de células BrdU foram adquiridos a Merck (Darmstadt, Alemanha). Todos os materiais para electroforese em gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) foram adquiridos de Bio-Rad (Hercules, CA, EUA).

cultura celular

HT29 células de cancro do cólon humano foram obtidos a partir da American Type Culture Collection (Livingstone, MT, EUA), e as células foram mantidas em meio RPMI 1640 contendo 10% de FCS, 100 U /ml de penicilina G, e 100 ug /ml de estreptomicina numa atmosfera humidificada a 37 ° C incubadora. Depois de atingir a confluência, as células foram semeadas em placas de 6 cm de Western blotting e uma reacção em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT-PCR), em placas de 12 poços para a transfecção de células e ensaio de actividade da kB-luciferase, e em placas de 96 poços para a proliferação celular BrdU e ensaios de geração de ROS.

Western blot análise

para determinar expressões de HO-1, c-Src fosforilada no Tyr416, Akt fosforilada no Ser473, c-Src, Akt1 /2, e EGFR em células HT-29, as proteínas foram extraídas, e uma análise de transferência de Western foi realizada como descrito anteriormente [6]. Resumidamente, as células HT-29 foram cultivadas em placas de 6 cm. Depois de atingir a confluência, o meio de crescimento foi removido e substituído por 2 ml de RPMI 1640 sem FCS durante 24 h. As células foram tratadas com o veículo e EGF, ou pré-tratados com inibidores específicos como indicado seguido por EGF. Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes em solução salina tamponada com fosfato gelada (PBS) e solubilizadas em tampão de lise contendo Tris 10 mM (pH 7,0), NaCl 140 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 2 mM (PMSF), 5 mM de ditiotreitol, 0,5% NP-40, 0,05 mM de pepstatina A, leupeptina e 0,2 mM. Amostras de quantidades iguais de proteína (50 ug) foram submetidas a SDS-PAGE, em seguida, transferidos para o fluoreto de polivinilideno (PVDF) da membrana que foram depois incubadas em solução salina Tris-tamponada com 0,1% de Tween-20 (TBST) contendo soro bovino a 5% albumina. As proteínas foram visualizadas por anticorpos primários específicos e, em seguida, incubadas com anticorpos secundários conjugados com HRP. A imunorreactividade foi detectada usando quimioluminescência aumentada, seguindo as instruções do fabricante. Os dados quantitativos foram obtidos usando um densitômetro computação com sistemas de imagens científicas (Eastman Kodak, Rochester, NY, EUA).

extração de RNA e RT-PCR

Para amplificar células de câncer de cólon humano HO- um ARNm, os iniciadores específicos foram sintetizados. Os iniciadores de HO-1 utilizados foram: sentido 5′-CTG AAC TGT TGT TGC CTC TCC-3 ‘e anti-sentido 5′-CAC CCA TACCTG AGT CTA CC-3’. os níveis de ARNm de p-actina foram usadas como um controlo interno. Os iniciadores de p-actina utilizados foram: sentido 5′-GAC TAC CTC AAG ATC TC-3 ‘e anti-sentido 5′-CCA CTG CTG CAT GAA GGT GG-3’. Células HT-29 foram semeadas em placas de 6 cm. Depois de atingir conferência, o meio foi aspirado e substituído por meio basal isento de FBS durante a noite, após o que as células foram estimuladas com EGF para intervalos de tempo diferentes. O RNA total foi purificado utilizando o TRI REAGENT (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, EUA), e uma RT-PCR realizada utilizando um kit de RT-PCR (Epicentre, Madison, WI, EUA), de acordo com as instruções do fabricante, usando 10 ul de ARN total como molde. Quantidades iguais (10 ug de ADNc) de cada um dos produtos de PCR foram amplificados por PCR com a polimerase Taq, em 35 ciclos consistindo em 30 s a 95 ° C, 30 s a 58 ° C e 1 min a 72 ° C. O cDNA amplificado foi corrido em géis de agarose a 2% e visualizado com brometo de etídio. As amostras de RT também foram usadas para gerar produtos de PCR β-actina e a sua quantidade foi usada como um controlo interno.

transfecção e da kB-Luciferase Assay

células HT-29 (2 × 10

5) foram semeadas em placas de 12 poços, e as células foram transfectadas no dia seguinte utilizando o reagente Lipofectamina além disso, contendo 0,5 ug de pGL2-ELAM-Luc e 0,5 ug de pBK-CMV-Lac Z. Após 24 h, o meio foi aspirado e substituído com meio RPMI 1640 fresco isento de FCS, e, em seguida, as células foram estimuladas com EGF (0.3~10 ng /ml) por mais 24 h antes de ser colhido. Para avaliar os efeitos dos inibidores indicados, os medicamentos foram adicionados às células 20 minutos antes da adição de EGF. Para avaliar os efeitos da c-Src DN e DN Akt, as células foram co-transfectadas com actividade pBK-CMV-Lac Z. luciferase pGL2-ELAM-Luc e foi determinada com um sistema de ensaio de luciferase (Promega, Madison, WI, EUA), e foi normalizada com base na expressão de LacZ. O nível de indução da actividade da luciferase foi comparado como uma proporção de células com e sem estimulação.

Análise da p47

phox

translocação

Para detectar p47

phox

translocação, fracções citosólicas e de membrana foram separados como descrito anteriormente [25]. Resumidamente, as células HT-29 foram tratadas com EGF para as concentrações indicadas ou para os vários intervalos de tempo. Após a incubação, as células foram colocadas em gelo, lavadas com PBS, ressuspensas em tampão de homogeneização (Tris-HCl a 20, EGTA 0,5 mM, EDTA 2 mM, DTT 2 mM, PMSF 0,5 mM, e 10 ug /ml de leupeptina (pH 7,5) ) e sonicado. O lisado foi separado em fracções citosólicas e de membrana por centrifugação a 40.000 ×

g

durante 45 min. Os níveis de p47

phox

proteína nas fracções citosólica e de membrana foram determinados através de uma análise de Western blot. α-tubulina e Na

+ /K

+ ATPase foram respectivamente utilizadas como os controles internos das fracções citosólicas e de membrana.

Análise de translocação p65

Para detectar p65 translocação , células HT-29 foram tratadas com EGF para as concentrações indicadas ou para os vários intervalos de tempo. As fracções de proteínas citosólicas e nucleares foram então separados como descrito anteriormente [25]. Resumidamente, as células HT-29 foram lavadas com PBS gelado, e peletizada. Os sedimentos celulares foram ressuspensos em tampão hipotónico (10 mM de HEPES (pH 7,9), KCl 10 mM, DTT 0,5 mM, 10 mM, aprotinina, leupeptina 10 mM, e PMSF a 20 mM) durante 15 min em gelo, e agitada em vórtice durante 10 seg. Os núcleos foram sedimentados por centrifugação a 15.000 ×

g

durante 1 min. Os sobrenadantes contendo as proteínas citosólicas foram recolhidos. Um sedimento contendo núcleos foi ressuspenso em tampão hipertónico (20 mM de HEPES (pH 7,6), glicerol a 25%, MgCl 1,5 mM

2, EDTA 4 mM, DTT 0,05 mM, 10 mM, aprotinina, leupeptina 10 mM, e PMSF 20 mM ) durante 30 min em gelo. Sobrenadantes contendo proteínas nucleares foram recolhidos por centrifugação a 15.000 ×

g Compra de 2 min. Os níveis de proteína de p65 nas fracções citosólicas e nucleares foram determinados por análise de Western blot. α-tubulina e a lamina A /C foram respectivamente utilizado como o citosol e os controlos internos nucleares.

Determinação da produção de ROS

ROS foram determinados como descrito anteriormente [26]. Resumidamente, as células HT-29 foram semeadas em placas de 96 poços em meio RPMI 1640 contendo FCS a 10% durante a noite. No dia seguinte, o meio foi aspirado e substituído com meio RPMI fresco 1640 desprovido de FCS. Após 24 h, as células foram tratadas com o DCF ROS-sensível durante 15 min, e em seguida estimulado com o EGF para concentrações indicadas ou para vários intervalos de tempo. Para ensaiar o efeito de DPI (10 uM), o fármaco foi adicionado às células 20 minutos antes da adição de EGF. A fluorescência foi determinada com um leitor de Varioskan flash de placas de fluorescência (Thermo Electron Corporation, Marietta, OH, EUA) com excitação a 485 nm e emissão a 528 nm.

BrdU proliferação celular ensaio

HT -29 células (7,5 x 10

3 células /poço) foram semeadas em placas de 96 poços em meio RPMI 1640 contendo 10% de FCS. No dia seguinte, o meio foi aspirado e substituído com meio RPMI fresco 1640 desprovido de FCS durante a noite. As células foram pré-tratadas com SnPP (3 uM) durante 20 min, e em seguida, estimulada com EGF (10 ng /ml) por mais 48 h. BrdU foi adicionado às células durante as últimas 2 horas de incubação. Após a remoção do meio de marcação, as células foram fixadas e o ADN foi desnatura. O BrdU incorporada foi marcado com um anticorpo anti-BrdU monoclonal e um anticorpo de cabra anti-ratinho conjugado com peroxidase. Os complexos imunitários foram detectados por a reacção do substrato subsequente e quantificado por medição da absorvância a 450 nm utilizando um leitor de microplacas.

A análise estatística

Os resultados são apresentados como a média ± erro padrão da média ( SEM) a partir de pelo menos três experiências independentes. Uma análise de uma via da variância (ANOVA), seguida por, quando apropriado, de teste de comparações múltiplas de Dunnett foi usado para determinar o significado estatístico da diferença entre os meios. A

p valor de 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

EGF induz HO-1 expressão em células HT-29

Muitos estudos revelaram que HO-1 expressão desempenhar um papel importante na proteção aganist a morte de células de cancro. HT-29 células cancerígenas do cólon humano foram escolhidas para investigar os percursos de sinalização de EGF em HO-1. O tratamento com EGF (1~10 ng /ml) durante 18 h induzidas HO-1 a expressão da proteína numa forma dependente da concentração (Fig. 1A); esta indução também ocorreu de uma maneira dependente do tempo, começando às 8 h e atingindo um máximo a 12~18 h (Fig. 1B). Após 18 h de tratamento com 10 ng /mL de EGF, a proteína HO-1 aumentou em 185 ± 11% (Fig. 1B). Em seguida, determinou-se o EGF pode induzir HO-1 expressão de ARNm. Após o tratamento, a indução de ARNm de HO-1 tinha começado a 2 horas e alcançou um máximo a 4 h após a EGF (10 ng /ml) de tratamento (Fig. 1C). Como mencionado anteriormente, o EGFR é necessário para as respostas de EGF. Para examinar se o EGFR está envolvido em HO-1 expressão induzida por EGF, foi utilizado AG1478. A Figura 1D mostra que o pré-tratamento de células HT-29 com AG4178 (10 uM) inibiu completamente induzida por EGF de HO-1 expressão (

n =

3). Para confirmar adicionalmente o papel do EGFR em HO-1 expressão induzida por EGF, foi utilizado o EGFR siARN. Como mostrado na Fig. 1E, transfecção com o EGFR siRNA (25 nM) também inibiu completamente a expressão de HO-1 induzida por EGF (

N

= 3) (Fig. 1E). Para confirmar os resultados do experimento EGFR siRNA, nós também utilizado EGFR siRNA para suprimir a expressão da proteína EGFR nas células HT-29. Verificou-se que que o EGFR siRNA expressão da proteína EGFR acentuadamente inibida (Fig. 1F). Estes resultados sugerem que o EGFR está envolvido na expressão de HO-1 induzida por EGF em células HT-29.

A, células HT-29 foram incubadas com várias concentrações de EGF durante 18 h, e, em seguida, HO-1 e a-tubulina foram determinados os níveis de proteína. As imunotransferências são representativos de três experiências, que são apresentados como a média ± SEM. *

P

0,05, comparado com o grupo de controlo. B, as células foram incubadas durante vários intervalos de tempo com o EGF (10 ng /ml), e, em seguida, foram determinados de HO-1 e os níveis de proteína alfa-tubulina. As imunotransferências são representativos de três experiências, que são apresentados como a média ± SEM. *

P

0,05, comparado com o grupo de controlo. C, as células foram tratadas durante vários intervalos de tempo com EGF (10 ng /ml). O ARN total foi preparado, e uma RT-PCR foi realizada como descrito em “Materiais e Métodos”. Taces representam os resultados de três experiências independentes. D, as células foram pré-tratadas durante 30 min com 10 uM AG1478 e depois estimuladas com 10 ng /ml de EGF durante mais 18 h. Após a incubação, foram determinados os níveis de proteína alfa-tubulina de HO-1 e. As imunotransferências são representativos de três experiências, que são apresentados como a média ± SEM.

* p

0,05, comparado ao tratamento com EGF. E, as células foram transfectadas transientemente com 25 nM de ARNsi de controlo (CON siRNA) ou 25 nM de ARNsi EGFR durante 24 h e, em seguida, estimulada com EGF (10 ng /mL) durante mais 18 h. Células lisados ​​foram preparados e em seguida coradas imunologicamente com anticorpos para HO-1 ou α-tubulina. As imunotransferências são representativos de três experiências, que são apresentados como a média ± S.E.M.

* p

0,05, comparado ao tratamento com EGF. F, as células foram transfectadas transientemente com 25 nM de ARNsi de controlo (CON siRNA) ou 25 nM de ARNsi EGFR durante 24 h. Os lisados ​​de células inteiras foram preparados e em seguida coradas imunologicamente com anticorpos para o EGFR ou α-tubulina. Traços representam resultados de três experimentos independentes.

c-Src está envolvido em HO-1 expressão induzida por EGF em células HT-29

Para examinar se c-Src, a jusante proteína de EGFR [12], pode desempenhar um papel crucial na induzida por EGF de HO-1 de expressão, utilizou-se um plasmídeo c-Src DN. Como mostrado na Fig. 2A, a transfecção de células HT-29 com a c-Src DN (0,5 ug) inibiu o aumento induzido por EGF na HO-1 por expressão de 91 ± 6% (

N

= 3). Além disso, o nível de proteína c-Src foi altamente expressa em células HT-29 c-Src DN transfectadas com plasmídeo pcDNA em comparação com as células HT-29 transfectadas com plasmídeo (Fig. 2B). Regulação da activação de c-Src ocorre como um resultado da fosforilação de múltiplos locais em resíduos específicos, incluindo Tyr416 [25]. A seguir, examinámos ainda mais c-Src fosforilação em Tyr416 por estimulação por EGF em células HT-29 utilizando o c anti-fosfo-Src-anticorpo na Tyr416. A Figura 2C mostra que o tratamento de células HT-29 com 10 ng /ml de EGF induzido um aumento da fosforilação de c-Src na Tyr416 de um modo dependente do tempo. A fosforilação de c-Src na Tyr416 começou a 0,5 min e foi mantida até 30 min após a estimulação EGF (Fig. 2C, painel superior). O nível de proteína de c-Src não foi afectada pela estimulação EGF (Fig. 2C, painel inferior). Estes resultados sugerem que a activação de c-Src é necessário para HO-1 de expressão induzida por EGF.

A, células HT-29 foram transfectadas transitoriamente com 0,5 ug de pcDNA ou 0,5 ug de um mutante negativo dominante de C- src (c-src DN) durante 24 h. As células foram tratadas com EGF (10 ng /mL) durante mais 18 h. Após a incubação, foram determinados os níveis de proteína alfa-tubulina de HO-1 e. As imunotransferências são representativos de três experiências, que são apresentados como a média ± SEM.

* p

0,05, comparado ao tratamento com EGF. B, as células foram transfectadas transientemente com quer 0,5 ug de pcDNA ou 0,5 ^ g de c-Src DN durante 24 h. Níveis de expressão de proteína alfa-tubulina de c-Src ou foram determinadas por uma análise de Western blot. Traços representam os resultados de três experiências independentes. C, células HT-29 foram incubadas com 10 ng /mL de EGF para 0-30 min. Os lisados ​​celulares foram preparados, e c-Src Tyr416 fosforilação foi determinada através de imunotransf erência utilizando um anticorpo fosfo-c-Src Tyr416. Imunotransfer�cias são representativos de três experimentos com resultados semelhantes.

O envolvimento da NADPH oxidase e ROS no HO-1 expressão induzida por EGF em células HT-29

c-Src pode ativar um número de vias de sinalização, incluindo NADPH-oxidase [27]. Um estudo anterior demonstrou que as células HT-29 expresso predominantemente uma NADPH-oxidase [28]. Para determinar se NADPH-oxidase tem um papel crucial na induzida por EGF de HO-1 expressão, o inibidor de NADPH-oxidase, DPI [29], foi usado. A Figura 3A mostra que a expressão de HO-1 induzida pelo EGF foi inibido pelo DPI (3 e 10 ^ M) de um modo dependente da concentração. Quando as células HT-29 foram tratadas com 10? M de PPP, o EGF-induzida expressão de HO-1 foi inibida em 86 ± 13% (

n =

3) (Fig. 3A). Um estudo anterior demonstrou que a indução de p47

phox

translocação para o citosol a partir de membranas resultou num aumento da actividade da NADPH-oxidase [27]. A seguir tentou determinar se EGF activa da NADPH-oxidase, examinando a translocação de p47

phox

a partir do citosol para a fracção de membrana por meio de análise de mancha de Western. A estimulação das células com 10 ng /mL de EGF para 0-30 min resultou em translocação de p47

phox

a partir da fracção citosólica para a fracção de membrana com início em 3 min, o efeito foi mantido a 10 min, e diminuiu em 30 min (Fig. 3B). Além disso, verificou-se que a incubação de células com EGF (1~10 ng /ml) produziu um aumento dependente da concentração na translocação de p47

phox

a partir da fracção citosólica para a fracção de membrana (Fig. 3C). Um estudo anterior sugeriu que a produção de ROS-gerado da NADPH-oxidase participa na via de sinalização que conduz à indução da expressão de HO-1 por tratamento com um extracto de fumo de cigarro [29]. Para examinar se ROS pode mediar a expressão de HO-1 induzida por EGF, foi utilizada glutationa. Como mostrado na Fig. 3D, o tratamento de células com glutationa (3~10 mM) inibiu marcadamente HO-1 expressão induzida por EGF. Quando as células foram tratadas com glutationa 10 mM, induzida por EGF de HO-1 expressão foi atenuada por 91 ± 6% (

N

= 3). (Fig. 3D). Estes resultados sugerem que a oxidase de NADPH e ROS estão envolvidas na expressão induzida por EGF de HO-1 em células de cancro do cólon humano.

células HT-29 foram pré-tratadas durante 30 min com 3~10 uM DPI (A) e três ~ 10 mM de glutationa (D) e depois estimuladas com 10 ng /ml de EGF. Após uma incubação de 18 horas, foram determinados os níveis de proteína alfa-tubulina de HO-1 e. As imunotransferências são representativos de três experiências, que são apresentados como a média ± SEM.

* p

0,05, comparado ao tratamento com EGF. Células HT-29 foram tratadas com 10 ng /mL de EGF para os intervalos de tempo indicados (B) ou tratadas com diferentes concentrações de EGF (C). As fracções citosólicas e de membrana foram então isoladas, e os níveis de proteína de p47

phox

nas fracções citosólica e de membrana foram determinados através de uma análise de Western blot. Na

+ /K

+ ATPase e α-tubulina foram, respectivamente, usado como a membrana e controles internos citosólicas. traços típicos representam três experimentos com resultados semelhantes.

NADPH oxidase está envolvido na produção de ROS induzida por EGF em células HT-29

Um relatório anterior demonstrou que o EGF induziu um aumento na ROS geração de células HT-29 [30]. Em seguida, nós investigamos o papel da NADPH oxidase na produção de ROS induzida por EGF. Figura 4A e 4B mostram que o tratamento de células HT-29 com EGF induziu um aumento da geração de ROS em modos tempo e dependente da concentração (Fig. 4A, 4B). Após 20 minutos de tratamento com 10 ng /mL de EGF, a produção de ROS tinha aumentado em 62 ± 5% (

N

= 3) (Fig. 4B). Além disso, o pré-tratamento de células com o DPI (10 uM) inibiu marcadamente induzida por EGF geração de ROS por 85 ± 8% (

N

= 3) (Fig. 4C). Estes resultados sugerem que a NADPH oxidase medeia a produção de ROS induzida por EGF em células de HT-29.

HT-29 as células foram incubadas durante vários intervalos de tempo com o EGF (10 ng /mL) (A) ou incubadas com EGF ( foi determinada 1~10 ng /ml) durante 20 min, e em seguida, a produção de ROS. Os dados são representativos de três experiências, que são apresentados como a média ± S.E.M. *

P

0,05, comparado com o grupo de controlo. C, células HT-29 foram pré-tratados durante 30 minutos com 10 uM de DPI e em seguida estimuladas com 10 ng /ml de EGF. Após 20 min de incubação, foi determinada a produção de ROS. Os dados são representativos de três experiências, que são apresentados como a média ± S.E.M.

* p

. 0,05, em comparação com o tratamento EGF

PI3K /Akt está envolvida em HO-1 expressão induzida por EGF em células HT-29

um estudo anterior demonstrou que a via PI3K /Akt desempenha um papel importante na expressão de HO-1 [31]. Para compreender a relação entre a expressão de HO-1 de EGF e sua via PI3K /Akt via de sinalização, o inibidor de PI3K (LY 294002) e um DN Akt, foram usadas. Como mostrado na Figura 5A, o EGF-induzida expressão de HO-1 foi inibida por 10 uM LY 294002 por 85 ± 8% (Fig. 5A). Além disso, a transfecção de células HT-29 com 0,5 ug do Akt DN também inibiu HO-1 expressão induzida por EGF em 78 ± 8% (Fig. 5B). Além disso, o nível de proteína Akt estava altamente expresso em células HT-29 Akt DN transfectadas com plasmídeo pcDNA em comparação com as células HT-29 transfectadas com plasmídeo (Fig. 5C). Estes resultados sugerem que a via PI3K /Akt via de sinalização é necessária para a expressão de HO-1 induzida por EGF. Ser473 resíduo fosforilação de Akt por uma via de sinalização dependente de PI3K provoca a activação enzimática [32]. Para confirmar o importante papel da via PI3K /Akt no HO-1 expressão, nós determinamos Akt Ser473 fosforilação em resposta ao EGF. Tal como mostrado na Figura 5D, o tratamento de células HT-29 com 10 ng /ml de EGF resultou na fosforilação dependente do tempo de Akt Ser473. Akt Ser473 fosforilação atingiu um pico de 5~10 min, e depois havia diminuído em 20 min após o tratamento EGF (Fig. 5D, painel superior). Os níveis de proteína de Akt1 /2 não foram afectados pelo tratamento com o EGF (Fig. 5D, painel inferior).

células HT-29 foram pré-tratados durante 30 minutos com 10 uM LY 294002 (A) ou foram transientemente transfectadas com 0,5 ug de pcDNA ou 0,5 ug de um mutante negativo dominante de Akt (Akt DN) (B) durante 24 h. As células foram então estimuladas com EGF (10 ng /mL) durante mais 18 h. Após a incubação, foram determinados os níveis de proteína alfa-tubulina de HO-1 e. As imunotransferências são representativos de três experiências, que são apresentados como a média ± SEM.

* p

0,05, comparado ao tratamento com EGF. C, as células foram transfectadas transientemente com quer 0,5 ug de pcDNA ou 0,5 ug do Akt DN durante 24 h. Os níveis de expressão de proteínas de Akt ou a-tubulina foram determinados por análise de Western blot. Traços representam os resultados de três experiências independentes. D, células HT-29 foram incubadas com 10 ng /mL de EGF para 0~60 min. Os lisados ​​celulares foram preparados, e Akt Ser473 fosforilação foi determinada através de imunotransf erência utilizando o anticorpo fosfo-Akt Ser473. As imunotransferências são representativos de três experiências com resultados semelhantes.

c-Src, NADPH-oxidase, e mediar PI3K induzida por EGF fosforilação de Akt Ser473 no em células HT-29

Em seguida, nós investigou o papel de c-Src, da NADPH-oxidase, e PI3K em Akt Ser473 fosforilação induzida por EGF. Como mostrado na Fig. 6, a transfecção de células HT-29 com um c-Src DN (0,5 ug) atenuou induzida por EGF de Akt Ser473 fosforilação (Fig. 6A). Nós ainda determinar se oxidase NADPH e PI3K mediar a fosforilação de Akt. Verificou-se que a fosforilação de Akt Ser473 induzida pelo EGF foi também inibida por DPI (10 pM) (Fig. 6B). Do mesmo modo, induzida por EGF phosphohrylation Akt Ser473 foi também inibida por LY294002 (10 pM) (Fig. 6C). Estes resultados sugerem que a activação de c-Src, da NADPH-oxidase, e PI3K ocorre a montante de Akt na via de sinalização induzida por EGF.

células HT-29 foram transfectadas transitoriamente com 0,5 ug de pcDNA ou 0,5 ug de um Como mostrado na Fig.