Abstract
O câncer de pâncreas tem uma taxa de sobrevivência de 5 anos de menos de 4%. Apesar dos avanços na tecnologia de diagnóstico, o câncer de pâncreas continua a ser diagnosticados numa fase tardia e incurável. biomarcadores precisos para o diagnóstico precoce e para prever a resposta ao tratamento são urgentemente necessários. Desde a alteração do metabolismo da glicose é uma das características das células cancerosas, propusemos que tipo de piruvato-quinase M2 (M2PK) e enzimas lactato desidrogenase A (LDHA) poderia representar novos marcadores de diagnóstico e potenciais alvos terapêuticos em câncer pancreático. Em 266 secções de tecido de pâncreas normal, neoplasias císticas do pâncreas, neoplasia intra-epitelial pancreáticas (pancreáticas intraepiteliais) e câncer, avaliamos a expressão de PKM2, LDHA, Ki-67 e CD8 + por imunohistoquímica e correlação desses marcadores com características clínicas e sobrevida do paciente. PKM2 e expressão LDHA também foi avaliada por Western blot em 10 linhas de células de cancro pancreático humano. expressão PKM2 aumentou progressivamente de cisto através PanIN ao câncer, enquanto LDHA foi superexpresso durante todo o processo cancerígeno. Todos, mas uma linha de células mostrou alta expressão de ambas as proteínas. Pacientes com PKM2 forte e expressão LDHA tiveram sobrevivência significativamente pior do que aqueles com PKM2 fraca e /ou expressão LDHA (7,0 meses versus 27,9 meses, respectivamente, p = 0,003, teste logarítmico). A expressão de ambos PKM2 LDHA e correlacionam-se directamente com Ki-67, e inversamente com CD8 + intratumoral contagem de células. PKM2 foi significativamente sobre-expressos em tumores pouco diferenciados e ambos PKM2 e LDHA foram sobre-expressos em tumores maiores. A análise multivariada mostrou que a expressão combinada de PKM2 e LDHA foi um marcador de prognóstico independente para a sobrevivência. Em conclusão, nossos resultados demonstram um padrão de expressão alta de duas importantes enzimas glicolíticas durante a carcinogênese pancreática, com o aumento da expressão em tumores agressivos e um efeito adverso significativo sobre a sobrevivência
Citation:. Mohammad GH, Olde Damink SWM, Malago M , Dhar DK, Pereira SP (2016) piruvato Quinase M2 e lactato desidrogenase a são sobre-expressos no cancro do pâncreas e correlacionam-se com mau resultado. PLoS ONE 11 (3): e0151635. doi: 10.1371 /journal.pone.0151635
Autor: Michael Muders, University Hospital Carl Gustav Carus Dresden, Alemanha |
Recebido: 05 de agosto de 2015; Aceito: 02 de março de 2016; Publicação: 18 de março de 2016
Direitos de autor: © 2016 Mohammad et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Fundo Pancreatic Cancer Research, The Boas Fundação Jason, NIH P01 concessão CA084203 eo Biomedical Centro UCLH /UCL abrangente, que recebe uma parte do financiamento do Departamento de Instituto Nacional de Saúde para Pesquisa em Saúde regime de financiamento (NIHR) Centros de Investigação Biomédica. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de pâncreas é um dos cancros gastrointestinais mais comuns e a quarta causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [1]. A ressecção cirúrgica é a terapia mais eficaz, mas os pacientes são geralmente diagnosticados em estágio avançado, quando a ressecção cirúrgica não é viável, resultando em uma taxa de sobrevivência de cinco anos de menos de 4% [2]. Há poucas outras terapias eficazes, com um único agente, paliativa ou quimioterapia de combinação como a principal opção de tratamento para pacientes com doença avançada [3,4].
glicólise aeróbica é uma característica das células cancerosas, com a produção de lactato, mesmo na presença de grandes quantidades de oxigénio, um fenómeno conhecido como o efeito de Warburg [5-7]. Uma vantagem importante do aumento da glicólise em células tumorais é a produção de energia sem o consumo de oxigénio e glicolíticas intermediários, tais como aminoácidos, nucleótidos, fosfolípidos e triglicéridos, que são utilizados como macromoléculas para a síntese de elementos estruturais de novas células [5, 6,8,9].
piruvato cinase (PK) é uma enzima glicolítica firmemente regulado que catalisa o último passo da glicólise e medeia a transferência de fosfato a partir de fosfoenolpiruvato (PEP) para o difosfato de adenosina (ADP) para produzir piruvato e energia (ATP) [10-12]. PK tem quatro isoenzimas diferentes PKM1, PKM2, PKL e PKR, a expressão do qual depende a resposta metabólica das células. L e M genes codificam isoenzimas PK. O gene L codifica tanto isoenzimas R-PK L e, enquanto o gene M codifica tanto isoenzimas m2 (PKM2) [13-17] M1 e. Durante a tumorigénese, a expressão de isoenzimas específicas de PK, por exemplo PK-M1 no cérebro e PK-G no fígado, desaparece e expressão PKM2 predomina [18]. PKM2 expressão pode oscilar entre a isoforma tetramérica altamente activa e a isoforma dimérica quase inactiva, dependendo da procura de energia celular ou produção de intermediários anabólicos para a proliferação celular. A isoforma de tetramérica PKM2 é predominantemente expressa em células normais, enquanto que a sua isoforma dimérica é normalmente encontrado nas células do tumor, daí o nome de tumor PKM2 [11,14,19].
Outro componente a jusante na via glicolítica é o lactato desidrogenase a (LDHA) enzima, que é uma parte da família da LDH de oxidorredutases 2-hidroxiácido. HDLs são enzimas tetraméricos homo- e hetero composta por duas subunidades principais, A e B, resultando em cinco isoenzimas que catalisam a conversão reversível de piruvato e lactato. LDHA (também conhecido como 5-LDH, LDH-H ou A4) é codificado pelo
-LDH um gene
e predomina no músculo esquelético e no fígado, enquanto LDHB (também conhecido como 1-LDH, LDH-H ou B4) é codificada pelo
gene ldh-b e é encontrado principalmente no coração e no cérebro [20-24]. LDH-C é composta principalmente de X-subunidades e é encontrado em espermatozóides humanos [22,25]. LDHA catalisa a conversão de piruvato em lactato com a regeneração de NAD
+ para continuar a produção de energia pela glicólise [26-29]. Lactato produzido por LDHA é utilizado como um combustível alternativo por células que são adjacentes aos vasos sanguíneos, e é poupada a glicose para as células mais distantes que são hipóxicas.
A sobre-expressão de PKM2 ou LDHA foi reportado nos tecidos de um número de cancros, incluindo colangiocarcinoma, cancro colo-rectal, cancro do pulmão de não pequenas células e cancro pancreático. A sobre-expressão está associado com a iniciação do tumor, progressão e a resistência à quimioterapia [27,30-32]. Em teoria, o perfil de expressão destas enzimas também podem representar marcadores de diagnóstico ou de prognóstico útil do cancro do pâncreas [15,23,33].
células T CD8 + (linfócitos T citotóxicos) são um subconjunto importante dos linfócitos infiltrantes tumorais que desempenham um papel chave na resposta imune anti-tumor. Estudos de imuno-histoquímica têm demonstrado um efeito anti-tumoral de linfócitos infiltrantes CD8 +, com melhores taxas de sobrevivência de pacientes com pancreático, do pulmão, do ovário, colo-rectal, renais e tumores esofágicos [34-39], e uma correlação directa entre o aumento do número de células T CD8 + tumor infiltrating linfócitos (TIL) e apoptose de células tumorais [40,41].
o objetivo do nosso estudo foi avaliar a expressão de PKM2 e LDHA em lesões pré-neoplásicas pancreáticas (cistos e neoplasias intra-epiteliais pancreáticas, PanIN) e cancros e correlacioná-la com o resultado do paciente. Dado que PKM2 LDHA e estão envolvidos em várias vias de sinalização a proliferação de células [42], também foi investigado se a expressão destas enzimas glicolíticas correlacionados com o número de células CD8 + TIL e marcadores de proliferação do tumor (Ki-67).
h2> Materiais e Métodos
Os pacientes
Este estudo incluiu biópsia de pâncreas ou espécimes de ressecção cirúrgica de 266 pacientes; 136 da University College London Hospital NHS Foundation Trust (UCLH) e outros 130 a partir de um tecido microarrays comercialmente disponível (TMA) (AccuMaxArray, ISU ABXIS CO., LTD, EUA, e o Insight Biotechnology Limited, UK). A coorte UCLH consistia de 136 pacientes com adenocarcinoma ductal pancreático confirmado (PDAC) (n = 61), adenocarcinoma ampular (n = 11), lesões císticas pancreáticas (n = 49), pancreatite crónica (n = 11) e de tecido de pâncreas normal ( n = 4). Esses pacientes tinham sido tratados pelo UCLH entre janeiro de 2005 e janeiro de 2010. A base de dados clínicos dos pacientes UCLH foi criado pelo banco de dados CoPath histologia, que incluiu os seguintes parâmetros clínico: sexo, idade no momento do diagnóstico, tipo de amostra (biópsia ou ressecção), tipo de tumor (ampullary ou ductal), resultado (vivo ou morto), a causa da morte, tempo de follow-up, se vivo, presença ou ausência de doença metastática no momento do diagnóstico histológico, se a ressecção foi realizada, doença residual ( estatuto R), a recorrência pós-ressecção, o tempo de pós-ressecção de recorrência (se houver), estágio do câncer, comprometimento de linfonodos, presença de perineural ou invasão linfática, grau de diferenciação do tumor, e se os pacientes receberam quimioterapia (Tabela 1). Todos os dados foram coletados a partir da data do diagnóstico histológico à data da morte ou o fim da coleta de dados em 1 de Fevereiro de 2015. Ética aprovação da comissão foi obtida do Comitê de Ética REC 3 Pesquisa do centro de Londres para realizar imunohistoquímica em amostras de biópsia e ressecção armazenados ligados com um banco de dados clínicos com a necessidade de consentimento dispensada (referência REC 06 /Q0512 /106, data de alteração 30 Julho de 2010). Todas as amostras de pacientes foram tornados anónimos e de-identificados antes da análise.
Tissue microarray
Um segundo conjunto de validação de 130 amostras de tecido foi obtido a partir TMAs pancreático disponível no mercado. Um total de 206 núcleos de tecido de 130 pacientes (83 do sexo masculino, 47 do sexo feminino, média de idade 59, intervalo 32-80 anos) estavam presentes no TMA, que incluiu 63 casos de PDAC em duplicado, 19 pancreáticas intraepiteliais (10 PanIN-1, 7 PanIN-2 e 2 PanIN-3), 10 pancreatite crónica e 38 núcleos de tecidos normais do pâncreas. O diagnóstico histológico de todos os casos foi verificada por meio de hematoxilina e eosina. Os dados clínicos fornecidos com o TMA incluído tamanho do tumor e estágio, grau de diferenciação do tumor, comprometimento dos linfonodos, locais de estado e de tumores metastáticos.
Imunohistoquímica
métodos imuno-histoquímica padrão foram usados para detectar a expressão de PKM2, LDHA, CD8 e Ki-67. Resumidamente, secções embebidas em parafina foram pré-aquecidos em um forno durante 30 minutos a 60 ° C, e, em seguida, deparaffinised em xileno e hidratadas com uma série de etanol graduado (70% -95%). As secções foram submetidas a recuperação de antigénios mediada pelo calor com tampão de citrato (pH 4,0) em um autoclave. A actividade da peroxidase endógena foi inibida por peróxido de hidrogénio a 3% durante 20 minutos, seguida por incubação com 2,5% de soro normal de cavalo a bloquear durante 20 minutos. As secções foram então incubadas com o anticorpo primário durante uma hora à temperatura ambiente para CD8 (anticorpo policlonal de coelho CD8a, Abnova, UK, Cat # PAB11235, 1: 200) e o Ki-67 (policlonal de coelho para o Ki-67, Abcam, Reino Unido, Cat # ab15580, 1: 300), e durante a noite a 4 ° C durante PKM2 (PKM2 monoclonais anti-humano e de rato, ScheBo®Biotech, Giessen, Alemanha, Cat # S-1, 1: 100) e LDHA (LDHA /anticorpo LDHC (C28H7) Rabbit monoclonal, Cell Signaling, Reino Unido, Cat # 3558, 1: 250) em PBS. Após três lavagens com PBS contendo 0,5% de Tween 20, as secções foram incubadas com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpo secundário por 30 minutos. O anticorpo primário foi detectado utilizando o estojo de 3, 3′-diaminobenzidina (DAB) ou 3-amino-9-etil-carbazole (AEC) sistema de detecção. Os cortes foram colocados em hematoxilina durante 3 minutos, em seguida, delicadamente lavado e montado.
imunohistoquímica Duplo
Um kit duplo imunocoloração (Imagem kit dupla marcação, Invitrogen, UK) foi utilizado para co-localização de PKM2 e CD8 ou Ki-67. Resumidamente, foram utilizados dois sistemas de detecção diferentes de enzimas para a coloração dupla sequencial com o uso inicial do sistema de peroxidase de rábano seguido pelo sistema de fosfatase alcalina. As secções foram incubadas com o anticorpo primário anti-PKM2 e anticorpo secundário de HRP, e a visualização foi desenvolvido com o sistema de detecção de DAB. Seguindo este passo, as secções foram lavadas com PBS, incubadas com soro de bloqueio, seguido de anticorpo primário (anti-CD8 ou Ki-67) e o anticorpo secundário de fosfatase alcalina IgG anti-coelho de cabra. A cor foi desenvolvida pelo vermelho rápido, com contra-coloração por hematoxilina.
Avaliação da imuno-histoquímica coloração
A imuno-histoquímica foi avaliada utilizando um microscópio de luz conferência (Axio Scope, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Gottingen, Alemanha). A avaliação das lâminas imunocoradas foi realizada de forma independente por dois observadores, cegos com a informação do paciente e qualquer disparidade entre os observadores foi resolvido usando um microscópio conferência. Uma fórmula de pontuação global foi utilizado para a avaliação semi-quantitativa da expressão PKM2 como descrito anteriormente [43], com a intensidade da coloração teve como: 1, expressão fraca; 2, a expressão moderada; ou 3, expressão forte; o grau de coloração classificada como 1, 33% de células tumorais positivas; 2, 33-67% de células tumorais positivas ou; 3, 67% de células tumorais positivas. As pontuações de intensidade e extensão foram então multiplicado para obter uma única escala de pontuação de 1, 2, 3, 4, 6 e 9. As pontuações de 1-3 foram definidas como coloração fraca (ou negativo), enquanto pontuação 4, 6 e 9 foram consideradas como coloração forte (ou positiva).
O número de CD8 + TIL e Ki-67 células tumorais positivas também foram contadas de forma independente por dois observadores. Inicialmente, toda a lâmina foi examinada a ampliação baixa (x40) para identificar a região com a maior densidade de CD8 intratumoral ou células tumorais Ki-67-positivas e, em seguida, cinco áreas aleatórias dentro daquela região foram contados em alta ampliação (x400). O número médio de CD8 + TIL foi calculada e expressa como contagem por campo de alta potência (HPF). O índice de proliferação celular (PI) foi expressa como uma percentagem do número de núcleos corados positivo para Ki-67 entre 1000 células tumorais usando uma grade padronizada.
As culturas celulares
Nove cancro pancreático humano linhas de células foram adquiridos a partir de RIKEN Bioresource Center (RIKEN BRC, Tsukuba, Japão) e a linha celular BxPC-3 foi adquirido a PerknElmer (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, EUA). PANC-1, PK-1, PK-59, PK-45H, PK45P, KLM-1, NOR-P1 e BxPC-3 foram mantidas em RPMI-1640, MiaPaCa-2 em DMED e KP-4 em meio DMEM /F12 . Todos os meios foram suplementados com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 1% de penicilina /estreptomicina e 2 mM de glutamina (Gibco, Life Technologies, UK). As células foram mantidas numa atmosfera humidificada de 21% de O
2, 5% de CO
2 a 37 ° C e colhidas com tripsina-EDTA.
Western Blot
e PKM2 expressão LDHA foi avaliada em linhas celulares de cancro do pâncreas por Western Blotting. Resumidamente, após a extracção de proteína, concentração de proteína foi medida pelo ácido bicinconínico (BCA) e 15 � ensaio de proteína foi corrida num gel pré-fundido (Novex NuPAGE 4-12% Bis-Tris a 1,0 milímetros, de gel de 10 poços, Invitrogen, EUA) e transferida para um tamanho de poro de 0,45 fluoreto de polivinilideno (PVDF) membrana (Invitrogen, EUA). A membrana foi bloqueada com uma solução de 5% Albumina de Soro Bovino (BSA) e incubada durante a noite a 4 ° C, quer com murganho anti-PKM2 (DF-4, ScheBo®Biotech, Giessen, Alemanha, 1: 1000) ou anticorpo de coelho anti-LDHA (Cell Signaling, Reino Unido, 1: 1000), e, em seguida, incubadas com os anticorpos apropriados de rábano conjugada com peroxidase secundárias (Cell Signaling, Reino Unido, 1: 2000). A reacção anticorpo antigénio foi detectado por quimioluminescência melhorada substrato (Thermo Scientific, EUA). anticorpo anti-actina β (Cell Signaling, UK) foi usado como um controle de carga de proteína.
A análise estatística
software IBM SPSS Statistical (versão 22, SPSS Inc., Chicago, IL, EUA ) foi utilizado para a análise de dados e gráficos. Gráficos de Kaplan-Meier e Log-Rank testes foram utilizados para analisar a sobrevivência e para identificar as diferenças entre os grupos. Uma maneira ANOVA com o teste post-hoc de Bonferroni foi utilizado para a comparação global dos vários grupos, com o U-teste de Mann-Whitney para testes não paramétricos e o teste do qui-quadrado para as diferenças entre dados categóricos. análises de correlação não paramétrica entre duas variáveis contínuas foram realizadas pelo teste de Spearman. Todos os resultados dos testes foram bicaudais, com efeitos resumidas usando intervalos de confiança de 95%. A significância estatística foi estabelecido em p . 0,05
Resultados
A expressão de PKM2 e LDHA no câncer pancreático
Ambos PKM2 e LDHA foram sobre-expressos em células tumorais em comparação com o tecido pancreático normal, . Um padrão de expressão variável de PKM2 foi observada em tecidos tumorais, com a expressão relativamente mais elevada em áreas pouco diferenciadas, no avanço margens de nódulos de tumores e em tumores invasivos (musculares e vasos sanguíneos) (Fig 1A, 1B, 1E e 1F). No geral, a expressão PKM2 foi predominantemente associado com tumores agressivos. expressão preferencial de PKM2 foi observado em células em proliferação binucleadas em nódulos de tumor (Figura 1D). Expressão de PKM2 foi notada em todos os compartimentos da célula, incluindo a membrana celular, citoplasma e /ou núcleo (Fig 1C e 1F). Em contraste, a expressão LDHA foi geralmente elevada em tumores bem como nos tecidos pré-neoplásicas e pancreatite, sem um padrão específico (Fig 2). expressão LDHA foi também detectada na membrana celular e /ou citoplasma e, ocasionalmente, no núcleo.
(A) Área bem diferenciada do tumor mostrando a expressão PKM2 fraco (seta vermelha), com alta expressão em áreas pouco diferenciadas ( cor marrom, seta amarela) (x100 ampliação). (B) Growing margem de nódulos tumorais com forte expressão de PKM2 (seta vermelha) (x100 ampliação). (C) a expressão Membranous de PKM2 (seta vermelha) (ampliação x200). (D) a expressão heterogênea de PKM2 com expressão predominante nas células em proliferação (seta vermelha) (x200 ampliação). (E) a expressão tumor fortemente positiva de PKM2 na invasão vascular (seta vermelha) (ampliação x100). (F) a expressão tumor fortemente positiva de PKM2 com invasão muscular (seta vermelha) (x100 ampliação).
(A) expressão Membranous de LDHA (x200 ampliação). (B) citoplasmática e expressão nuclear (x200 ampliação). (C) a expressão forte no cisto no pâncreas com expressão leve no tecido pancreático (ampliação x50) circundante normal. (D) a expressão Nuclear de LDHA em câncer pancreático (ampliação x100). (E) a expressão forte na lesão PanIN (ampliação x100). . (F) coloração negativa no pâncreas (ampliação x100) normais
expressão similar de PKM2 e LDHA foi observada na coorte UCLH e amostras de TMA, com uma pontuação de coloração de 3 em 64% e 73% dos tumores, respectivamente, para PKM2, e em 76% dos tumores para LDHA em ambos os grupos. O padrão de expressão em linhas celulares de cancro pancreático foi semelhante para ambos PKM2 e LDHA, excepto na linha celular KP4 em que o nível LDHA era mais forte do que PKM2 nível (Figura 3). Em ambos os grupos, as amostras pancreatite também altamente expresso LDHA em comparação com a expressão PKM2 (Figura 4).
A imunocoloração de MiaPaCa-2 com células PKM2 (A) e LDHA (B) é mostrada no painel inferior. Forte coloração citoplasmática e nuclear é observado em células em proliferação
PKM2 foi fortemente expressa por amostras de tecido do cancro do pâncreas e foi significativamente maior do que o normal, pancreatite, cisto no pâncreas e tecidos pancreáticas intraepiteliais (P 0,001).. Expressão de LDHA foi significativamente maior no câncer pancreático do que no pâncreas normal (P 0,001)., Enquanto, não houve diferenças significativas na expressão LDHA entre câncer de pâncreas, PanIN, cistos pancreáticos e pancreatite
Como mostrado na Fig 4, progressivamente mais elevada expressão PKM2 foi observada ao longo da transição para o cancro do pâncreas, com a menor expressão em cistos pancreáticos (19%), intermediário na PanIN (37%) e mais elevada em cancros (68%). PKM2 expressão foi aproximadamente quatro vezes superior em pancreatite (29%) em comparação com o tecido de pâncreas normal. Embora a expressão LDHA foi também significativamente aumentada em cancros em comparação com o tecido de pâncreas normal (p 0,0001, ANOVA), não houve diferenças significativas entre pancreatite crónica, cistos pancreáticos, PanIN e amostras de cancro (67%, 59%, 73% e 76 %, respectivamente).
expressão PKM2 LDHA e em linhas celulares de cancro pancreático
por transferência de Western, de expressão elevada de PKM2 e LDHA foi detectada em 8 e 9 das 10 linhas de células do cancro do pâncreas (Figura 3). O nível de expressão LDHA PKM2 e correspondia, em todas as linhas celulares excepto no KP4 em que o nível PKM2 foi mais fraco do que o nível LDHA. Por imuno-histoquímica, tanto PKM2 e LDHA teve forte expressão citoplasmática e nuclear (Fig 3).
Associação com os parâmetros clínico
A correlação entre PKM2 e expressão LDHA com características clinicopatológicas é mostrada na Tabela 1. houve uma significativa correlação inversa entre a expressão PKM2 e diferenciação do tumor na coorte UCLH, com 83% dos tumores PKM2 positivos sendo menos diferenciado em comparação com 64% dos tumores negativos PKM2 (p = 0,047, teste do qui-quadrado) (dados não mostrados) .
um número significativamente maior de células CD8 + TIL foi encontrada em tumores com PKM2 fraco ou expressão LDHA em comparação com tumores que tinham uma forte expressão (p = 0,0001, p = 0,005, respectivamente, Tabela 1). Além disso, foi observada uma associação significativa entre a proliferação de células tumorais e de expressão de ambos PKM2 e LDHA; o número de núcleos de tumor que expressam o Ki-67 foi mais de duas vezes superior em PKM2 e ldhA tumores que expressam em comparação com tumores negativos (PKM2: 27,8 ± 12,9 versus 12,2 ± 14, p = 0,0001 e ldhA: 25,1 ± 14 vs 12,3 ± 15,1; p = 0,004). Quando coloração pontuação, a contagem de CD8 + TIL eo número de 67 Ki-células positivas foram considerados como variáveis contínuas, foi observada uma correlação inversa significativa entre os escores de coloração e contagem de células CD8 + (PKM2: p 0,001 e LDHA: p = 0,004, Spearman de correlação). A correlação direta significativa foi notada entre os escores de coloração e Ki-67 count (PKM2: p 0,001 e LDHA: p = 0,001, Spearman teste de correlação) (Figuras 5 e 6). Na coorte de TMA, a expressão de PKM2 e LDHA correlacionada com o tamanho do tumor. PKM2 expressão foi observada em 54,5%, 77,8% e 90,9% dos tumores que foram  2,5, 2,6-3,9 e ≥ 4 cm de tamanho, respectivamente. LDHA expressão positiva foi encontrada em 59,1%, 77,8% e 100% em tumores que foram ≤ 2,5, 2,6-3,9 e ≥ 4 cm de tamanho, respectivamente. Não houve diferenças significativas entre a expressão PKM2 ou LDHA e localização do tumor, comprometimento dos linfonodos, T-estágio e estado metastático.
(A) tumores bem diferenciados com expressão PKM2 negativo tinha infiltração forte por linfócitos T CD8 positivos (ampliação de x200). (B) tumores pouco diferenciados fortemente positivos para PKM2 tinha infiltração escassa por CD8 + linfócitos T positivos (x200 ampliação). Houve uma correlação negativa significativa entre CD8 + células positivas e ambos PKM2 (C) (D) e coloração LDHA (E) (F).
(A) Os tumores com expressão PKM2 fortemente positiva teve a maior parte do núcleo corado para Ki-67 (x100 ampliação). (B) Os tumores fracamente positivo para PKM2 teve pouca Ki67 coloração (ampliação x100). (Acampamento; (D) A correlação entre a coloração PKM2 e células positivas Ki-67. (E) (F) Correlação entre coloração LDHA e células positivas Ki-67. Houve uma correlação significativa tanto para PKM2 e LDHA.
Correlação entre a expressão PKM2 e LDHA e sobrevida do paciente
A seguir, analisou se o perfil de PKM2 e LDHA expressão previsto sobrevivência. Os pacientes com tumores conseguir 3 para PKM2 ou expressão LDHA tiveram sobrevivência significativamente pior em comparação com aqueles que fracamente expresso PKM2 e /ou LDHA. Das 72 amostras do cancro do pâncreas (UCLH coorte), 46 (64%) expressaram fortemente PKM2 e estes pacientes tiveram uma sobrevivência média de apenas 8,9 meses, em comparação com 28,9 meses nos 26 (36%) pacientes com fraca expressão tumor PKM2 (negativo) (p = 0,016, teste log-rank, Fig 7). Da mesma forma, 55 (76,4%) pacientes com expressão tumoral positiva LDHA teve uma sobrevida mediana de 10,9 meses, em comparação com 34,5 meses dos (23,6%) pacientes 17 com expressão fraca (negativo) LDHA tumor (p = 0,029, teste log rank, Fig 7). Além disso, quando o perfil de PKM2 e LDHA expressão foi combinada, a sobrevivência dos pacientes com expressão negativa para ambos ou positivo para uma era quatro vezes mais do que aqueles com um status positivo para ambos (27,9 meses versus 7,0 meses, respectivamente, p = 0,003, teste logarítmico). Entre os vários preditores de sobrevida por análise univariada (T-stage; p = 0,006, a diferenciação do tumor; p = 0,003, estado metastático; p = 0,000), por análise de regressão Cox apenas o status /LDHA status de expressão e de diferenciação tumoral combinada PKM2 foram preditores de sobrevivência independentes (p = 0,003, hazard ratio (HR) = 4,96 e p = 0,015, HR = 3,31, respectivamente) (Tabela em S1 Tabela).
Ambos PKM2 (a) e LDHA (B) teve um impacto prognóstico significativo na sobrevida dos pacientes (p = 0,016, 0,029, teste logarítmico, respectivamente) e a expressão combinada para ambos os marcadores estratificada ainda mais os pacientes (C) (p = 0,003, teste logarítmico). Como esperado, os pacientes que se submeteram à ressecção cirúrgica teve uma sobrevida maior do que os pacientes não ressecados.
Além disso, 27 dos 72 pacientes (UCLH coorte) foram submetidos à ressecção cirúrgica para PDAC (n = 16) ou adenocarcinoma ampullary ( n = 11). Aqueles que foram submetidos à ressecção cirúrgica tiveram uma sobrevida significativamente mais longa do que aqueles que não foram submetidos a cirurgia (26,5 vs 7,0 meses, P 0,0001; teste logarítmico). Como esperado, os pacientes com adenocarcinoma ampullary tiveram melhor prognóstico após a cirurgia do que aqueles com PDAC, com 5 dos 11 (45,5%) ampulares pacientes com carcinoma vivo no último contato, em comparação com apenas 1 em 16 (6,3%) pacientes com PDAC (P 0,0001; teste logarítmico)
Discussão
Há evidências de que as células cancerosas se elevou a captação de glicose com um concomitante aumento na produção de lactato através de processos enzima catalítica mediadas sequenciais [44,45]. . PKM2 e LDHA são duas enzimas glicolíticas cruciais que facilitam esses processos para conferir as células cancerosas com uma vantagem de crescimento sobre as células normais. Até à data, PKM2 soro foi identificado como um marcador de diagnóstico e prognóstico com sensibilidade e especificidade comparáveis ao soro CA19-9 marcador no cancro pancreático [46-48]. No entanto, existem poucos dados sobre o padrão de expressão e impacto prognóstico da PKM2 e LDHA em câncer pancreático [32,49,50]. Para o melhor de nosso conhecimento, nosso estudo é o primeiro a avaliar o impacto prognóstico da PKM2 combinados e expressão LDHA na iniciação e progressão do cancro pancreático. Um estudo recente mostrou que a sobre-expressão e fosforilação de ambas estas enzimas no cancro da tiróide em comparação com o bócio benigna [51]. Nossos resultados concordam com os resultados mostrando a sobre-expressão significativa de PKM2 e LDHA no pâncreas em comparação com o tecido pancreático normal.
O início gradual e desenvolvimento de câncer de pâncreas muitas vezes começa com pancreatite, metaplasia ductal, formação de cistos ou PanIN lesões, levando ao câncer de pâncreas. Curiosamente, os nossos resultados demonstram superexpressão de LDHA numa fase muito precoce ao longo da via carcinogênese de pancreatite através de cisto /PanIN ao câncer com maior expressão nos tumores mais agressivos. Em contraste, a expressão PKM2 aumentou progressivamente ao longo da transição para o câncer de pâncreas e foi menor em cistos, intermediário nas lesões pancreáticas intraepiteliais e mais alto em cancros. Embora o mecanismo exacto deste padrão de expressão diferencial permanece por esclarecer, é possível que as lesões pré-neoplásicas adquirem o fenótipo glicolítica através LDHA sobre-expressão e, em seguida, em si LDHA ou outros oncogenes induzir PKM2 sobreexpressão em fases posteriores quando as taxas de proliferação de células de tumor são mais elevados . De facto, demonstrou-se recentemente que o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) induz a transactivação β-catenina e a expressão de c-myc, upregulating LDHA, que por sua vez induz a regulação positiva da expressão PKM2 pela alternância de splicing do gene de M1 a tipo M2 [52]. Estas descobertas podem explicar parcialmente a superexpressão consistente de LDHA durante todo o processo de tumorigênese ea superexpressão progressiva de PKM2 ao longo da via carcinogênese. A expressão e a actividade enzimática de LDHA e PKM2 pode também ser modulada pela fosforilação da tirosina de vários resíduos (Y10 e Y105, respectivamente) pelo factor de tirosina-quinase oncogénica de crescimento de fibroblastos receptor-1 [53]. O padrão de expressão diferencial sugere que PKM2 (ou uma combinação de PKM2 e LDHA) seria uma melhor escolha para discriminar o cancro a partir de lesões pré-neoplásicas em comparação com LDHA sozinho, excepto em pancreatite, onde ambos os marcadores são altamente expressas.
tratamento do câncer de pâncreas é altamente desafiador devido ao diagnóstico tardio e falta de marcadores prognósticos adequados e terapias eficazes. Nossos resultados demonstram que tanto PKM2 ou LDHA são marcadores prognósticos significativos em câncer de pâncreas e a combinação proporciona uma melhor estratificação do resultado. Estes resultados estão em linha com publicações anteriores mostrando um efeito prognóstico significativo de LDHA ou PKM2 em outros tipos de tumores, incluindo carcinoma de células escamosas, colangiocarcinoma e câncer gástrico [43,54,55]. Os mecanismos exactos associados com a sobre-expressão de PKM2 LDHA e que levam a mau prognóstico permanecem obscuros. Muito recentemente, Rajeshkumar et ai (2015) descobriram que o LDHA inibidor de molécula pequena FX11 pode impedir o crescimento do tumor, reduzir a proliferação de células tumorais e induzir a apoptose num modelo de xenoenxerto de ratinho derivadas de doente de cancro pancreático com TP53 mutante, enquanto que os tumores abrigando de tipo selvagem TP53 foram completamente resistentes à FX11 [56].
o câncer de pâncreas é um dos tipos de tumores mais agressivos, com uma sobrevida global muito pobre. Os resultados de nosso estudo mostram claramente sobre-regulação de ambos PKM2 e LDHA no câncer de pâncreas e implicam a expressão elevada destas duas enzimas glicolíticas no desenvolvimento e progressão do câncer de pâncreas através de uma maior proliferação, migração, invasão e angiogênese.