Abstract

Fundo

A existência de células-tronco cancerosas (CSCs) ou câncer de células estaminais-como em uma massa tumoral se acredita ser responsável pela recorrência do tumor devido às suas características de resistência a drogas intrínsecos e extrínsecos. Portanto, morte direccionada de CSCs seria uma estratégia mais recente para a prevenção da recorrência e /ou tratamento de tumor, vencendo a resistência aos medicamentos. Desenvolvemos um novo composto sintético-CDF, que mostrou maior biodisponibilidade nos tecidos animais tais como o pâncreas, e também induziu a inibição do crescimento celular e apoptose, o que foi mediada por inactivação de NF-kB, a COX-2, e VEGF no cancro pancreático ( PC) células.

Metodologia /Principais achados

no estudo atual nós mostramos, pela primeira vez, que a CDF pode inibir significativamente a capacidade de formação de esfera (pancreatospheres) de células de PC compatíveis com aumento da desintegração de pancreatospheres, que foi associada com a atenuação de marcadores CD44 e CSC (EpCAM), especialmente em células PC gemcitabina-resistente (MiaPaCa-2) contendo elevada proporção de CSCs consistente com o aumento de miR-21 e diminuiu o miR-200. Em um modelo de murganho de xenoenxerto de PC humano, tratamento CDF crescimento tumoral significativamente inibido, o que foi associado com a diminuição da actividade de NF-kB de ADN de ligação, a COX-2, e miR-21 de expressão, e o aumento de PTEN e miR-200 expressão em fragmentos de tumor.

Conclusões /Significado

Estes resultados sugerem fortemente que a actividade anti-tumoral de CDF está associada com a inibição da função CSC via sub-regulação de vias de sinalização CSC-associados. Portanto, CDF pode ser útil para a prevenção de recorrência e /ou tratamento de tumor PC com um melhor resultado do tratamento no futuro

citação:. Bao B, Ali S, D Kong, Sarkar SH, Wang Z, Banerjee S, et al. (2011) Anti-Tumor Atividade de um novo composto-CDF é mediada através da regulação miR-21, miR-200, e PTEN no cancro do pâncreas. PLoS ONE 6 (3): e17850. doi: 10.1371 /journal.pone.0017850

editor: Lin Zhang, da Universidade da Pensilvânia, Estados Unidos da América

Recebido: 13 de dezembro de 2010; Aceito: 10 de fevereiro de 2011; Publicação: 09 de março de 2011

Direitos de autor: © 2011 Bao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Nacional de Câncer Institute, NIH bolsas 5R01CA131151, 3R01CA131151-02S1 e 5R01CA132794 (FH Sarkar). Agradecemos Puschelberg e Guido bases para a sua contribuição financeira generosa. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas (PC) é uma das doenças malignas mais letais com pior prognóstico, que está classificada como a quarta principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos [1]. Ao longo das últimas duas décadas, inúmeros esforços têm sido feitos na melhoria doentes sem tratamento e PC sobrevivência, mas o resultado tem sido decepcionante. Este resultado decepcionante é devido a muitos factores, entre os quais

de novo

resistência (intrínseco) e adquiridas (extrínseca) resistência a terapias convencionais (quimioterapia e radioterapia), incluindo a gemcitabina sozinho ou em combinação com outros agentes citotóxicos ou direcionados . Emergindo evidências sugerem que a resistência poderia, de facto, ser devida à existência enriquecida de células tumorais de início, também classificados como células estaminais cancerosas semelhante (CSC) de uma massa de tumor [2] – [6]. Os CSCs têm a capacidade de auto-renovação e o potencial de regenerar em todos os tipos de células diferenciadas que dão origem a populações de células tumorais heterogéneas em uma massa de tumor, o que contribui para a agressividade do tumor [2] – [6]. Assim, a falha para eliminar essas células especiais é considerada como sendo uma das causas subjacentes de mau resultado de tratamento com agentes terapêuticos convencionais, sugerindo que as estratégias terapêuticas mais recentes e novos devem ser desenvolvidos para a morte direccionada de CSCs resistentes aos medicamentos, a fim de erradicar o risco de recorrência do tumor para melhorar a sobrevida de pacientes com diagnóstico de PC.

em busca de romance ainda agentes não tóxicos, a atenção tem sido focada em agentes naturais há vários anos. Um tal agente é curcumina (diferuloylmethane), o qual é derivado a partir da planta Curcuma longa (Linn) cultivadas em tropical Sudeste Asiático [7] – [9]. A curcumina foi mostrado para inibir o crescimento de uma variedade de células tumorais; No entanto, a baixa biodisponibilidade da curcumina limita a sua aplicação na prática clínica. Recentemente, desenvolvemos um novo análogo sintético de curcumina, 3,4-difluoro-benzo-curcumina [que denominou como Difluorinated-curcumina ou em curto CDF [10], [11]], que demonstraram uma maior biodisponibilidade em tecidos pancreáticos, e também o crescimento celular inibido, a actividade de NF-kB, Akt, a COX-2 de ligação a DNA-, e a produção de PGE

2 e o VEGF, e provocou indução do miR-200 e inactivação de miR-21 em células PC [ ,,,0],12]. Uma vez que o miR-200 está relacionado com a aquisição de epitelial para mesenquimal (EMT), que também se acredita estar associado com CSCs ou cancro de células estaminais, como, aqui foram investigados os efeitos de CDF em função CSC.

relatamos aqui, pela primeira vez, que CDF poderia inactivar muitas funções de CSCs incluindo a capacidade de auto-renovação, como demonstrado pela inibição da formação de esfera (pancreatospheres) capacidade de células PC resistentes a drogas, o que foi consistente com a inactivação de CSC biomarcadores, tais como CD44 e EpCAM. Também mostrou actividade anti-tumoral de CDF sozinho e em combinação com gemcitabina, o que foi consistente com a inactivação de miR-21, e consequentemente o aumento da expressão de PTEN, atenuação da actividade de ligação ao ADN da inibição de NF-kB na expressão de COX -2, e ativação da expressão de miR-200 em restos de tumor de um rato modelo de xenotransplante de PC humana, os quais fornecem convencer

in vivo

atividade da CDF que é consistente com

in vitro

resultados.

resultados

linhas celulares ASPC-1 e MiaPaCa-2 e seus clones foram escolhidos para este estudo devido à sua natureza relativamente resistentes. As características CSC dessas linhas celulares utilizando Lin28B marcadores de células estaminais “e Nanog por RT-PCR, e EpCAM e CD44 por Western blot mostrou um aumento no nível de expressão em linhas celulares PC-GTR em comparação com as suas linhas celulares parentais (Figura 1) . Por isso escolhemos-los para testar a nossa hipótese de que a CDF é mais eficaz do que a curcumina, mesmo em linhas de células resistentes e também a sua resistência clones-GTR.

As características dos CSCs foram ainda confirmadas pela expressão da proteína EpCAM e CD44 ( C).

CDF previne fortemente clonogenicidade e invasão de células de PC em comparação com gemcitabina e curcumina

Nós selecionamos a concentração de 20 nmol /L de gemcitabina e 4 mol /L de curcumina ou CDF para conduzir ensaio clonogênica seguir nossa publicação anterior [12]. Os resultados demonstraram que houve uma redução significativa na clonogenicidade de células AsPC-1 e MiaPaCa-2 tratados com curcumina e CDF, mas não com gemcitabina (Figura 2A). No entanto, o tratamento CDF tinha uma redução muito maior e significativo na formação de colónias em comparação com a curcumina. ASPC-1-GTR e células MiaPaCa-2-GTR tiveram uma redução de 80% de clonogenicidade tratamento com CDF, enquanto que foi observado apenas 20-30% de redução de clonogenicidade com gemcitabina ou tratamento curcumina (Figura 2A). No geral, o tratamento CDF mostrou uma redução significativa na clonogenicidade de células PC humanos, sugerindo a superioridade da CDF.

A fluorescência das células invadidas foi lida usando ULTRA leitor de microplacas Multifuncional (TECAN) a excitação comprimentos de onda /emissão de 530 /590 nm. nível basal de expressão ABCG2 que mostra a expressão relativamente mais elevada em linhas de células resistentes a fármacos (C).

CDF ou curcumina tratamento diminuiu a migração celular e invasão PC. Os resultados mostraram que 4 umol /L de curcumina tinha uma inibição mínima da invasão Considerando que a concentração semelhante de CDF mostrou inibição significativa da invasão (Figura 2B). O nível basal de expressão ABCG2 foi encontrado em linhas celulares parentais (

de novo

droga células resistentes); No entanto, o nível de expressão de ABCG2 foi ainda aumentada em droga resistentes (resistentes a drogas adquirida), linhas de células (Figura 2C).

CDF viabilidade inibida de células PC humanas mais do que a curcumina e gemcitabina, tal como avaliado por ensaio de MTT

Inicialmente ensaio de MTT foi realizado para examinar o efeito de diferentes concentrações de gemcitabina (1 a 50 nmol /L), e curcumina ou CDF (2-6 mol /L) sobre a sobrevivência de células após 72 horas de tratamento (dados não mostrando). Subsequentemente, 4 umol /L de CDF ou a curcumina, e 20 nmol /L de gemcitabina foram usadas para tratar tanto individualmente como em combinação com gemcitabina durante 72 h. Os resultados mostraram que o tratamento CDF em combinação com gemcitabina causou uma redução notável da sobrevivência das células, em todas as quatro linhas celulares em comparação com a curcumina e tratamento de combinação gemcitabina (Figura 3). Além disso, a análise do tratamento de combinação de droga mostrou que o índice de combinação após o tratamento com CDF em combinação com gemcitabina foi inferior a 1.00 (Figura 3), sugerindo que o efeito sinérgico da combinação de CDF. Em contraste, o índice de combinação com gemcitabina e curcumina foi mais do que 1.00 (Figura 3), mostrando efeito sinérgico não. No geral, estes resultados sugerem que CDF causou uma redução muito mais significativo da sobrevivência celular em células PC, em comparação com gemcitabina /curcumina isoladamente ou suas combinações em comparação com CDF e combinação gemcitabina.

ensaio de MTT foi realizado em todos os quatro células linhas após 72 horas de tratamento com CDF, curcumina, ou a sua combinação com gemcitabina. controle sem tratamento foi atribuído um valor de 100%. O valor p mostrada representa comparações entre monoterapia e suas combinações, utilizando o teste t pareado. O Índice de combinação (CI) 1 para a combinação CDF e gemcitabina indica sinergismo

CDF notavelmente aumentado desintegração pancreatosphere de células PC

Para examinar o efeito dos tratamentos sobre a esfera formando. capacidade de células PC (pancreatosphere) e de desintegração pancreatospheres, realizamos ensaio de desintegração esfera durante 10 dias para gerar a formação de pancreatospheres, seguidos por 5 dias de tratamento com fármaco. Os resultados mostram que houve um aumento notável da esfera desintegração por curcumina e tratamento CDF, não por tratamento gemcitabina (Figura 4). No entanto, observou-se o maior efeito sobre a desintegração em resposta ao tratamento CDF (Figura 4), sugerindo uma vez mais que CDF é muito mais superior na inibição das funções das células-tronco cancerosas semelhante.

Os valores de P foram calculados pela emparelhado

t

teste.

CDF inibido pancreatospheres formação em células PC

Para examinar o efeito das drogas sobre CSC capacidade de auto-renovação em células PC, realizamos ensaio de formação de esfera, durante 1 semana e quatro semanas (Figura 5A e B). Os resultados indicaram que CDF em combinação com gemcitabina a formação pancreatospheres completamente eliminados após quatro semanas de tratamento em comparação com gemcitabina e combinação curcumina em células PC, mesmo em células PC gemcitabina-resistente, sugerindo que CDF pode fazer com que os pancreatospheres mais sensível a gemcitabina do que a curcumina tratamento, e poderia ser útil para a morte direccionada de CCC. A Figura 5C mostra o efeito de diferentes concentrações de gemcitabina e CDF em 2

ND passagem de pancreatospheres em pancreatospheres primárias pré-tratada de células AsPC-1. tratamento CDF significativamente inibida 2

ND passagem de pancreatospheres de uma forma dependente da dose. Além disso, as células CDF pré-tratados exibiram um efeito maior do que as células pré-tratadas não-CDF.

Foi observada uma redução significativa na pancreatospheres em células tratadas com CDF mostrado por asterisco

CDF diminuiu CD44 e EpCAM expressão em pancreatospheres de células PC

Foi examinado o efeito de drogas sobre biomarcadores CSC, CD44 e EpCAM em pancreatospheres de células-GTR ASPC-1 ASPC-1 e por microscopia confocal (Figura 6). Os resultados indicam que a diminuição do CDF CD44 e EpCAM expressão em pancreatospheres, sugerindo que o efeito inibidor sobre a formação de CDF pancreatosphere pode estar associada com a inibição da expressão de CD44 e de EpCAM.

Expressão em pancreatospheres de AsPC-1 e AsPC- células 1-GTR foi avaliada por microscopia confocal (Ampliação X250).

CDF em combinação com gemcitabina inibiu o crescimento do tumor pancreático in vivo muito mais do que combinação de curcumina

Temos usado a subcutânea modelo de tumor de xenoenxerto de onde o tumor foi induzido por células de MiaPaCa-2 em ratinhos SCID CB17-. CDF tratamento em combinação com gemcitabina inibiu significativamente o crescimento do tumor em tumores MiaPaCa-2 muito mais do que a curcumina e combinação gemcitabina (Figura 7A), bem como em comparação com controlos não tratados quer ou aqueles tratados com um único medicamento. Os ratinhos não mostraram nenhuma perda de peso durante o período de tratamento (30 dias), o que sugere que estes tratamento não teve grandes efeitos adversos em animais.

A actividade anti-tumoral e alterações no peso do tumor de cada grupo de animais ( UMA). A seta indica o dia a partir do tratamento. actividade de tecidos tumorais de ligação do ADN de NF-kB; e estudo de competição de controlo de NF-kB não marcado com oligonucleótido de NF-kB (B). análise de manchas Western de COX-2, PTEN e expressão β-actina em fragmentos de tumor (C); miR-21, o miR-200b e 200c-miR expressão em restos de tumor conforme medido pelo tempo real de RT-PCR (D). Os valores de P foram calculados pelo

t

pareado.

CDF com gemcitabina diminuiu significativamente NF-kB Ativação

in vivo

NF- activação kB foi determinada na CDF ou a curcumina, e /ou gemcitabina tratada restos de tumor derivado de MiaPaCa-2 células de tumores induzidos, como mostrado acima. CDF e curcumina como agente único regulada activação de NF-kB enquanto gemcitabina activado nível de NF-kB, que foi revogada em tratamento combinado com CDF. O tratamento de combinação de CDF com gemcitabina mostrou uma diminuição significativa nos níveis de NF-kB em comparação com a curcumina e tratamento gemcitabina (Figura 7B), sugerindo que a inactivação de NF-kB pode ser um dos mecanismos moleculares pelos quais CDF provoca o seu anti-tumoral atividade contra tumores PC.

efeitos CDF sobre a expressão da proteína

in vivo

A COX-2, PTEN, e expressão β-actina foi determinada por Western blot. Uma regulação negativa significativa na expressão de COX-2 foi observada tanto na combinação, mas o efeito foi mais pronunciado no grupo de combinação de CDF. A expressão de fosfatase e tensão homólogo (PTEN), um gene supressor do tumor verificou-se ser reduzida em células de MiaPaCa-2; No entanto, a expressão de PTEN foi regulado para cima quando tratados com CDF (Figura 7C). Estes resultados sugerem que CDF é muito mais eficaz do que a curcumina. Desde PTEN é um alvo conhecido de miR-21, o que tem sido relatado para ser regulada para cima no PC [13] – [15], avaliou-se os níveis de expressão de miR-21 em restos de tumor, como mostrado abaixo

a modulação da expressão de miR-21 e miR-200 da família

in vivo

Foram determinados os níveis de miR-21, miR-200b e miR-200c expressão em MiaPaCa-2 tumores de tempo real de RT-PCR. A sobre-expressão de miR-21 foi observada em MiaPaCa-2 tumores enquanto que encontramos uma redução significativa na expressão de miR-21 em tumores tratados com quer isoladamente ou em combinação com CDF e gemcitabina (Figura 7D) CDF. Determinou-se ainda mais os níveis de miARN-200b e 200c-miR de expressão em tecidos de tumor, que são conhecidos os reguladores de EMT e que se verificou serem significativamente baixa em células de MiaPaCa-2 (Figura 7D). Em contraste, verificou-se que o tratamento do CDF com ou sem combinação gemcitabina apresentaram uma expressão aumentada de ambos miR-200b, e miR-200 ° C, mas o efeito com a curcumina ou sua combinação foi mínima, sugerindo a superioridade de CDF para suprimir a expressão de miR -21, resultando na re-expressão de PTEN, e re-expressão de miR-200 que poderia ser responsável pela inversão do fenótipo de EMT em células tratadas com CDF. No geral, estes resultados sugerem que as características fenotípicas de MiaPaCa-2 Os tumores são consistentes com a população enriquecida de CSCs e características EMT, e estas células resistentes a drogas poderia ser mortas, quer por CDF sozinho ou em combinação com gemcitabina.

Pancreatospheres grande crescimento do tumor

in vivo

em condições experimentais tradicionais, que normalmente injectar um milhão de células para avaliar o crescimento do tumor; No entanto, para investigar o maior potencial de crescimento do tumor por pancreatospheres, injectámos apenas 5,000 células em ratos como um estudo de prova do conceito. O peso do tumor foi notavelmente aumentada medida que os dias progrediram (Figura 8A). O nível de miR-21 foi aumentada entre tumores implantados com um milhão de células parentais em comparação com pancreatospheres (Figura 8B). O animal foi sacrificado ao fim de 30 dias por causa da carga tumoral, e tumores bruta são apresentados na Figura 8C indicando tumores maiores, bem como metástases nos linfonodos loco-regional, enquanto os tumores derivados de células parentais não mostraram qualquer metástase ao longo de um período de 30 dias. As células derivadas de tumor mostrou uma inibição significativa de pancreatospheres quando tratados com CDF (Figura 8D). No geral, estes resultados sugerem que os CSCs (pancreatospheres) pode ser crescido em murganhos CDF e poderia ser útil para a morte destas células resistentes à droga (Figura. 8).

(A). 5.000 pancreatospheres foram inoculados em ratinhos utilizando Matrigel 1:01, crescimento tumoral progressivo ao longo de um período de 30 dias. aumento moderado na expressão do miR-21, tal como medido pelo tempo real de RT-PCR foi observada em tumores derivados de pancreatospheres em comparação com os tumores derivados de células parental através da injecção de um milhão de células e do tumor foi avaliada ao longo do mesmo período de tempo (B) . Fotografias que mostram o crescimento do tumor, seta aponta para tumor e asterisco (*) refere-se a loco-regional metástase ganglionar ao passo que nós não encontramos nenhuma metástase, quando um milhão de células parentais foram injetados (C). células tumorais recolhidas a partir dos tumores derivados de pancreatospheres foram tratados com CDF mostrou inibição significativa na formação de pancreatospheres (D).

Discussão

Neste estudo, demonstrámos que uma análogo sintético da curcumina, CDF, é significativamente mais eficaz em comparação com curcumina na morte de células gemcitabina resistente ao cancro do pâncreas (PC), que consiste alta proporção de células com células-tronco cancerosas (CSCs) ou câncer características de células estaminais-like. A inibição do crescimento celular pode ser em parte devido a uma melhor absorção celular, e a retenção de inactivação metabólica reduzida de CDF por células PC, que é consistente com os nossos resultados publicados sobre os dados farmacocinéticos celulares e animais [10], [11]. Nossos relatórios anteriores indicam que CDF inibe a atividade da COX-2 NF-kB e em células PC

in vitro

[12]. Aqui nós confirmar estas observações

in vivo

usando um mouse modelo de xenotransplante. Assim, a morte de células PC gemcitabina-resistentes por CDF está associada com a inactivação da COX-2 via de sinalização de NF-kB e que é muito importante porque estas vias são conhecidos por contribuir para a resistência aos medicamentos de células PC para agentes quimioterapêuticos [16] – [18].

CSCs compreende apenas uma proporção muito pequena de células em uma massa tumoral e possuir a capacidade de se auto-renovar e dar origem a células tumorais diferenciadas [3] – [5], [19] . A teoria CSC tem implicações clínicas fundamentais, especialmente porque CSC foi identificada em muitos tecidos tumorais malignas incluindo cânceres de pâncreas e considerados altamente resistente à terapia quimio-radiação do que células-filhas diferenciadas [3] – [5], [20]; No entanto, os CSCs isoladas a partir de tumores humanos são geralmente insuficientes para mais estudos mecanicistas. A existência de CSCs fornece uma explicação para a observação clínica de que a regressão do tumor por si só não pode estar correlacionado com a sobrevivência do paciente [21] por causa da recorrência de tumores, que é em parte devido à presença de CCC. Portanto, tendo como alvo as vias de auto-renovação e a matança de CSCs podem fornecer abordagem mais específica para a eliminação de células que são a causa da recorrência do tumor. Um desafio potencial a este respeito é o desenvolvimento de terapias que afetam seletivamente CSCs, poupando as células estaminais normais que podem contar com mecanismos semelhantes de auto-renovação. Neste estudo, demonstrámos que CDF não só inibem o crescimento celular de células PC, mas também inibir a CSC capacidade de auto-renovação, avaliada pela esfera (formação pancreatospheres) ensaios. Portanto, CDF pode ter um maior potencial para inibir o crescimento do cancro, conforme documentado pelo nosso modelo de murganho de xenoenxerto de células PC resistentes gemcitabina, que parece ser mediado através da inibição da capacidade de auto-renovação CSC.

provas emergentes sugerem o papel de microARN (miARN) em muitos processos biológicos [22] – [25]. Entre muitos miARNs, miR-21, geralmente considerado como um oncogene, é sobre-expressa em muitos tumores sólidos, incluindo PC e tem sido relatada a ser associado com a progressão do tumor, a sobrevivência pobre e resistência às drogas [13], [14], [26 ], [27]. No nosso relatório anterior, que têm demonstrado que a expressão de miR-21 é sobre-regulada em células PC gemcitabina-resistentes e que a sua expressão pode ser significativamente regulada negativamente por tratamento CDF

In vitro

[12]. O aumento da expressão de miR-21 é conhecida por estar associada com a inactivação de PTEN, um gene supressor de tumor saber, resultando na activação da via de sinalização da via PI3K /Akt /mTOR, que conduz ao crescimento do tumor agressivo [15], [28]. Neste estudo, confirmou-se que o tratamento CDF poderiam resulta na sub-regulação de miR-21, resultando na sobre-regulação de PTEN

In vivo

, sugerindo que a actividade anti-tumoral de CDF está associada com a sobre-regulação de PTEN resultante da inactivação de miR-21 de expressão.

em contraste com miR-21, o miR-200 família é conhecido como supressor de tumores e que são geralmente regulada para baixo em alguns tumores, incluindo PC e a perda de expressão da família de miR-200 contribuem para a aquisição do fenótipo EMT e resistência aos medicamentos. A sub-regulação de miR-200 pela técnica siARN tem sido mostrado para ser associada com o fenótipo de EMT enquanto re-expressão de miR-200 pode resultar na reversão do fenótipo de EMT [29], [30]. Em nossa publicação anterior [12], que demonstraram que o tratamento CDF poderia voltar a expressar miR-200 em células PC. Aqui mostramos, pela primeira vez, que CDF pode-se regular o miR-200b e 200c-miR em restos de tumor in

in vivo

, consistente com significativamente maior de inibição do crescimento do tumor no modelo de murganho de xenoenxerto quando CDF estava utilizado em combinação com gemcitabina. Estes resultados sugerem que a actividade anti-tumoral de CDF é mediada através de re-expressão de miR-200, que pode, potencialmente, resulta na reversão do fenótipo de EMT e poderá também levar a superar a resistência aos medicamentos no PC.

Em conclusão , CDF mostraram efeito inibidor do crescimento muito mais pronunciada, inibiu CSC auto-renovação consistente com a inactivação de biomarcadores CSC (CD44 e EpCAM) em células PC especialmente em células PC gemcitabina resistente em comparação com a curcumina. No modelo de murganho de xenoenxerto de tumores humanos de PC induzidas por células MiaPaCa-2, CDF exibe actividade anti-tumoral através da regulação da COX-2, PTEN, miR-21, o miR-200, e de NF-kB

In vivo

. Estes resultados sugerem fortemente que a CDF pode ser um novo agente para o tratamento de PC em PC geral, mas gemcitabina resistentes, em particular, atenuando o comportamento dos CSCs.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. Qualquer animal encontrado pouco saudável ou doente foram prontamente sacrificados. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal do Comitê Animal Care Wayne State University Usuários institucionais (número de autorização: A-10-03-08).

cultura de células, medicamentos e reagentes

linhas de células de cancro pancreático humano AsPC-1, e MiaPaCa-2 foram adquiridos a partir de ATCC (Manassas, VA). Estas duas linhas de células AsPC-1 e MiaPaCa-2 foram expostas a 200 nmol /L de gencitabina e 5 umol /L de Tarceva (erlotinib) cada duas semanas durante cerca de 6 meses para criar gemcitabina e Tarceva (GTR) linhas celulares resistentes, denominado como AsPC-1-GTR e MiaPaCa-2-GTR, respectivamente. Como resultado, AsPC-1, AsPC-1-GTR, MiaPaCa-2 e MiaPaCa-2-GTR foram escolhidos para este estudo com base em suas sensibilidades diferenciais a gemcitabina. Todas as linhas celulares foram autenticados (Genomics Centro de Tecnologia Aplicada da Wayne State University) em 13 de março de 2009 e estas células autenticados foram congelados para uso posterior. O método utilizado para o teste foi de curta repetição em tandem de perfis utilizando o Sistema PowerPlex 16 da Promega. A gemcitabina e a curcumina foram adquiridos a partir de Eli Lilly (Indianapolis, IN) e Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), respectivamente. CDF foi sintetizado tal como descrito na nossa publicação anterior [10], [11]. A gemcitabina foi dissolvido em água, ao passo que a curcumina e CDF foram dissolvidos em DMSO com uma concentração final de 0,1% de DMSO em meio.

Anticorpos

Anticorpos contra ABCG2, PTEN e foram adquiridos a partir de Santa Cruz ( Santa Cruz, CA). Anticorpo para COX-2 e β-actina foi adquirida da Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI), e Sigma Chemicals (St. Louis, MO).

clonogênica ensaio

ensaio foi realizado clonogênica para examinar o efeito da droga sobre o crescimento celular em células PC, tal como descrito anteriormente [12]. 5 × 10

4 células foram plaqueadas numa placa de seis poços. Após 72 h de exposição a 20 nmol /L de gemcitabina, 4 umol /L de CDF ou curcumina, as células foram tripsinizadas, e 1.000 células viáveis ​​foram plaqueadas em individuais de 100 mm pratos Petri. As células foram então incubadas durante 10 a 12 dias a 37 ° C em 5% de CO

2/5% de ó

2/90% N

2 incubadora. As colónias foram coradas com violeta de cristal a 2% e contadas.

Invasão ensaio

A actividade invasora de células foi testada usando BD BioCoat invasão tumoral Sistema de Ensaio (BD Biosciences, Bedford, MA) de acordo com a o protocolo do fabricante, conforme descrito anteriormente [31]. Resumidamente 5 × 10

4 células foram semeadas com meio isento de soro suplementado com a curcumina ou CDF para dentro da câmara superior e poços de fundo foram cheios com meio completo no sistema. A, a fluorescência foi lida usando Microplate Reader (TECAN) a 530/590 nm e foram fotografados.

A sobrevivência das células de ensaio

ensaio de MTT foi realizado utilizando AsPC-1, AsPC-1-GTR, MiaPaCa-2, e MiaPaCa-2-GTR como descrito anteriormente [12], após 72 h de tratamento. índice de combinação e isobolograma para o tratamento de combinação também foram calculados e representados graficamente utilizando o software CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, Reino Unido) para determinar a sinergia com base no método de Chou e Talalay [32].

Esfera formação de ensaio /desintegração

suspensões de células individuais de células foram semeadas em poços de ultra baixa aderentes da placa de 6 poços a 1000 células /poço em meio de formação de esfera [33]. Após 7 dias, as esferas denominado como “pancreatospheres” foram recolhidos por centrifugação e contadas [33]. Para o ensaio de desintegração esfera, 1000 células /poço foram incubados durante 10 dias, a seguir a 5 dias de tratamento com droga, que analisou o efeito do tratamento com fármaco na desintegração de pancreatospheres como descrito anteriormente [33]. Os pancreatospheres foram recolhidos por centrifugação e contadas sob um microscópio.

A microscopia confocal

suspensões de células individuais de células AsPC-1 e AsPC-1-GTR foram plaqueadas utilizando poços aderentes ultra baixa de 6- bem em placas a 3000 células /poço em meio de formação de esfera. Após 7 dias de tratamento, os pancreatospheres foram recolhidas por centrifugação, lavadas com 1xPBS, e fixadas com 3,7% parformaldehyde. anticorpos de CD44 e EpCAM foram ensaio utilizado para a imunocoloração, como anteriormente descrito [29]. Os pancreatospheres CD44 ou EpCAM-rotulados foram fotografados por microscopia confocal (Leica TCS SP5) usando software LAS AF 1.2.0 Construir 4316.

A extração de proteínas e análise de Western blot

As proteínas foram extraídas de todos quatro linhas de células e também a partir de tecidos tumorais de origem animal, como descrito anteriormente [12]. nível relativo de ABCG2 foi avaliado para todas as quatro linhas celulares. Os efeitos sobre a COX-2, PTEN e expressão β-actina foram avaliadas em tecidos de tumor por análise de Western blot. como descrito anteriormente [12].

Experimentação Animal

O protocolo animal foi aprovado pelo Comité de animal Investigation, Wayne State University, Detroit, MI. camundongos fêmeas CB17 SCID 4 semanas de idade foram adquiridos a Taconic Farms (Germantown, NY) e Laboratório de Dieta fed 5021 (Purina Mills, Inc., Richmond, IN). Pequenos fragmentos do xenotransplante MiaPaCa-2 foram implantadas subcutaneamente e bilateralmente em ratos para os ensaios fármaco-eficácia. Uma vez que os ratinhos desenvolveram tumores palpáveis, em que foram seleccionados aleatoriamente nos seguintes grupos de tratamento (n = 5 /grupo): (1) controlo não tratado; (2) CDF (5 mg /rato /dia), intragástrica uma vez por dia durante 12 dias; (3) curcumina (5 mg /rato /dia), intragástrica uma vez por dia durante 12 dias; (4) gemcitabina (1 mg /ratinho /dia), por via intravenosa a cada terceiro dia para um total de três doses; (5) CDF e gemcitabina usando as doses indicadas acima; (6) curcumina e gemcitabina usando as doses conforme acima indicado. As medições do tumor e as variações do peso do tecido foram realizados e foi armazenado a -70 ° C durante a extracção de ARN e proteína.

Mobilidade electroforética tecla Shift Assay (EMSA) de ensaio para avaliar a actividade de ligação a ADN de NF-kB

proteínas nucleares foram preparados a partir de tecido de tumores utilizando um homogeneizador Dounce com 400 ul de tampão de lise frio de gelo extraídos como descrito anteriormente [34]. EMSA foi realizada utilizando o Sistema Odyssey Infrared Imagens com NF-kB IRDye marcado oligonucleotídeo da LI-COR, Inc. (Lincoln, NE). Dez ug de extracto de proteína nuclear foi usado como descrito anteriormente [34]. O estudo de competição controle de NF-kB foi realizado utilizando oligonucleótido não marcado consenso NF-kB. As amostras foram carregadas e correr a 30 mA durante 1 hora. O gel foi digitalizado utilizando Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR, Inc.).

TaqMan miRNA Real-Time-transcriptase reversa Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

Para determinar a expressão de miARN (miARN-200b, miR-200c, e miR-21) em MiaPaCa-2 tumores, que utilizado kit TaqMan MicroRNA Ensaio (Applied Biosystems) seguindo o protocolo do fabricante. 5 ng de RNA total foi transcrito de forma reversa e as reacções de PCR em tempo real foram realizados como descrito anteriormente [30], usando o Smart Cycler II (Cepheid).