Abstract

Objectivo

Neste estudo, nós exploramos o uso de alta intensidade mecânica ultra-som focalizado (M-HIFU) como uma terapia neo-adjuvante antes da ressecção cirúrgica do tumor primário . Nós também investigou o papel do transdutor de sinal e ativador de transcrição 3 (STAT3) em M-HIFU suscitou resposta imune anti-tumoral utilizando um modelo de tumor de transplante de câncer de próstata.

Métodos

RM- 9, uma linha celular de cancro da próstata de rato com STAT3 constitutivamente activada, foi inoculada subcutaneamente em ratinhos C57BL /6J. Os ratinhos portadores de tumor (com um diâmetro máximo de tumor 5~6 mm) foram tratadas por M-HIFU ou exposição sham dois dias antes da ressecção cirúrgica do tumor primário. Após a recuperação, se nenhuma recorrência do tumor foi observada em 30 dias, foi realizado o novo estímulo tumoral. Foram avaliados o crescimento da resposta imune tumor retomou, a taxa de sobrevivência e anti-tumor do animal.

Resultados

No recorrência de tumores e metástases à distância foram observadas em ambos os grupos de tratamento que empregam M-HIFU + cirurgia e cirurgia sozinha. No entanto, em comparação com a cirurgia por si só, H-HIFU combinados com cirurgia foram encontrados para inibir significativamente o crescimento de tumores reexpostos, regular negativamente a actividade da STAT3 intra-tumorais, aumentar as células T citotóxicas no baço e drenagem tumorais gânglios linfáticos (TDLNs), e melhorar a sobrevivência do hospedeiro. Além disso, M-HIFU combinada com cirurgia foi encontrada para diminuir significativamente o nível de imunossupressão com concomitante aumento do número e atividades das células dendríticas, em comparação com a cirurgia sozinha.

Conclusão

Nossos resultados demonstram que M -HIFU pode inibir atividades STAT3, e quando combinado sinergicamente com a cirurgia, pode fornecer uma nova e promissora estratégia para o tratamento de cancros da próstata

Citation:. Huang X, Yuan F, Liang M, Lo HW, Shinohara ML , Robertson C, et ai. (2012) M-HIFU inibe o crescimento tumoral, Suprime STAT3 Atividade e aumenta Tumor imunidade específica em um modelo de transplante do tumor do câncer de próstata. PLoS ONE 7 (7): e41632. doi: 10.1371 /journal.pone.0041632

editor: Mitsunobu R. Kano, da Universidade de Tóquio, Japão

Recebido: 24 de fevereiro de 2012; Aceito: 22 de junho de 2012; Publicação: 24 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Huang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo National Institutes of Health através da concessão #: 5R21CA135221-02 (https://www.nih.gov/), por uma concessão Pré-SPORE cancro da próstata a partir do Centro de Câncer Duke Comprehensive, por uma subvenção do DoD ( PC100266), por uma bolsa da Fundação preocupação e por uma bolsa da Fundação Morris. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é o câncer mais comum em homens com cerca de 230.000 casos diagnosticados anualmente nos Estados Unidos [1]. Entre as várias estratégias de tratamento utilizadas clinicamente, prostectomy continua a ser a primeira opção de cura para pacientes com câncer de próstata [2], [3]. No entanto, a cirurgia não é adequado para o tratamento de metástases distantes e é, portanto, muitas vezes empregues em combinação com radioterapia e /ou quimioterapia, em pacientes com cancros da próstata avançado. Enquanto a radiação e quimioterapia após a cirurgia é frequentemente útil, eles podem não ser aplicáveis ​​a todos os pacientes, dependendo do estágio do câncer e tolerância do paciente. Além disso, a presença da barreira hemato-próstata impede a entrega de agentes quimioterapêuticos para células [4] de cancro da próstata. Mais importante, a baixa especificidade de radioterapia e quimioterapia em alvejar células cancerosas muitas vezes levar a efeitos secundários significativos. Portanto, é altamente desejável combinar a cirurgia com uma terapia dirigida localmente, tal como concentrado de alta intensidade ultra-som (HIFU, também conhecida como de alta intensidade ultra-som terapêutico, hitu) que é bem tolerada pelos pacientes, para erradicar o tumor primário, proporcionando o benefício adicional na supressão de recorrência de tumores e metástases distantes.

na última década, emergiu HIFU como uma modalidade de tratamento não-invasivo promissor para tumores sólidos malignos e benignos localizados [5]. Estudos clínicos extensivos e animais demonstraram que HIFU é bem adequado para a ablação térmica de tumores localizados na fase de arranque e para a terapia de salvamento seguinte falha do tratamento prévio por radiação ou quimioterapia [6] – [8]. Ao focar um feixe de ultra-sons de alta intensidade em uma região bem definida dentro de um paciente, a energia acústica convergente pode ser absorvida pelo tecido do tumor alvo, resultando em uma elevação rápida da temperatura acima de 65 ° C, em poucos segundos, levando a coagulativa necrose celular [9] – [11]. Além disso, quando HIFU é usado num modo pulsado com ciclo de funcionamento baixo ( 2%) através de um processo conhecido como HIFU mecânica (M-HIFU), pode produzir não-térmico, dano mecânico do tecido do tumor através de cavitação acústica [ ,,,0],12]. Estes atributos tornam HIFU uma terapia inerentemente não-invasiva, não ionizantes que é geralmente bem tolerada pelos doentes. Ao contrário de radiação e quimioterapia, tratamento HIFU pode ser administrada repetidamente, sem aumentar o risco de toxicidade sistémica [5].

Além de ablação térmica de tecidos tumorais, HIFU foi mostrado para provocar uma resposta imune anti-tumor, tanto em ratos portadores do neuroblastoma [9] e em pacientes com tumores sólidos de fase tardia [13]. Tem sido sugerido que os detritos do tumor HIFU-ablação e antigénios associados a tumores residuais podem estimular as células dendríticas (DC) e subsequente activação das células T, levando ao desenvolvimento de anticorpos anti-tumorais respostas imunes [14], [15]. Esta hipótese é apoiada por vários estudos clínicos que mostram aumento da citotoxicidade de linfócitos, a melhoria da taxa de sobrevivência, e reduziu a recorrência do tumor e metástases à distância [16].

Em comparação com HIFU convencional, que conta principalmente com ablação térmica, temos demonstrado anteriormente que a M-HIFU pode induzir a liberação forte de sinais de perigo endógenos [17], reforçar as actividades de linfócitos T citotóxicos (CTL) [12] com metástases à distância reduzida [18] DC e. Apesar destas observações encorajadores, o anti-tumoral resposta imunitária global provocada por HIFU é ainda insuficiente, presumivelmente por causa da tolerância imune desenvolvido durante a tumorigénese [19], em que o transdutor de sinal e activador da transcrição 3 (STAT3) tem mostrado desempenhar um papel fundamental [20] – [22]. STAT3 é conhecido por ser activado por citocinas imunossupressoras, tais como a IL-10, que por sua vez pode melhorar ainda mais a expressão de IL-10. Além disso, activado STAT3 (p-STAT3 /Y705) inibe a expressão de citoquinas pró-inflamatórias, tais como IL-12 [23] e induz a expressão de Foxp3, um factor de transcrição essencial para as células T reguladoras (Treg) desenvolvimento [24] . Embora a STAT3 demonstrou desempenhar um papel crucial na tumorigénese e na tolerância imunológica, o seu papel na M-HIFU induziu respostas anti-tumorais não foi investigada.

Neste estudo, exploramos a estratégia de utilizar H -HIFU como uma terapia neo-adjuvante antes da ressecção cirúrgica do tumor de próstata primário para avaliar os efeitos desta nova terapia de combinação no tumor recorrência local e metástases à distância. Em particular, nós focada sobre o papel da STAT3 na modulação das respostas imunes anti-tumor induzida por HIFU. Os nossos resultados mostraram que, em comparação com a cirurgia por si só, a combinação de H-HIFU e cirurgia pode inibir significativamente a recorrência do tumor, suprimir o crescimento de tumores reexpostos ao mesmo tempo melhorar a taxa de sobrevivência. Além disso, estas observações foram corroborados pela actividade reduzida de p-STAT3 com concomitante aumento da resposta anti-tumoral. Ao todo, os nossos resultados sugerem que a M-HIFU em combinação com a cirurgia pode proporcionar uma nova opção terapêutica no tratamento de câncer de próstata.

Resultados

M-HIFU desintegra RM-9 Tumor tecidos, Inibe o crescimento do tumor e melhora Anfitrião Survival

Figura 1A mostra imagens de ultra-som modo B representativas do tumor RM-9 durante o tratamento M-HIFU. O foco do transdutor HIFU foi marcado por um símbolo da cruz. O tratamento de H-HIFU iniciou-se no centro e progrediu com o passo 1 mm para o limite do tumor. Uma margem de segurança de pelo menos 1 mm foi utilizado durante o tratamento HIFU para evitar danos à pele adjacente, músculo e osso. Após cada exposição, pode ser observado um ponto brilhante de hiperecogenicidade (indicado pelas setas nos painéis superiores), correspondente a uma produção de bolhas de cavitação de inércia em todo o tecido tumoral [12]. Porque HIFU pulsada com um ciclo de funcionamento baixo de 2%, foi utilizado em M-HIFU, a temperatura resultante no interior do tecido do tumor era inferior a 45 ° C após uma exposição de 20-s. Portanto, o efeito térmico foi insignificante. O exame dos tecidos de tumor excisadas de desintegração do tecido tumoral e a formação de cavidades, que são característicos de lise mecânica produzida por bolhas de inércia na região tratada a HIFU reveladas (painel inferior direito da Figura 1A).

A,

ultra-sonografia guiada tratamento M-HIFU. actividades de cavitação induzidas pela M-HIFU dentro do tecido de tumor são mostradas em zonas com hiperecogenicidade, indicado pelas setas nas imagens de modo-B (painel superior) e nos tumores excisados ​​(painel inferior esquerdo:. a pele na parte superior do tumor estava intacto após o tratamento M-HIFU; média: tumor removido mostrando superfície exterior intacta após o tratamento M-HIFU; direita:. dividia tumor mostrando lesões mecânicas na região interior após o tratamento M-HIFU

B

, o crescimento do tumor curva de pós rechallenge . 2 × 10

4 RM-9 células foram injectadas subcutaneamente no membro posterior contralateral 30 dias após o tratamento com M-HIFU quando os ratinhos foram totalmente recuperado a partir da ressecção cirúrgica do tumor primário. volume dos tumores reexpostos foi calculada com base na medições do tamanho do tumor em intervalos de 3 dias a partir de dia 7 seguinte rechallenge tumor pinça * p . 0,05, ** p .. 0,01

C,

curva de sobrevivência cumulativa rechallenge seguinte tumor Ratos que atingiram o desfecho humana foram sacrificada. Havia 10 ratos no grupo de cirurgia e 12 no grupo de cirurgia HIFU +. P-valor de 0,019 foi determinada pelo teste de log-rank. Os dados foram obtidos a partir de três experimentos independentes.

Dois dias após o tratamento M-HIFU, os tumores primários foram ressecados a partir dos ratinhos em ambos os grupos. Este atraso de tempo foi seleccionado com base na nossa observação prévia de que a M-HIFU 2 dias antes da ressecção cirúrgica do tumor primário pode reduzir significativamente o risco de metástases distantes num modelo de melanoma murino [18]. Seguir-se de observação nos próximos 30 dias não mostrou recorrência local do tumor, presumivelmente como resultado da remoção rigorosa e abrangente de tecidos tumorais por cirurgia. Neste momento, o novo estímulo tumor foi realizada e o crescimento dos tumores foi seguida retomou-se por mais 30 dias. Como mostrado na Figura 1B, existe uma clara separação das curvas de crescimento, com os tumores no grupo reexpostos cirurgia M-HIFU + significativamente menor do que os do grupo da cirurgia. diferenças significativas no volume do tumor entre os dois grupos estavam começando observado a partir do dia 10 até o final do período de acompanhamento

.

Após a reexposição, nenhum animal morreu. Os ratos com tumores retomou só foram sacrificados quando os desfechos humanas para o crescimento do tumor foram alcançadas. tecidos pulmonares foram colhidos e examinados sob um microscópio de dissecção, mas não se observou qualquer nódulo metastático. Quando a cirurgia foi realizada, RM-9 nódulos tumorais verificou-se ser bem rodeado por uma cápsula de tecido conjuntivo, o que indica uma possível causa da ausência de metástases distantes. A sobrevivência cumulativa no grupo da cirurgia M-HIFU + verificou-se ser estatisticamente maior do que no grupo da cirurgia (Figura 1C), indicando um tumor potencial efeito de H-HIFU em combinação com a ressecção cirúrgica do tumor primário suprimir.

Prostate Cancer RM-9 células expressam constitutivamente p-STAT3, que pode ser reduzida por tratamento M-HIFU

Phospho-STAT3 (Y705), a forma ativada de STAT3, desempenha um papel fundamental na indução vigilância imunológica, desenvolvimento de tumores e metástases de tumores [20], [22], [25]. Portanto, inibir ou demolir STAT3 ativa é de interesse tanto para o tratamento anti-tumoral direta e imunoterapia específica tumor. Antes de elucidar o papel de H-HIFU na activação da STAT3, nós examinamos várias linhas de células tumorais para a actividade STAT3 e descobriram que um elevado nível de p-STAT3 foi expressa em células de RM-9. Como mostrado por IF coloração e microscopia de fluorescência (Figura 2A), quase todas as células de RM-9 foram coradas positivamente para o p-STAT3, como indicado pelos sinais intercalados rosa (setas). Este

in vitro

observação foi ainda confirmada

in vivo

. Tal como mostrado na Figura 2B, examinámos RM-9 tumores colhidos em três pontos de tempo diferentes (10, 15, e 20 dias) após a inoculação para p-STAT3 utilizando IHC e os resultados indicam a activação constitutiva de STAT3 nas RM-9 tumores ao longo dos 20 dias de desenvolvimento do tumor. Estas observações também indicam que RM-9 células e tumores são ideais para examinar os efeitos da M-HIFU na actividade STAT3.

A,

Expressão de p-STAT3 em células RM-9. células de RM-9 foram sujeitas a coloração para P-SE STAT3 e coloração com DAPI para núcleos. Sob microscopia de fluorescência, p-STAT3 foi marcado por fluorescência vermelha, enquanto os núcleos foram marcadas por sinais azuis. Os núcleos p-STAT3-positivos foram indicados por sinais rosa mescladas. setas sólidas apontam para núcleos p-STAT3-positivos representativos enquanto que a seta tracejada representa um núcleo-p-STAT3 negativo.

B,

Padrão de expressão de p-STAT3

in vivo.

RM-9 tumores foram removidos em três momentos diferentes em desenvolvimento como indicado e submetidos à coloração IHC para p-STAT3. Após contrastadas com hematoxilina, núcleos p-STAT3-positivos foram indicados por sinais castanhos escuros (setas), enquanto núcleos-p-STAT3 negativos foram em azul.

C,

Diminuição dos níveis de p-STAT3 na RM-9 tumores após o tratamento M-HIFU. Dois dias após o tratamento com M-HIFU, RM-9 tumores foram removidos e submetidos a coloração IHC para p-STAT3. Três tumores em cada grupo foram analisados ​​e os valores representativos são mostrados. A IHC foi realizada três vezes, independentemente. Os dados foram apresentados como média ± SD. O aluno

t

-test foi conduzido para determinar os valores de p. * P 0,05.

D,

Expressão down-regulação dos três STAT3 genes alvo a jusante pelo tratamento M-HIFU. Dois dias após o tratamento com M-HIFU, RM-9 tumores foi removido e o ARNm foi isolado. RT-PCR foi então realizada para detectar níveis de ciclina D1, Bcl-xL, IL-10 e β-actina. sinais de banda foram quantificados utilizando o software NIH ImageJ. Imagens representativas de três experiências independentes são mostrados.

Em seguida, avaliamos os efeitos da M-HIFU na ativação STAT3 usando RM-9 ratos portadores de tumores. Dois dias após o tratamento com M-HIFU, RM-9 tumores foram removidos dos ratinhos e sujeitas a p-STAT3 IHC (n = 3 por grupo). Como demonstrado na Figura 2C, o nível de p-STAT3 foi significativamente reduzida em 1,8 vezes após M-HIFU, indicando que a administração de M-HIFU pode eficientemente inibir a ativação STAT3 na RM-9 tumores. Além disso, de acordo com a redução observada de p-STAT3 por M-HIFU, níveis de três genes alvo STAT3 expressão foram significativamente reduzido por M-HIFU, bem como, como indicado pelos resultados de RT-PCR na Figura 2D. Em conjunto, esses resultados demonstram que a ativação do STAT3 pode ser detectado em 9 RM-células cancerosas da próstata

in vitro

e

in vivo,

e que M-HIFU reduz os níveis de ativação STAT3 e STAT3- genes-alvo em RM-9 tumores.

M-HIFU aumenta a citotoxicidade específicos de tumores

Para investigar se a M-HIFU tratamento resulta no aumento de respostas CTL [26], foram analisados ​​alteração a frequência de CD8

+ células T e a sua produção de IFN-γ, tanto no grupo da cirurgia M-HIFU + e no grupo da cirurgia. Nós verificámos que 2 dias após a cirurgia, o número de células T CD8

+ célula T foi aumentada no grupo da cirurgia M-HIFU + (Figura 3A e B), em comparação com o grupo que recebeu a cirurgia por si só. a produção de IFN-γ específico de tumores nos hospedeiros portadores de tumor foi adicionalmente verificada por ensaio ELISpot. Os esplenócitos foram colhidas 12 dias após a cirurgia a partir de três ratinhos por grupo, e as amostras foram misturadas e co-cultivados quer com RM-9 ou células de tumor EL-4 irrelevantes (esplenócitos versus células tumorais em relação de 10:01), em seguida, analisados ​​para determinar a produção de IFN-γ. H-HIFU tratamento aumentou de forma significativa a produção de IFN-γ de CTL a 4 vezes o número de controlo não-HIFU (p 0,001) (Figura 3C e D). Esta resposta elevada não foi observado em células EL-4, indicando que a produção de IFN-γ foi RM-9 tumor específico pelo hospedeiro portador de tumor. Estes resultados sugerem que o tratamento com M-HIFU pode promover a geração de IFN-γ produzindo CTL, um dos factores mais críticos na imunidade anti-tumor.

a, Página 2 dias após o tratamento, os baços a partir de três ratinhos tratados com ou sem M-HIFU foram recolhidas e reunidas. Proporção de baço CD8

+ células T foram determinadas por citometria de fluxo. Os resultados representativos de três experiências independentes são apresentados.

B,

A significância estatística do aumento da CD8

+ população de células, combinando HIFU com cirurgia. * P 0,05

C

, doze dias após a cirurgia ou M-HIFU além de tratamento de cirurgia, três murganhos de cada grupo foram sacrificados e os seus baços foram recolhidas e reunidas. ensaio de IFN-γ ELISpot foi realizada com os esplenócitos reunidos. A mitomicina-C tratados células RM-9 foram adicionados como estimuladores, na proporção de 1:10 (RM9: esplenócitos). células EL-4 foram utilizadas como um controlo de células irrelevantes. Os resultados representativos de três experiências independentes são apresentados.

D

, Contagem de células-IFN-y positiva e, e análise estatística com base nos resultados do ensaio ELISPOT. *** P . 0,0001

M-HIFU tratamento aumenta a população de CTLs e controladores de domínio em baços e TDLNs

DCs são as únicas células apresentadoras de antígenos profissionais que podem privilegiada naïve células T, e desempenha um papel crítico na geração de CTL específicos de tumores. DCs podem ser identificados com a expressão de CD11c como um marcador da superfície celular. Desde p-STAT3 é um supressor de central de activação DC [27], [28], foi avaliada a frequência de CD11c

+ população de células em baços e TDLNs 6 dias após o tratamento M-HIFU em ratinhos portadores de tumores RM-9 transplantados . Como mostrado na Figura 4A a 4D, proporções de CD11c

+ células foram significativamente aumentados em baços e TDLNs para mais do que 3 vezes e 1,2 vezes superior do grupo de controlo sem tratamento HIFU, respectivamente (em ambos os casos, p 0,001 ). Também foi avaliada a percentagem de CD11c

+ células no ponto de tempo de 2 dias após o tratamento com M-HIFU, mas parecia ser muito cedo para observar um aumento na população DC (dados não mostrados). Além disso, o tratamento com M-HIFU aumentou a expressão da molécula co-estimuladora, CD80 e CD86, em DC (Figura 4E e 4F). Colectivamente, o tratamento com M-HIFU parece aumentar o recrutamento e /ou a expansão de DCs, para além de maturação de DC.

Três ratos de cada grupo foram sacrificados seis dias depois de cirurgia ou cirurgia HIFU mais tratamento. suspensão de células isoladas foi preparado a partir de baços ou TDLNs reunidas; e CD11c

+ população celular foi determinada por citometria de fluxo. Os resultados representativos de três experiências independentes são apresentados.

A

,

C

, padrões de fluxo representativos na detecção CD11c

+ células no baço (

A

) e TDLNs (

C

).

B

,

D

, significância estatística no aumento da população DC no baço (

B

) e TDLNs (

D

) com base na resultados de

A

e

C,

respectivamente.

E

,

F

, Avaliação da estimulação DC através da detecção de CD80-positivo (

E

) e CD86-positivo (

F

) CD11c

+ células de baço e TDLNs. * P 0,05, *** p . 0,0001

M-HIFU melhorada resposta anti-tumoral é, em parte, pela supressão de Treg celular Geração

STAT3 também desempenha um papel importante no reforço do desenvolvimento de CD4

+ células T reguladoras (Tregs) [24]. Tregs inibir respostas imunitárias e têm sido implicados na indução de tolerância na imunidade anti-tumor. Aqui, procurou-se determinar se o tratamento M-HIFU suprime geração ou ampliação de Tregs nos ratos transplantados-tumorais. Esplenócitos e células TDLNs foram colhidos 6 dias após o tratamento M-HIFU como mencionado anteriormente para avaliar a frequência das Tregs. O resultado mostrado na Figura 5 revelou que o tratamento com M-HIFU provocou uma diminuição substancial da população Treg por cerca de 50% no baço (p 0,001), e cerca de 10% em TDLNs (p 0,001). Semelhante à observação de DCs, as alterações na população não foram significativamente Treg dois dias após o tratamento H-HIFU (dados não mostrados). Estes resultados indicam que, além de expandir a população DC e aumento de maturação de DC, tratamento de H-HIFU reduzido tamanho da população de Tregs, que são conhecidos para regular negativamente o desenvolvimento da imunidade anti-tumoral.

única célula suspensão foi preparada a partir dos baços ou TDLNs reunidas. População de CD4

+ Foxp3

+ células foi depois determinada como Treg por citometria de fluxo. Números mostraram são os representantes de três coloração independente e análise de fluxo posterior.

A

,

C

, padrões de fluxo representativos na detecção de Tregs no baço (

A

) e TDLNs (

C

).

B

,

D

, Proporção da população Treg no baço (

B

) e TDLN (

D

) com base nos resultados mostrados na

A

e

C

, respectivamente. ** P 0,01, *** p . 0,0001

Discussão

Este estudo foi realizado para obter uma melhor compreensão dos mecanismos pelos quais a M-HIFU provoca anti- efeitos tumorais e para explorar estratégias para a utilização óptima dos M-HIFU no tratamento do câncer de próstata. Nosso objetivo a longo prazo é o de estabelecer princípios para usar a terapia de combinação com base M-HIFU como uma modalidade de tratamento melhorado para pacientes com câncer de próstata. Em geral, os nossos resultados sugerem que a M-HIFU podem inibir a activação da STAT3, o que leva a uma resposta anti-tumor através de dois mecanismos potenciais. Em primeiro lugar, a redução de p-STAT3 nos tumores inibe directamente o crescimento de tumores. Em segundo lugar, uma redução da actividade de STAT3 leva a um aumento do número de CTL específicos de tumor e DCs, bem como um número reduzido de Treg, e depois disso um reforço da imunidade anti-tumoral.

A activação constitutiva de STAT3 é frequentemente observada em muitos tumores humanos, incluindo melanoma, câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço, glioma e câncer de próstata [20], [22], [25]. É bem sabido que persistentemente activados funções STAT3 como um regulador chave de eventos moleculares e biológicas que promovem a tumorigénese [29]. actividade aberrante STAT3 desempenha um papel central no crescimento desregulado e sobrevivência de células tumorais, bem como na promoção de angiogénese. Além disso, a STAT3 aberrante promove a invasão e metástases, contribuindo assim para a progressão tumoral [20], [22], [30]. Durante o curso de tumorigénese, a actividade da STAT3 também é elevada em linfócitos associados a tumores [31], [32]. A inibição da STAT3 tanto em células tumorais ou células mielóides-se infiltram no tumor induz respostas imunes anti-tumor Th1, concomitante com um aumento do número de CTL e diminuiu Tregs [33]. Assim, suprimindo a ativação da STAT3 por física (

ou seja,

HIFU) ou abordagens farmacológicas é de grande interesse tanto para o tratamento anti-tumoral direta e imunoterapia específica tumor.

Com base no entendimento acima mencionada sobre STAT3, buscou-se determinar o efeito da M-HIFU na ativação STAT3 em um

in vivo

modelo de transplante de câncer de próstata. De facto, o nível de p-intratumoral STAT3 foi substancialmente reduzida pelo tratamento de H-HIFU. Em um estudo anterior do modelo de transplante B16 melanoma, o nível de p-STAT3 também foi encontrado para ser significativamente regulada pelo tratamento M-HIFU [34], sugerindo que os efeitos da M-HIFU na ativação STAT3 pode ser comum entre os tumores diferentes.

a regulação negativa funcional de p-STAT3 foi ainda verificada pela diminuição da expressão dos seus genes alvo a jusante. A ciclina D1, que é sobre-regulada por STAT3 activado, é um regulador alostérico de quinases dependentes de ciclina 4 e 6 (CDK4 /6) e promove G1 /transição S através da fosforilação CDK4 /6-mediada e a inactivação da proteína do retinoblastoma [ ,,,0],32], [35]. A inibição da expressão de ciclina D1 irá retardar o ciclo celular na fase G1 de entrar na fase S, e por conseguinte, diminuir significativamente a proliferação de células de tumor [36] – [40]. Bcl-xL, também um gene alvo STAT3 importante, é uma molécula anti-apoptótica da família Bcl-2 e aumenta a progressão tumoral [32], [41], [42]. Bcl-xL superexpressão é freqüentemente encontrado em um amplo espectro de tipos de câncer, incluindo câncer de próstata [43], [44]. O esgotamento da expressão de Bcl-xL predominante reduz significativamente a viabilidade de células tumorais a seguir estímulos apoptóticos [45]. Neste estudo, os resultados de RT-PCR demonstrou claramente que a regulação de p-STAT3 foi acompanhada pela diminuição da expressão de ciclina D1 e Bcl-xL em tecido de tumor após o tratamento com M-HIFU. Estes resultados indicaram que o M-HIFU é capaz de inibir a actividade da STAT3 aberrante e, assim, podem induzir a paragem do crescimento e apoptose de células tumorais, bem como a regressão do cancro da próstata

In vivo

.

além da função oncogénica intratumoral, p-STAT3 está envolvida na supressão imunitária através da estimulação DC interferir através da inibição da expressão de citoquinas pró-inflamatórias e quimiocinas que estimulam DC [28]. Alternativamente, p-STAT3 promove células tumorais para produzir várias citoquinas oncogénicos, tais como IL-10, que por sua vez activa a sinalização STAT3 através de um ciclo de feedback positivo e inibe a estimulação DC funcional [28], [33] [32]. estimulação DC é essencial para a apresentação de antigénios e desenvolvimento eficaz de anti-tumor resposta imune pelas células T. Os nossos estudos anteriores utilizando o modelo de tumor MC38 têm mostrado que danos mecânicos gerados por HIFU de células tumorais pode levar à estimulação DC [17], e subsequentemente aumento das actividades de CTL [12]. Neste estudo, ainda verificado que a M-HIFU pode aumentar a função de DCs

In vivo

, como evidenciado por um aumento da população significativa de DCs com expressão concomitantemente supra-regulada de moléculas co-estimuladoras, tais como CD80 e CD86.

Outra função supressora imune de p-STAT3 está relacionada com o seu papel no aumento da geração de Tregs, que suprimem as respostas imunitárias a auto-antigénio, incluindo antigénio associado ao tumor. STAT3 também desempenha um papel importante ao orquestrar vários aspectos críticos da função das células T em inflamação e homeostase. Em particular, a expressão de Foxp3, que é essencial para as funções de regulação de Treg, depende da activação da STAT3 [24]. Inibição da actividade de STAT3 reduz a conversão de células T Foxp3-negativos para Tregs associado a um tumor e aumenta CD8

+ infiltração de células T no tumor – uma estratégia que tem sido usada para inibir o crescimento do tumor primário [46]. Da mesma forma, em nosso estudo, o tratamento M-HIFU foi encontrada para diminuir significativamente a proporção de Treg, tanto baço e TDLNs, concomitantemente com a supressão da atividade STAT3 nesses tecidos. Portanto, nossos resultados sugerem que a M-HIFU pode reduzir a tolerância imunológica Treg-suscitou no modelo RM-9.

Em resumo, revelaram um mecanismo específico de M-HIFU induzida anti-tumor resposta imune, que é mediada através da inibição da ativação do STAT3

in vivo

. Além disso, temos encontrado que a M-HIFU realizada no momento apropriado (ou seja, 2 dias para RM 9-model) antes da remoção cirúrgica do tumor primário pode reforçar a protecção do hospedeiro contra a recorrência do tumor e, portanto, pode aumentar a sobrevivência de pacientes da malignidade do câncer de próstata. Embora neste estudo incidiu sobre o mecanismo associado com a STAT3, o envolvimento de outros mecanismos para M-HIFU induzida imunidade anti-tumor também é possível, e irá ser investigado no futuro. Ao todo, nós demonstramos que M-HIFU é uma terapia neo-adjuvante promissor que pode ser combinada sinergicamente com a cirurgia para tratamento de câncer de próstata.

Materiais e Métodos

Modelo Animal

C57BL /6J, 6~8 semanas de idade, foram adquiridos no Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EUA) e alojado no Duke Biotério antes e após o tratamento M-HIFU e /ou cirurgia. Todos os animais foram tratados de acordo com a política de cuidados com os animais estabelecida e todas as experiências com animais foram aprovados pela Duke University Institutional Care Use Comitê.

Linha Celular e Cultura de Células

linha de células de câncer de próstata Murino RM-9, criado pelo Dr. Thompson no Baylor College of Medicine, foi um presente do Dr. Mouraviev. A linha celular de linfoma de ratinho EL4 foi adquirido a partir de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). Todas as linhas celulares foram mantidas em meio de Eagle modificado completo de Dulbecco (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), suplementado com 10% de soro fetal bovino (Hyclone, Logan, UT, EUA), 2 mM de L-glutamina, 50 lU /ml de penicilina e 50 ug /ml de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) a 37 ° C com 5% de CO

2.

Os anticorpos, kits e reagentes químicos

A seguir kit e os anticorpos foram adquiridos a eBiosciences (San Diego, CA, EUA): reguladora de células T de murganho coloração definido (FJK-16 s), anticorpo anti-rato CD8 conjugado com PE e o anticorpo anti-ratinho de CD16 /32. APC conjugada com anticorpo anti-ratinho de CD11c, conjugado com FITC anti-ratinho CD80, e conjugado com PE anti-ratinho CD86 eram de BD Bioscience (San José, CA, EUA). Fosfo-STAT3 anticorpo de coelho anti-ratinho (Y705) foi adquirido a Cell Signaling (Danvers, MA, EUA). Rato interferão-y foi kit de ELISpot de MABTECH Inc. (Cincinnati, OH, EUA). anticorpo anti-coelho Texas Red cabra conjugado foi comprado de Vector Laboratories Inc. (Burlingame, CA, EUA). Montagem solução de meio com ou sem DAPI, solução de bloqueio, Vectastain Elite ABC Kit (IgG de coelho) e kit de AEC foram de Vector Lab. sistema de isolamento de ARN total SV foi adquirido de Promega (Madison, WI, EUA). enzimas de síntese de DNA eram de Invitrogen salvo indicação em contrário.

Tumor Modelo, HIFU tratamento, a ressecção cirúrgica e pós-operatórios Cuidados e Medidas

RM-9 modelo de tumor foi estabelecida por injecção subcutânea de 8 × 10

4 RM-9 células no membro posterior direito de camundongos C57BL /6J. Os tumores foram deixados crescer durante cerca de 7 dias até atingirem 5~6 mm de diâmetro.