Abstract

O câncer de próstata é o câncer mais comumente diagnosticado afetando 1 em cada 6 homens em os EUA. Compreender a base molecular da progressão do câncer de próstata pode servir como uma ferramenta para o diagnóstico precoce e no desenvolvimento de novas estratégias de tratamento para esta doença. Proteína Quinase D1 (PKD1) é uma quinase multifuncional que é altamente expressa na próstata normal. A diminuição da expressão de PKD1 tem sido associada com a progressão do cancro da próstata. Portanto, os produtos sintéticos ou naturais que regulam esta via de sinalização podem servir como novos tratamentos para a prevenção e tratamento do cancro da próstata. A curcumina, o ingrediente activo de açafrão, demonstrou propriedades anti-cancerosas através da modulação de um número de diferentes vias moleculares. Aqui, demonstramos que a curcumina activa PKD1, resultando em alterações na sinalização β-catenina por inibição da actividade de transcrição nuclear β-catenina e aumentar os níveis de membrana β-catenina em células de cancro da próstata. A modulação destes eventos celulares por curcumina correlacionados com a proliferação diminuída de células, a formação de colónias e a motilidade celular e a agregação de células celular aumentada em células de cancro da próstata. Além disso, também têm revelado que a inibição da motilidade celular por curcumina é mediado pela redução dos níveis da cofilina activo, um alvo a jusante de PKD1. Os efeitos anti-câncer potentes da curcumina

in vitro

também se refletiram em um rato modelo de xenoenxerto de cancro da próstata. O

in vivo

inibição do crescimento do tumor também se correlacionou com a localização da membrana melhorada de β-catenina. No geral, nossos resultados aqui têm revelado um mecanismo molecular de acção inovador curcumina através da ativação de PKD1 nas células cancerosas da próstata

Citation:. Sundram V, Chauhan SC, Ebeling M, Jaggi M (2012) curcumina Atenua β- catenin sinalização em células do cancro da próstata através da ativação da proteína quinase D1. PLoS ONE 7 (4): e35368. doi: 10.1371 /journal.pone.0035368

editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão

Recebido: 04 de outubro de 2011; Aceito: 15 de março de 2012; Publicação: 16 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Sundram et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este projecto foi apoiado por COBRE Grant (RR024219 P20) do NIH (https://www.ncrr.nih.gov/) e por doações do Departamento de defesa (DOD) (https://cdmrp.army.mil/) para MJ (DOD PC073643) e SCC (DOD PC073887). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

introdução

o câncer de próstata é a segunda principal causa de morte e o câncer mais comumente diagnosticado em homens em os EUA [1]. O risco de câncer de próstata aumenta exponencialmente após a idade de 50. Assim, o câncer de próstata está posicionada para se tornar um desafio maior nos próximos anos, devido a um aumento global de longevidade. Embora a etiologia do cancro da próstata não é bem compreendido, ambos os factores genéticos e ambientais parecem desempenhar papéis importantes no desenvolvimento da doença. Uma estratégia de primeira linha comum para o tratamento de câncer de próstata inclui castração cirúrgica ou farmacológica através da terapia de ablação de androgénios. Embora a terapia de ablação de androgénio é eficaz durante a fase inicial da doença, o cancro progride rapidamente para uma fase independente de androgénio para a qual nenhuma terapia eficaz está actualmente disponível conhecido. Portanto, compreender a base molecular da doença é altamente desejável para o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção e tratamento do câncer de próstata.

Protein Kinase D1 (PKD1) é um evolutivamente conservada, ubiquamente expressa serina-treonina quinase que desempenha um papel central na regulação de uma variedade de funções celulares, incluindo a sobrevivência celular, a proliferação, invasão e motilidade [2] – [8]. O

gene PKD1

é expressa em muitos órgãos, com a mais alta expressão documentado nas células da próstata e testículo germinativas [3], [9], [10]. PKD1 exibe uma combinação de características estruturais e funcionais de ambas as família de PKC (glicerol diacil e éster de forbol domínios estruturais de ligação) e a família CaMK (homologia estrutural do domínio cinase e do substrato e inibidor de especificidade). Portanto, é posicionada de forma única dentro da cascata de transdução de sinal para a integração de informação de sinalização de estímulos externos e converte-os em resposta intracelular modulando diversas vias a jusante [2]. Assim, a desregulamentação dos PKD1 afeta várias vias de sinalização, resultando em doenças crônicas como câncer [2]. Trabalho prévio do nosso laboratório tem implicado um papel crítico para PKD1 no cancro da próstata [11]. O nosso trabalho revelou a capacidade de PKD1 para inibir as funções de β-catenina no cancro da próstata [12]. Além disso, de PKD1 foi mostrado para interagir com e modulam as funções de E-caderina, receptor de androgénio e vias de sinalização MAPKinase [13] – [18]. PKD1, também inibe a motilidade celular através da interacção directa com e modulando as funções de um certo número de proteínas envolvidas na remodelação da actina, incluindo fosfatase estilingue (SSH1L) e cortactina [19] – [23]. Além disso, a PKD1 é conhecida por estar envolvida na inibição da invasão, metástase e epitelial-mesenquimal transição (EMT) de células cancerosas através da regulação da expressão das metaloproteinases da matriz (MMPs) [24], [25] e as funções de factor de caracol transcrição [26 ], respectivamente. Consequentemente, as moléculas que modulam a expressão ou actividade de PKD1 podem desempenhar um papel importante na prevenção e ou tratamento de cancro da próstata.

Curcumina (Figura 1A), o ingrediente activo de açafrão, é um não-tóxico, diferuloyl metano composto que tem uma potente anti-proliferativa, anti-inflamatória e anti-oxidantes, [27], [28]. Ambos

in vivo

e

in vitro

estudos têm demonstrado a capacidade de curcumina para inibir eficazmente o crescimento do câncer [29] – [31]. Esta propriedade anti-cancro potente da curcumina está relacionada com a sua capacidade para modular simultaneamente as funções de um certo número de diferentes vias moleculares incluindo a MAPK, EGFR e vias de NFkB [32]. Além disso, a curcumina também regula a actividade de transcrição nuclear β-catenina /factor de células T (TCF). No entanto, os mecanismos moleculares precisos de supressão mediada curcumina da actividade de transcrição β-catenina não são completamente compreendidos.

A). Estrutura química de curcumina. B). Efeito da curcumina na proliferação de várias linhas de células de cancro da próstata. LNCaP, C4-2, DU145 e células PC3 foram tratados com curcumina ou veículo DMSO controlo durante 48 h e proliferação celular foi determinada utilizando o ensaio MTS. A proliferação celular foi calculada por cento através da normalização da proliferação de células curcumina tratada com proliferação de células de controlo tratadas. Concentração dependente de inibição da proliferação celular foi observada com o tratamento com a curcumina. Média ± SE; n = 3; * P . 0,05

No presente estudo, nós revelamos o efeito da curcumina na ativação PKD1. Curcumina mediada por activação de PKD1 suprimida a actividade de transcrição /TCF β-catenina nuclear e inibiu o crescimento de cancro da próstata na linha celular e modelo animal xenoenxerto. A activação de PKD1 também uma maior agregação célula-célula e funções motilidade celular inibidos

através

enriquecimento de membrana β-catenina e a inibição da actividade da cofilina. No geral, nós revelamos uma via de sinalização molecular romance regulamentada pela curcumina para atenuar o crescimento do câncer de próstata.

Resultados

A curcumina inibe a proliferação de células de câncer de próstata

proliferação celular desregulada é uma característica de células cancerosas. A fim de determinar a actividade anti-proliferativa da curcumina (Figura 1A), um painel de linhas celulares de cancro da próstata (LNCaP início passagem androgénio sensível, independente de androgénios C4-2, PC3 e DU145) foram tratados com concentrações variáveis ​​de curcumina para 48 h e avaliados quanto à proliferação de células. Curcumina tratamento exibiram inibição dependente da dose da proliferação de células em todas as diferentes células de cancro da próstata (Figura 1B). O sistema combinado de próstata linha celular de cancro LNCaP células (andrógeno sensível) e C4-2 (LNCaP derivada, andrógeno-independentes) foram utilizados para estudos posteriores.

A curcumina ativa PKD1

PKD1 é necessário para fisiologia normal das células da próstata e a sua regulação para baixo está associada com a progressão do cancro da próstata. Por conseguinte, os compostos não-tóxicos, naturais que regulam positivamente a expressão ou actividade de PKD1 podem ajudar na prevenção e ou tratamento de cancro da próstata. A fim de determinar se a curcumina pode modular a expressão ou actividade de PKD1, C4-2 células de cancro da próstata independente de androgénios foram tratados com curcumina para diferentes pontos de tempo, e a expressão de PKD1 de um total de (Figura 2A) e de PKD1 activa (Figura 2B) foi determinado utilizando anticorpos de anticorpos de PKD1 e fosfo PKD1. Embora nenhuma mudança significativa no nível total de PKD1 foi detectada após tratamento curcumina (Figura 2A), a curcumina tratamento aumentou significativamente a expressão de PKD1 activado dentro de 1 h de tratamento (Figura 2B e Figura S1A). Resultados semelhantes foram também obtidos em células que sobre-expressam C4-2 PKD1 (C4-2-PKD1) (Figura S1B) e em células LNCaP (Figura S1C). Estes dados sugerem que o tratamento com a curcumina pode induzir eficientemente a activação de PKD1 em células de cancro da próstata.

A). Efeito sobre os níveis de curcumina PKD1. células C4-2 foram tratadas com 20 mM curcumina. Em pontos de tempo variando, as células foram recolhidas, e os lisatos foram resolvidos em SDS-PAGE, transferidas para uma membrana de PVDF e sondadas para o total de PKD1. β-actina foi utilizado como um controlo de carga interna. As intensidades da banda foram analisados ​​densitometricamente, normalizados para níveis de p-actina e gráficos. Curcumina tratamento resultou em nenhuma alteração significativa na expressão de PKD1 em 1, 3 e 6 h. B). Efeito da curcumina na activação de PKD1. Para a determinação da expressão de PKD1 activado /fosforilado, as manchas foram sondadas com fosfo PKD1, o total de PKD1 e anticorpos de p-actina. A intensidade da banda pPKD1 foi normalizada para os níveis totais de PKD1 e gráficos. Curcumina tratamento induzida PKD1 activação /fosforilação por 1 h, enquanto que não há alterações aparentes foram observadas na expressão de um total de PKD1. blots representativos de três experiências são mostrados na figura. Au- unidades arbitrárias.

tratamento de curcumina enriquece localização β-catenina na membrana celular

β-catenina é uma proteína celular importante que é fosforilada por PKD1. PKD1, também foi demonstrado que o aumento dos níveis de membrana β-catenina e a interacção célula-célula em células de cancro da próstata [12]. Para determinar o efeito da curcumina a activação mediada de PKD1 em membrana localização β-catenina, a curcumina células tratadas C4-2 foram imunocoradas para β-catenina e processados ​​para microscopia confocal (Figura 3). Como mostrado na Figura 3, o tratamento de curcumina membrana enriquecida β-catenina em células de localização C4-2 dentro de 1 h de tratamento em comparação com células de controlo tratado com veículo. Resultados similares também foram observadas em células LNCaP (figura S2).

C4-2 células foram cultivadas em lamelas de vidro durante a noite em placas de 12 poços. As células foram tratadas com DMSO (painel superior) ou curcumina (20? M) (painel inferior), durante 1 h, lavadas, fixadas e imunocoradas para β-catenina (vermelho) e contra-coradas com DAPI (azul). Maior coloração β-catenina foi observada na superfície da célula em 1 h de tratamento curcumina, em comparação com células de controlo tratado com DMSO. Ampliações originais 600 ×.

A curcumina realce de membrana mediada β-catenina é inibida por PKD1 siARN

PKD1 foi anteriormente mostrado para influenciar a localização subcelular de β-catenina [12] . Por isso, procurou-se investigar o papel da PKD1 em curcumina mediada enriquecimento da membrana β-catenina. Para este efeito, foi utilizada PKD1 siRNA específico para silenciar PKD1 nas células C4-2. PKD1 siRNA expressão eficazmente silenciadas PKD1 (mais de 95%) em comparação com células C4-2 mexidos siRNA (Figura 4A) (não segmentados). Após a inibição da expressão de PKD1, C4-2 células foram tratadas com a curcumina e processado para microscopia confocal para determinar β-catenina e a expressão de PKD1 e localização (Figura 4B). Em células transfectadas siARN mexidos, tratamento curcumina eficientemente melhorada localização β-catenina na membrana celular (Figura 4B, A2-D2) em comparação com células de controlo (Figura 4B, A1-D1). No entanto, em células transfectadas com ARNsi de PKD1 silenciamento, a curcumina tratamento falhou para enriquecer β-catenina na membrana em células C4-2 (Figura 4B, A4-D4). Estes dados sugerem que a PKD1 desempenha um papel na curcumina mediada enriquecimento de membrana β-catenina em células de cancro da próstata.

A). Silenciamento de PKD1 por PKD1 siRNA específico. C4-2 células foram transfectadas durante 48 horas com 25 nM de ARNsi de controlo ou ARNsi de PKD1, submetidas a lise e imunotransferidas para PKD1 e β-actina, utilizando anticorpos específicos. Quantificação de intensidades das bandas de proteínas foi realizada por análise densitométrica. Os níveis de PKD1 foi normalizado os níveis de beta-actina e gráficos. unidades arbitrárias AU. Imunotransferência mostra supressão de mais de 95% da expressão de PKD1 de transfecção com ARNsi de PKD1 específicas (pista 2) em comparação com células de controlo transfectadas com ARNsi (pista 1). B). Supressão de PKD1 inibe o enriquecimento dos níveis de β-catenina membrana. C4-2 células foram cultivadas em lamelas durante a noite. As células foram primeiro transfectadas com ARNsi de controlo (A1-D1; A2-D2) ou de PKD1 silenciamento siRNA (A3-D3; A4-D4) durante 24 h, seguido de tratamento com controlo de veículo (DMSO) (A1-D1; A3 -D3) ou curcumina (20 uM) (A2-D2; A4-D4) durante 1 h. As células foram histoquímica para β-catenina (vermelho) ou PKD1 (verde) e o núcleo foi contra-coradas com DAPI (azul). Maior coloração β-catenina foi observada na superfície celular de células de ARNsi de controlo a 1 h de tratamento curcumina (A2), em comparação com tratamento com veículo (A1). No entanto, siRNA silenciamento mediado de PKD1 (B3, B4) inibiu a curcumina enriquecimento de membrana mediada β-catenina coloração na superfície da célula (A4 vs A3 e A2). Ampliações originais 600 × com 2 x zoom.

A curcumina atenua nuclear β-catenina sinalização

PKD1 modula a via de sinalização β-catenina, interagindo, fosforilação e modulando a localização subcelular e inibindo a actividade de transcrição de β-catenina nuclear [12]. Observou-se a activação por tratamento de PKD1 máxima curcumina dentro de 1 h (Figura 2B). activação transiente de PKD1 tem sido demonstrado ter efeitos de longa duração a jusante celulares [12], [17]. Portanto, determinou-se ainda mais o efeito da curcumina na membrana localização β-catenina após 24 h de tratamento, utilizando microscopia confocal (Figura 5A). Superior membrana β-catenina localização juntamente com reduzida citoplasmática β-catenina foi observada nas células após 24 h de tratamento curcumina (Figura 5A). Além disso, 24 h de tratamento curcumina também alterou a localização subcelular de PKD1 (Figura 5A). Enquanto que em células de controlo, de PKD1 foi localizado principalmente no citoplasma, as células tratadas exibiram curcumina PKD1 localização na membrana e no núcleo (Figura 5A).

A) Efeito do tratamento curcumina na localização celular da β- catenina e PKD1. células C4-2 tratados com curcumina (20 mM) ou DMSO durante 24 h histoquímica para β-catenina (verde) ou PKD1 (vermelho) e contra-coradas com DAPI (azul). células curcumina tratados apresentaram menor membrana citoplasmática e maior coloração β-catenina em comparação com células de controlo. Além disso, enquanto PKD1 foi predominantemente localizada no citoplasma das células de controlo, as células tratadas exibiram coloração curcumina principalmente na membrana celular e no núcleo (setas brancas), com coloração citoplasmática fraca. Ampliações originais 600 × com 2 x zoom. B) Efeito da curcumina em níveis β-catenina nuclear. As proteínas nucleares de células isoladas a partir de C4-2 tratados quer com a curcumina (20 uM) ou DMSO foram resolvidos em membrana de PVDF e processadas para imunotransferência utilizando anticorpos β-catenina. proteína histona H1 foi utilizado como controlo de carga. quantificação densitométrica das intensidades de banda β-catenina, normalizada para níveis de histona H1 é mostrado no gráfico. Curcumina tratamento diminuiu marcadamente os níveis de β-catenina nuclear de células em comparação com tratados com veículo. unidades arbitrárias AU. C) Efeito da curcumina na actividade de transcrição β-catenina em células de cancro da próstata C4-2. A actividade de transcrição β-catenina foi medida por transitoriamente a transfecção das células com construção repórter TCF luciferase contendo ou ligação promotoras locais TCF (pTOP-flash) ou sítios de ligação do promotor TCF mutante (pFOP-flash), juntamente com o plasmídeo de controlo interno contendo

Renilla

gene da luciferase (pRL-TK). Após 3 h, as células foram tratadas com a curcumina (20 uM) ou DMSO durante 24 h. A actividade de transcrição β-catenina foi o primeiro normalizada para

Renilla

atividade luciferase, e expresso como uma razão de actividade /pFOP-FLASH pTOP-FLASH. A actividade das células tratadas curcumina foi normalizada para a actividade de células tratados com veículo (100%) considerado. Curcumina tratamento reduziu significativamente a actividade de transcrição β-catenina em células C4-2 comparação com células tratados com veículo. Média ± EP, n = 3, * P 0,01. D). Efeito da curcumina na transcrição de ciclina D1. A transcrição de ciclina D1 foi analisado a partir de células tratadas com a curcumina ou veículo de controlo durante 24 h. Após a transcrição reversa de ARN em ADNc, amplificação por PCR de ciclina D1 ou GAPDH controlo interno foi realizada usando iniciadores específicos de gene. Os produtos amplificados foram resolvidos em gel de agarose a 1%. A quantificação densitométrica da ciclina D1 intensidades de banda normalizados para níveis de GAPDH é mostrada no gráfico. tratamento curcumina reduziu a expressão da ciclina D1. unidades arbitrárias AU. E). analisa immunoblot. Os lisados ​​celulares preparados a partir de curcumina (20 uM) ou DMSO tratada C4-2 células foram resolvidas por SDS-PAGE e processadas para imunotransferência utilizando anticorpos específicos. Curcumina tratamento diminuiu marcadamente a expressão de ciclina D1, ao passo que não se observou qualquer efeito sobre a expressão do total β-catenina, a E-caderina ou 3a Wnt. imunoblots representativos de três experiências são apresentados.

β-catenina é um componente crítico da cascata de sinalização de Wnt. funções β-catenina nuclear como um factor co-transcrição através da formação de um complexo com TCF e aumenta a expressão de um número de moléculas com funções pró-oncogénicas, incluindo ciclina D1, c-myc e c-jun. Desde PKD1 modula a localização subcelular de β-catenina e uma vez que a curcumina mediada por activação de PKD1 reforçada a localização da membrana de β-catenina, analisamos o efeito desta activação na expressão nuclear β-catenina utilizando imunotransferência e sobre a actividade de transcrição β-catenina usando uma luciferase sistema repórter em células cancerosas da próstata C4-2 (Figuras 5B e 5C). Curcumina tratamento reduziu significativamente a expressão nuclear de β-catenina em comparação com sulfóxido de dimetilo (DMSO), as células tratadas (Figura 5B). A diminuição nos níveis de β-catenina nuclear foi correlacionada com a atenuação da actividade de transcrição β-catenina em C4-2 (Figura 5C). A fim de determinar os efeitos a jusante da actividade β-catenina suprimida, a expressão da ciclina D1 foi analisada em células tratadas curcumina C4-2. Curiosamente, uma diminuição marcada na expressão de ciclina D1 em ARNm (Figura 5D) e os níveis de proteína (Figura 5E) foi observada em células tratadas curcumina C4-2. Resultados semelhantes também foram obtidos por análise de PCR em tempo real (dados não mostrados). No entanto, nenhuma alteração aparente foi observada na expressão de Wnt 3a, β-catenina e E-caderina (Figura 5E).

Determinou-se também o efeito da curcumina na actividade de transcrição β-catenina em células LNCaP. Semelhante a células C4-2, curcumina actividade inibida β-catenina transcrição (Figura S3A) e diminuiu marcadamente a expressão de ciclina D1 (Figura S3B) em células LNCaP.

tratamento curcumina suprime fenótipo oncogénico em células de cancro da próstata

reforçada potencial clonogénico e diminuição da adesão célula-célula são duas características importantes do crescimento e metástase do cancro. A característica de crescimento clonogénico é necessária para as células cancerosas para estabelecer um tumor primário e eventualmente metastizar. Assim, examinamos a capacidade de curcumina para inibir a formação de colónias de ancoragem e dependente de ancoragem independente. Curcumina tratamento inibiu a formação de colónias de ancoragem e dependente de ancoragem independente de um modo dependente da dose em células de cancro da próstata C4-2 (Figura 6A, B). Em ensaios independentes de ancoragem, a curcumina tratamento não só reduziu o número de colónias, mas também diminuiu o tamanho das colónias (Figura 6B). Resultados semelhantes foram observados em células LNCaP (Figura S3C, D).

A). ensaio de formação de colónia dependente Anchorage. C4-2 células (2000) foram semeadas durante a noite, tratou-se com as concentrações indicadas de curcumina por 14 dias e examinadas quanto à sua capacidade de formação de colónias. Fotografias representativas são mostrados. A curcumina mostrou uma inibição dependente da dose no ensaio de formação de colónias dependente de ancoragem. Média ± SE; n = 3; *

p Art 0,05. B). ensaio de formação de colónia independente de ancoragem. C4-2 células foram semeadas em 0,3% de agarose e tratada com concentrações variadas de curcumina por 9 dias. O número de colónias foi contado e representados graficamente. Curcumina tratamento inibiu a formação de colónias independentes de ancoragem de células C4-2. Média ± SE; n = 3;

* p Art 0,01. C) ensaio de agregação de célula-célula. C4-2 células tratadas com curcumina (15 uM) ou DMSO durante 1 h, foram colhidas e ensaiadas para a agregação de células de células por incubação sob condições de agitação suave a 37 ° C na presença de 5 mM de CaCl

2. Após 6 horas de incubação, de uma alíquota da mistura reaccional foi analisada e fotografada para a agregação de células de células ao microscópio de contraste de fase. Grandes agregados célula-célula foram observados em células tratadas curcumina, em comparação com células de controlo de DMSO. Ampliações original de 100 ×.

adesão célula-célula é facilitada pela intercelular interação caderina-caderina. O aumento da localização da membrana de β-catenina reforça a interacções de caderina-catenina e, portanto, aumenta as interacções célula-célula [12]. A fim de determinar o efeito da localização da membrana reforçada de β-catenina, curcumina e tratada C4-2 PKD1 células que sobre-expressam C4-2 (C4-2-PKD1) foram avaliados para a agregação de célula-célula. Curcumina células tratadas C4-2 formados agregados célula-célula maior em comparação com as células de controlo tratadas (Figura 6c). Curiosamente, enquanto C4-2-PKD1 formados agregados de células grandes, muito maiores agregados célula-célula foram observados após tratamento curcumina destas células (Figura S4). Estes dados implicam um papel de activação curcumina mediada de PKD1 na agregação de célula-célula.

A curcumina inibe a motilidade celular através PKD1 fosforilação cofilina mediada

As células cancerosas geralmente apresentam uma melhor motilidade celular para facilitar a metástase. Por conseguinte, a capacidade de um agente quimiopreventivo quimioterapêutico ou para inibir a motilidade celular irá ajudar na prevenção de metástases do cancro. Assim temos investigado o efeito da curcumina na motilidade celular, utilizando um ‘cicatrização de feridas “e ensaios de câmara de Boyden. Comparado ao controle, tratamento de curcumina inibiu a motilidade celular de células cancerosas da próstata C4-2 em ambos os ensaios (Figura 7A, B). Um efeito semelhante sobre a motilidade celular foi também observada em células LNCaP (Figura S3E).

A). ensaio de zero. C4-2 células foram cultivadas, até à confluência, em placas que contêm inserções Ibidi. As inserções foram removidas das placas para gerar lacunas (linhas sólidas brancas mostram largura da abertura; as linhas tracejadas limitam a lacuna) e imagens de contraste de fase da mesma área das lacunas foram tomadas em intervalos de tempo que variam na presença ou ausência de 20 curcumina uM. tratamento curcumina inibiu a motilidade das células cancerosas da próstata C4-2. B). ensaio de câmara de Boyden. Iguais números de células foram semeadas em C4-2 câmaras do Boyden e incubadas na presença de DMSO ou curcumina (20 uM) durante 24 h. As células migraram foram fixadas, coradas, contadas e representadas graficamente. Curcumina inibiu a motilidade das células C4-2. Média ± SE; n = 3; *

p Art 0,05. C). Efeito da curcumina na expressão de actina proteínas de remodelação. Total de lisados ​​celulares preparados a partir de curcumina (20 uM) ou DMSO tratada C4-2 células foram processadas para imunotransferência utilizando anticorpos específicos. A quantificação densitométrica das bandas de proteína normalizada para p-actina nível é mostrado no gráfico. Curcumina tratamento induziu um aumento marcado na expressão de fosfo-cofilina inactiva em comparação com células de controlo tratadas de DMSO. Alteração menor também foi observada na expressão de Arp3. unidades arbitrárias au-.

O processo altamente coordenada de remodelação da actina está na base do processo de motilidade celular. Esta remodelação na frente em crescimento requer a acção orquestrada de um número de moléculas envolvidas na reorganização da actina-F. As proteínas relacionadas com actina (ARP) desempenham um papel importante na ramificação do filamento de actina. A cofilina proteína é uma molécula geradora de monómeros de actina que está envolvida na remodelação da actina. Cofilina é activado pelo disparo de funda (SSH) fosfatase mediada reacção desfosforilação e é inactivado por Lim Quinase (LIMK) reacções de fosforilação mediada [2], [21]. PKD1 é intrinsecamente envolvido na inibição da motilidade celular, interagindo, fosforilar e inibir as funções de muitas proteínas relacionadas com motilidade, incluindo um estilingue como uma fosfatase (SSH1L) [21]. Desde a curcumina activado PKD1, procurou-se investigar o efeito da curcumina sobre a actividade e os níveis de cofilina e proteína Arp3 por immunoblotting. Curcumina tratamento aumentou os níveis de inactiva fosfo-cofilina em células de cancro da próstata C4-2 com pouco ou nenhum efeito sobre a expressão da proteína total (Figura 7C). tratamento curcumina também causou uma ligeira diminuição na expressão de proteínas Arp3. Estes dados sugerem um papel potencial de PKD1 em curcumina mediada inibição da motilidade celular

via

fosforilação cofilina.

In vivo

efeitos da curcumina sobre o crescimento do câncer de próstata

Um modelo de murganho de xenoenxerto foi usada para examinar o

in vivo

efeito de curcumina no crescimento do tumor da próstata e β-catenina localização subcelular. ratinhos nus foram inoculados subcutaneamente com células C4-2 andrógeno-independente. Seguindo o desenvolvimento do tumor, os ratinhos foram administradas injecções intra-tumorais da curcumina ou controlo de veículo. No dia 7, os volumes dos tumores foram medidos e foi determinada a taxa de crescimento do tumor após o tratamento curcumina. A curcumina inibiu o crescimento do tumor de forma eficiente por mais de duas dobras em comparação com os ratinhos tratados com controlo (*

P

0,05) (Figura 8A). Além disso, observou-se mudança na β-catenina localização subcelular em tecidos curcumina tratado de tumor (Figura 8B), semelhante à

in vitro

observações (Figura 3 e 5A). Estes resultados sugerem que a curcumina inibe o crescimento do tumor da próstata, modulando as funções β-catenina.

a) Efeito da curcumina sobre o crescimento do cancro da próstata. células de cancro da próstata C4-2 foram utilizadas para gerar os xenoenxertos em ratinhos nus machos. Seguindo o desenvolvimento do tumor, os ratinhos foram tratados intra-tumoralmente com curcumina (n = 4) ou DMSO (n = 3). A taxa de crescimento do tumor foi medido após 7 dias e o crescimento percentual de tumor após tratamento foi representada graficamente. A curcumina inibe eficazmente o crescimento do câncer de próstata. B) Efeito da curcumina na localização β-catenina. Os tecidos tumorais de curcumina ou ratinhos de controlo tratados foram processadas para coloração IHC utilizando o anticorpo anti-β-catenina. Foi observada coloração melhorada do membranoso β-catenina em ratinhos tratados curcumina, em comparação com ratinhos de controlo. Ampliações originais 400 ×.

Discussão

A desregulação da PKD1, uma serina-treonina quinase, tem sido associada com a progressão do câncer [2], [4], [6]. PKD1 é expressa ao mais alto nível na glândula da próstata e desempenha um papel crítico na fisiologia normal da próstata [9], [10]. Trabalhos anteriores de nosso laboratório revelou a associação de PKD1 a regulação negativa com a progressão do cancro da próstata [3], [11]. O nosso trabalho anterior também tem o papel iluminado de PKD1 da fosforilação da E-caderina, a modulação da motilidade celular e a agregação de célula-célula em células de cancro da próstata [13]. Além disso, mostrámos PKD1 para interagir com, fosforila e modula a função de β-catenina [12]. O macrolactona naturais Bryostatin 1 ativa PKD1 nas células cancerosas da próstata [12]. A PKD1 activado fosforila e transloca nuclear β-catenina a partir do núcleo, resultando na inibição da β-catenina /TCF actividade transcricional [12]. Assim compostos naturais que modulam a activação PKD1 pode ajudar na prevenção e tratamento de câncer de próstata. A curcumina é um composto natural que está actualmente em ensaios clínicos para a prevenção e tratamento de vários cancros [33] – [35]. Neste estudo, demonstrámos que a curcumina activa PKD1, atenua β-catenina /TCF actividade transcricional e enriquece membrana β-catenina resultando na supressão do crescimento do cancro da próstata.

β-catenina é uma proteína multifuncional que desempenha um papel importante na ontogênese e oncogênese. Em combinação com TCF e P300, que funciona como um factor de transcrição na via de sinalização Wnt [36]. Além disso, β-catenina, juntamente com funções de E-caderina na membrana celular como um componente crítico da junção aderentes para melhorar a adesão célula-célula [37]. Assim, a desregulação da β-catenina tem sido associada com o desenvolvimento de diversos tipos de cancros, incluindo o cancro da próstata [36], [38], [39]. Nós mostramos anteriormente um novo mecanismo de regulação β-catenina através da acção de PKD1 [12]. Nisto, que revelaram que a curcumina activa PKD1 dentro de 1 h de tratamento (Figura 2B). Adicionalmente, utilizando um ensaio de repórter de luciferase, que demonstraram que a actividade β-catenina é inibida por curcumina, a seguir à activação de PKD1 (Figura 5C).

Desde β-catenina é uma molécula de sinalização importante, as suas funções são reguladas por vias múltiplas [40]. Enquanto curcumina foi mostrado para inibir a actividade β-catenina /TCF transcrição [41], os seus mecanismos moleculares exactos não são totalmente conhecidos. Aqui, nós, pela primeira vez demonstrado que a curcumina atenua a actividade β-catenina /TCF transcrição

através

activação de PKD1 em células de cancro da próstata. Estudos também mostraram a inibição da actividade de transcrição β-catenina mediante tratamento curcumina em células de cancro de cólon por meio de caspase-3 mediada por degradação de β-catenina [42]. No entanto, não observamos uma diminuição acentuada nos níveis gerais de expressão β-catenina em linhas celulares de cancro da próstata. C). C). * P 0,05. D). * P 0,01.