Abstract

O câncer de próstata é o câncer mais letal mais frequente e segundo em homens nos Estados Unidos. A imunidade inata e inflamação pode aumentar o risco de câncer de próstata. Para determinar o papel da imunidade inata e inflamação no cancro da próstata avançado, foi investigada a associação de 320 polimorfismos de nucleotídeo único, localizado em 46 genes envolvidos nesta via, com o risco de doença utilizando 494 casos com doença avançada e 536 controles de Cleveland, Ohio. Tomados em conjunto, toda a via foi associada com o risco de cancro da próstata avançado (P = 0,02). Duas sub-vias (moléculas intracelulares antivirais e reconhecimento extracelular padrão) e quatro genes nestas sub-vias (

TLR1

,

TLR6

,

OAS1

, e

OAS2

) foram nominalmente associado com o risco avançado câncer de próstata e abrigar vários SNPs nominalmente associadas ao risco de cancro da próstata avançado. Nossos resultados sugerem que a imunidade inata e via a inflamação pode desempenhar um papel modesto na etiologia do câncer de próstata avançado através de múltiplos efeitos pequenos

Citation:. Kazma R, Mefford JA, Cheng I, Plummer SJ, Levin AM, Rybicki BA, et ai. (2012) Associação da imunidade inata e Inflamação Pathway com o Advanced Prostate Cancer Risk. PLoS ONE 7 (12): e51680. doi: 10.1371 /journal.pone.0051680

editor: Ludmila Prokunina-Olsson, do National Cancer Institute, National Institutes of Health, dos Estados Unidos da América

Recebido: 09 de agosto de 2012; Aceito: 05 de novembro de 2012; Publicado: 14 Dezembro, 2012 |

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde [Números Grant: R01CA88164, U01CA127298 e R25CA112355 para R.K.]. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é o câncer mais letal mais frequente e segundo em homens nos Estados Unidos [1]. Existe uma evidência crescente que a imunidade inata e a inflamação pode desempenhar um papel na próstata e outros cancros [2], [3], [4]. A inflamação crônica pode contribuir para câncer de próstata através de vários processos biológicos: a mutagênese causados ​​pelo estresse oxidativo; a remodelação da matriz extracelular; o recrutamento de células imunitárias, fibroblastos e células endoteliais; ou a indução de citoquinas e factores de crescimento, contribuindo para um ambiente proliferativa e angiogénica [2], [3], [5].

Evidências convincentes suporta um papel para os genes envolvidos na imunidade inata e via inflamação na próstata o risco de câncer. Vários genes que abrigam polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) associadas ao risco de câncer de próstata foram identificados, incluindo: os receptores de reconhecimento padrão

MSR1

,

TLR1

,

TLR4

,

TLR5

,

TLR6

, e

TLR10

[6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16]; o gene antiviral

RNASEL

[9], [17], [18], [19], [20], [21]; as citocinas

MIC1

,

IL8

,

TNFa

, e

IL1RN

[13], [22], [23], [24], [25], [26]; e o gene pró-inflamatória

COX-2

[27], [28], [29], [30]. No entanto, a maioria dos estudos anteriores se concentraram em SNPs ou genes individuais e muito pouco se sabe sobre o impacto da via de imunidade e inflamação inata global no desenvolvimento de câncer de próstata mais avançada.

Além disso, casos avançados de câncer de próstata têm um problema de saúde pública mais elevada do que casos menos avançados. Assim, a identificação dos componentes da imunidade inata e processo inflamatório que aumentam o risco de cancro da próstata avançado, é de grande importância.

Para determinar o papel da imunidade inata e a inflamação no cancro da próstata avançado, foi investigada a associação de 320 SNPs, localizadas em 46 genes de imunidade e inflamação inatas, com o risco de cancro da próstata avançado. Realizamos uma abordagem abrangente avaliando a associação entre o risco de doença ou SNPs conjuntos agrupados em todo o percurso, sub-caminhos, e cada gene, bem como SNPs individuais.

Materiais e Métodos

estudo da População

A amostra caso composta de 494 homens com diagnóstico recente, histologicamente confirmado de câncer de próstata, que apresentam uma escala de Gleason ≥7, um estágio ≥ clínica T2c, ou um soro próstata Serum Antigen (PSA) no momento do diagnóstico 10 recrutados nas principais instituições médicas em Cleveland, Ohio (Cleveland Clinic Foundation, hospitais da Universidade de Cleveland, e suas afiliadas) [31]. A amostra de controlo composta frequência 536 homens corresponde a casos por idade (dentro de 5 anos), etnia e instituição médica, que foram submetidos a exames anuais padrão nas principais instituições médicas em Cleveland, e que não têm uma história prévia de câncer de pele não- . O PSA foi medida e encontrou elevada em dois controlos. Novas investigações levam-nos a reclassificá-los como casos avançados de câncer de próstata, deixando-nos com um total de 494 casos de câncer de próstata avançado e 536 controles usados ​​aqui em nossas análises. Aprovação para este estudo foram obtidas junto aos Hospitais da Universidade de Cleveland Institutional Review Board e da Cleveland Clinic Foundation Institutional Review Board, e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes do estudo. Mais detalhes sobre esta população de estudo foram previamente descritos [27], [29], [32], [33], [34], [35], [36].

Seleção SNP, genotipagem e Qualidade

controle

Foram selecionados para o estudo 46 genes candidatos que codificam para proteínas envolvidas na imunidade inata e inflamação, e mais agrupados estes em 6 sub-caminhos biológicos relevantes utilizando uma classificação anteriormente proposto e publicado [37]. Estas sub-vias foram: 1) a sinalização de citocinas (26 genes), 2) a sinalização de eicosanóides (um gene, isto é,

COX-2

), 3) o reconhecimento extracelular padrão (8 genes), 4) moléculas intracelulares antivirais (4 genes), 5) nuclear kappa-cadeia leve-enhancer ou de células activadas B (NFKB) de sinalização (5 genes), e 6) (2 selenioproteínas genes). Os genes

SELS

e

SEP15

codifica para selenoproteins foram incluídos devido ao seu papel potencial no controle da resposta inflamatória através da regulação da produção de citocinas [38].

Todos SNPs localizados dentro e 2 kb a montante e 1 kb a jusante da sequência dos genes candidatos 46 foram identificados por meio do Projeto Internacional HapMap (www.hapmap.org) eo Genoma Variação Server (SeattleSNPs) (https://gvs.gs. washington.edu/). Então, SNPs marcação foram selecionados usando os critérios de teste MultiMarker no programa de software Tagger [39] para capturar todos os SNPs comuns (menor freqüência do alelo, MAF 0,05) com um r

2≥0.8 em cada gene candidato entre os descendentes de europeus populações, forçando os SNPs que são missense, não sinónima e previamente associado com o cancro da próstata a ser incluída. Apenas um SNP missense foi incluído para os genes

TLR3

e

IL6R

.

A análise de componentes Além disso, 39 ascendência marcadores informativos (AIMS) [40] foram genotipados e principal era usado para estimar ascendência genética e conta para a estratificação da população [41]. O primeiro componente principal desta análise ilustres afro-americanos de caucasianos e foi usado como uma estimativa da ascendência genética.

A genotipagem do 330 SNPs foi feito em DNA extraído de amostras de sangue utilizando o Illumina 500G BeadStation juntamente com a ensaio GoldenGate, ou o ensaio Applied Biosystems Taqman. Outros procedimentos de controle de qualidade foram feitas separadamente para cada uma das duas plataformas e para cada um dos dois grupos étnicos (afro-americanos e caucasianos). Dez SNPs que tiveram uma taxa de chamada de 0,90, desviado as proporções esperadas de Hardy-Weinberg em ambos os grupos étnicos (P 0,01), ou tinham uma MAF abaixo de 0,01 em ambos os grupos étnicos foram excluídos. Os indivíduos que tinham uma taxa de chamada de 0,90 também foram excluídos. Após o procedimento de controle de qualidade, os dados da amostra de caso-controle usado para testar a associação com o risco de câncer de próstata avançado incluiu 320 SNPs tagging (Tabela S1) e 39 objetivos.

Análise Estatística

Para analisar todo o conjunto de 320 SNPs em conjunto, ou conjuntos de SNPs agrupadas por sub-caminhos ou genes, foi utilizado o teste SNP-set associação kernel-máquina (SKAT v0.62) [42]. Este método usa um modelo de kernel-máquina de logística, agregando estatísticas de teste pontuação individuais de SNPs, e fornece um P-valor global para o conjunto de variantes testadas que leva em conta o efeito conjunto dos SNPs em um determinado SNP-definido e permite incorporando as co-variáveis ​​de ajuste: idade, instituição e ascendência genética. Uma vantagem de SKAT sobre os outros testes da via é que ela adaptativa encontra os graus de liberdade da estatística de teste, a fim de explicar LD entre SNPs genotipados. Assumindo que cada um dos coeficientes de associação para o

p

SNPs em um determinado SNP-definido (

β

Gp

) segue de forma independente uma distribuição arbitrária com média 0 e variância

ψ

, testando a hipótese nula,

β

Gm

= 0, é equivalente ao teste de

ψ

= 0 (

ou seja

, um teste de variância-componente pontuação feito usando o modelo misto correspondente). Para uma amostra de caso-controle com

n

indivíduos amostrados e

p

variantes genotipados, G é o

n

×

p

matriz de genótipos, e K = GG

T é um

n

×

n

matriz do kernel linear, que define a similaridade genética entre todos os indivíduos para o

p

SNPs. A função que liga cada elemento da matriz K para os genótipos G é a função kernel. Para testar a associação entre a doença eo SNP-set, a variação em componentes pontuação estatística Q segue uma mistura de distributions.where qui-quadrado, é a média prevista do vetor de valores de estado da doença (y) sob a hipótese nula , obtido pela regressão y apenas nas co-variáveis ​​de ajuste. Para teses análises, utilizou-se o kernel linear (equivalente a montagem da regressão logística multivariada incondicional) eo método de Davies exatas para calcular valores p. Além disso, testamos para a associação do risco de cancro da próstata avançado com as 320 SNPs individualmente por meio de regressão logística multivariada incondicional ajuste para idade, instituição, e ascendência genética. odds ratio (OR), intervalo de confiança de 95% (IC 95%) e P-valores foram estimados usando modelos ambos co-dominantes e log-aditivos.

Para ajustar a ascendência genética em todas as análises, que incluiu a primeiro componente principal da análise de componentes principais dos 39 objectivos, tal como covariável. Além disso, para identificar SNPs com potenciais efeitos opostos em afro-americanos e caucasianos, nós também estratificada todas as análises por etnia relatou. Nossa associação risco de doença estratégia avaliada em vários níveis de agrupamentos SNP (jogo inteiro, sub-vias, genes e SNPs individual). Para ter em conta os múltiplos testes feitos enquanto incorpora a correlação entre SNPs e codificação genótipo, foi utilizado um procedimento de permutação para obter a distribuição empírica de testes estatísticos sob a hipótese nula de não associação com o conjunto de SNPs ou SNP. Em seguida, para cada nível de agrupamentos de SNP, calculou-se uma taxa de erro família-sábio, comparando o valor de P de cada teste, para a distribuição dos valores P mínimos obtidos a partir de 1000 conjuntos de dados permutados. valores P relatados são dois lados e as análises foram feitas usando R v2.13.1 [43].

Resultados

Estudo Assunto Características

O exemplo de caso-controle incluiu 1030 indivíduos cuja idade média no momento do diagnóstico ou de recrutamento foi 65,87 (DP: 8,46) anos, e foi composta de 194 afro-americanos (18,8%) e 836 caucasianos (81,2%). Idade e etnia foram igualmente distribuídos em casos e controles (Tabela 1) cancro da próstata avançado.

Associação com o Advanced Prostate Cancer Risk

No seu conjunto, todo o conjunto de 320 SNPs no imunidade inata e via a inflamação foi significativamente associada com o risco de câncer de próstata avançado (P = 0,02). Dos 6 sub-vias analisados, as moléculas antivirais intracelulares e as de reconhecimento de padrões sub-vias extracelulares foram nominalmente associado com o avançado risco de cancro da próstata (P = 0,02 para ambos) mas não associado após correcção para os testes múltiplos (P = 0,12 e P = 0,11, respectivamente)

Curiosamente, 4 genes nestes 2 sub-vias também foram nominalmente associado com o risco de câncer de próstata:.

TLR1

e

TLR6

na extracelular reconhecimento de padrões sub-via (P = 0,002 e P = 0,04, respectivamente), e

OAS1

e

OAS2

nas moléculas antivirais intracelulares sub-via (P = 0,015 e P = 0,019, respectivamente) . Além disso,

IFNGR1

na citocina sinalização sub-via e

COX-2

, que é o único membro da eicosanoid sinalização sub-via representada no nosso conjunto de dados, teve P- nominal valores de 0.006.and 0,044, respectivamente (Tabela 2). No entanto, nenhuma dessas associações são robustos a correção para testes múltiplos (P = 0,10 para a associação com o

TLR1

).

Os resultados do SNP indivíduo análises apoiaram os resultados obtidos com o sub-Caminho e genes sets. Na verdade, a maioria dos SNPs ter um P-valor associação nominal inferior a 0,01, pertencem a

TLR1

,

TLR6

,

OAS1

,

OAS2

ou

COX-2

(Tabela 3). Além disso, muitos dos outros SNPs no estes genes ter um valor-p entre 0,01 e 0,05 (Tabela S2). Curiosamente, para todos estes SNPs, os resultados indicam um efeito protetor do alelo menor com aditivos RUP entre 0,73 e 0,77. Mas, novamente, ao corrigir para testes múltiplos, estes não eram mais significativa (P = 0,42 para a associação mais significativa).

estratificação na etnia mostra que a maioria dos SNPs associados à via, sub- caminhos, e SNPs em toda a amostra também são detectados em caucasianos, o que representa mais de 80% da amostra, mas não em afro-americanos (Tabelas 2, 3 e Tabela S2).

Discussão

Nesta análise integrativa da associação do risco de cancro da próstata avançado com genes candidatos envolvidos na imunidade inata e inflamação, estudamos 320 SNPs e seus efeitos combinados ao longo genes e sub-caminhos. Tomado como um todo, o inato de imunidade e inflamação via global parece estar envolvido no cancro da próstata avançado, mas os elementos individuais desta associação não são claros. Na verdade, todo o conjunto de 320 SNPs está significativamente associado com o risco de cancro da próstata avançado. No entanto, nenhuma das outras associações avaliadas com sub-vias, genes ou SNPs individuais foram significativos, quando corrigidos para testes múltiplos, fazendo estimativas baseadas permutação de a taxa de erro família-wise.

No entanto, nossos resultados sugerem que o reconhecimento extracelular padrão, as moléculas antivirais intracelulares, e a sinalização de eicosanóides (isto é,

COX-2

) poderia ser componentes que desempenham um papel potencial do risco de cancro da próstata avançado. Dentro dessas sub-vias, 5 genes (

TLR1

,

TLR6

,

OAS1

,

OAS2

, e

COX-2

) foram nominalmente associado com o risco de câncer de próstata avançado. Além disso, esses genes abrigar vários SNPs nominalmente associadas ao risco de cancro da próstata avançado.

TLR1 Comprar e

TLR6

membros codificam da família de receptores toll-like. O seu papel é o de reconhecer padrões moleculares associados a patógenos infecciosos. Ambos são altamente conservadas de

Drosophila

para os seres humanos e partilhar semelhanças estruturais e funcionais. Além disso, TLR1 e TLR6 também partilham a capacidade para formar um heterodímero com o TLR2 reconhecer peptidoglicano e lipoproteínas de agentes patogénicos. TLR1 é especializada no reconhecimento de bactérias gram-positivas. Vários estudos têm relatado associações de câncer de próstata com membros da família toll-like receptor [6], [12], [16]. Em particular Sun et al. [12] observaram vários SNPs em forte desequilíbrio de ligação localizado na

TLR1

,

TLR6

, e

TLR10

associado com câncer de próstata. Em nosso conjunto de dados, observou-se a mesma associação com rs5743551on

TLR1 Comprar e rs5743795 em

TLR6

.

OAS1

e

OAS2

codificam para duas enzimas da família da sintetase de 2-5A, envolvidos na resposta imune inata a infecções virais. Estas moléculas são induzidas por interferões e activar RNase L (produto de

RNASEL

) que degrada ARN viral e inibe a replicação. Recentemente, Molinaro et ai. [44] mostrou que as fracções de ARN de linhas celulares de cancro da próstata são capazes de se ligar e activar moléculas OEA, ao passo que as fracções de ARN de células epiteliais prostáticas normais podem não. doenças também, infecções virais sexualmente transmissíveis [45], [46], [47], [48], [49], [50] e infecções com

Propionibacterium acnes

, uma bactéria gram positiva, [ ,,,0],51], [52] têm sido sugeridos como gatilhos em cancro da próstata. Estes agentes infecciosos podem ser apuradas após a infecção aguda. No entanto, estes agentes poderiam induzir a carcinogénese através da activação de uma resposta inflamatória crónica [53]. Apenas um estudo da associação entre câncer de próstata e

OAS1

foi feito em um tamanho menor da amostra e 3 SNPs diferente da nossa selecção, onde uma associação com rs2660 foi encontrado [54].

COX-2

codifica para a enzima ciclo-oxigenase-2 (COX-2). COX-2 converte o ácido araquidónico em prostaglandina H2, a qual é um precursor para outras moléculas inflamatórias de tecidos específicos (prostanóides). De COX-2 foi encontrado para ser sobre-expressa em tecido de cancro da próstata em comparação com o tecido prostático normal adjacente [55], [56], [57]. A associação de variantes genéticas com risco de câncer de próstata também foi descrito em estudos anteriores, incluindo no mesmo conjunto de dados [27], [28], [29], [30], [58]. No entanto, relatórios sobre a associação entre a expressão elevada de COX-2 em tecidos de câncer de próstata e de alta escala de Gleason e recorrência da doença resultados mistos [59], [60], [61].

Nossos resultados são concordantes com os descritos por Zheng et ai. [62], que estudaram 9.275 SNPs em 1.086 genes inflamação usando 200 casos familiares e 200 controles de origem sueca. Eles observaram um enriquecimento significativo no número de associações observadas nominais, sugerindo o papel de múltiplos genes com efeitos modestos. No entanto, usando a SKAT, nosso estudo é a primeira análise de conjuntos SNP partilhados com genes e sub-caminhos dentro da imunidade e inflamação via inata.

Nenhum dos SNPs ou genes incluídos em nosso estudo foi relatado em nenhum dos estudos de associação do genoma do câncer de próstata listados no Catálogo de estudos de associação genômica-Wide [63].

no entanto, nosso estudo tem várias limitações. Em primeiro lugar, o tamanho da amostra limitada e, assim, poder limitado, poderia explicar por que a associação com o conjunto de genes é significativa, enquanto nenhuma das associações com os sub-vias, genes ou SNPs são significativas após correção para testes múltiplos. Com esta amostra, o mínimo (ou máximo de protecção) odds ratio detectável com uma potência de 80% varia entre 1,5 (ou 0,67) e 2,19 (ou 0,46) quando o MAF varia entre 0,5 e 0,05. Além disso, a dimensão limitada da amostra não permite avaliar potenciais efeitos heterogêneos de variantes por etnia ou outras variáveis. Em segundo lugar, embora uma selecção mais rigorosa dos casos iria descrever melhor o papel da via de imunidade inata e a inflamação no cancro da próstata avançado, que iria diminuir o tamanho da amostra -e, por conseguinte, a poder- drasticamente. Em terceiro lugar, a nossa selecção de SNPs não podemos excluir a possibilidade de variantes funcionais raras nestes genes candidatos para desempenhar um papel no risco de cancro da próstata avançado. Em terceiro lugar, embora o método SKAT fornece um quadro ideal para testar a associação com conjuntos de SNPs potencialmente correlacionados, ele não mede o aumento no risco associado a variações no conjunto de SNPs.

Em conclusão, Isso reforça estudo investigação sobre a genética do câncer de próstata através do estudo de SNPs em um caminho candidato em vários níveis de informação: via todo, sub-vias, genes e SNPs. Nossos resultados sugerem que embora possa não ser central na etiologia do câncer de próstata avançado, a imunidade e inflamação via inata poderia desempenhar um papel no cancro da próstata através de diferentes variantes genéticas.

Informações de Apoio

Tabela S1.

Descrição dos 320 polimorfismos de nucleotídeo único analisados. A1: Minor (mais raro) alelo; A2: Outro (freqüente) alelo; A1A1: Mais raro genótipo homozigoto; A1A2: genótipo heterozigoto; A2A2: genótipo homozigoto frequentes; MAF: freqüência do alelo Menor; P

Hardy-Weinberg:. Hardy-Weinberg teste de adequação proporção (teste do qui-quadrado)

doi: 10.1371 /journal.pone.0051680.s001

(XLSX)

Tabela S2.

Associação de todos os SNPs analisados ​​com risco de cancro da próstata avançado. Os próximos 3 folhas de Excel contêm os resultados das análises para toda a amostra (geral) e estratificada por etnias: americanos e caucasianos africanas. OR: Odds Ratio; IC 95%: 95% intervalo de confiança; P-value: P-valor do teste de Wald de associação de heterozigoto ou genótipos homozigotos raros em comparação com o genótipo homozigoto comum ou P-valor do teste de tendência alélicas

doi:. 10.1371 /journal.pone.0051680.s002

(XLSX)