Abstract

ácido gambogic (GA), o principal componente ativo da resina gamboge, tem potente actividade antitumoral tanto

in vivo

e

in vitro

. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes permanecem obscuros. Neste estudo, descobrimos que GA poderia iniciar a autofagia em células de câncer colorretal, e inibição do processo de autofagia acelerada o efeito de inibição da proliferação e morte celular por apoptose induzida por GA, o que implica um papel protetor da autofagia. Bidimensionais proteómica à base de electroforese mostraram que o tratamento com GA alterou a expressão de várias proteínas envolvidas na sinalização redox e o metabolismo lipídico. Estudos funcionais revelou que a desregulação induzida por GA do metabolismo lipídico pode activar 5-lipoxigenase (5-LOX), resultando na acumulação intracelular de ROS, seguida pela inibição da Akt-mTOR sinalização e iniciação autofagia. Finalmente, os resultados obtidos utilizando um modelo de xenoenxerto sugerido autofagia induzida ROS proteger contra o efeito antitumoral de GA. Tomados em conjunto, estes dados mostram novas actividades biológicas de GA contra o cancro colorectal subjacentes ao papel protetor da autofagia induzida ROS. Este estudo irá fornecer informações valiosas para futuros estudos a respeito dos mecanismos anti-cancerígenos de GA

Citation:. Zhang H, Lei Y, Yuan P, Li L, Luo C, Gao R, et al. (2014) ROS-Mediated Autophagy induzida pela desregulação of Lipid Metabolism desempenha um papel protetor nas células do câncer colorretal tratado com ácido gambogic. PLoS ONE 9 (5): e96418. doi: 10.1371 /journal.pone.0096418

editor: Spencer B. Gibson, da Universidade de Manitoba, Canadá |

Recebido: 25 de dezembro de 2013; Aceito: 07 de abril de 2014; Publicado em: 08 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China (Grant número: 30672480), Pesquisa Nacional de alta Tecnologia e do Programa de Desenvolvimento da China (Programa 863; No.2012AA020201), o Nacional 973 Programa de Pesquisa básica da China (2013CB911300) e da Educação Departamento de Hubei ciência província e tecnologia projectos de excelente projeto de jovens talentos (Q20091207) de pesquisa. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CCR) é a terceira principal causa de câncer ea quarta para mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [1], [2]. Se CRC pode ser diagnosticada e tratada precocemente, cerca de metade dos pacientes com CCR poderia ser curada por cirurgia e tratamento multimodal antes metástase ocorre [3]. No entanto, até à data as estratégias de tratamento eficazes para CRC avançada são limitadas. 40-50% dos pacientes têm doença metastática, dos quais 90% morrem dentro de 5 anos de diagnóstico [4], [5]. Apesar dos avanços crescentes na medicina molecular, a detecção precoce eficaz, a vigilância e tratamento de CRC continua a ser um dilema. Portanto, a melhoria das estratégias terapêuticas sistémicas são urgentemente necessárias para eliminar eficazmente câncer primário ou metastático, para os quais o desenvolvimento de novas drogas pode ser benéfica

ácido gambogic (GA;. C

38H

44O

8, MW 628,76), um xanthone polyprenylated, é um importante ingrediente ativo da gamboge isolado do

Garcinia

[6], [7]. Tem sido relatado na Medicina Tradicional Chinesa que gamboge é frio, ácido, amargo e venenoso [8]. No sudeste da Ásia, GA tem uma longa história de uso de medicamentos desintoxicação, homeostase, anti-inflamatórias e parasiticida [7], [9], [10], [11]. Ao longo do último meio século, os estudos farmacológicos revelaram que GA tem fortes atividades antitumorais contra vários tumores, incluindo leucemia humana, hepatoma, oral, mama, gástrico, pancreático, próstata, epitelial do câncer do colo do útero e pulmão [9], [12], [ ,,,0],13]. Recentemente, GA também foi relatado para ter um efeito anti-tumoral marcado para as células CRC

in vivo

e

in vitro

[14], [15]. Devido ao amplo espectro de actividade anti-tumoral com o mínimo de toxicidade para células normais, GA foi aprovado pela Food and Drug Administration Chinesa para o tratamento de vários cancros e terminou fase II de ensaios clínicos [7], [16]. Embora a estrutura química do GA foi identificada na década de 1980 de ambos os estudos de RMN e de raios-X de cristalografia detalhadas [12], [17], [18], e mecanismos múltiplos antitumorais (incluindo a indução de morte celular programada, regulação do ciclo celular, depressão telomerase, ativação de linfócitos T, a inibição da angiogénese, espécies reativas de oxigênio (ROS) geração

etc.

) têm sido propostas por um número de grupos de pesquisa em todo o mundo, [7], [12], [13], [18] [19], [20], os mecanismos moleculares em relação à sua potente atividade antitumoral permanecem ambíguas e exigem mais investigação.

a autofagia é um processo catabólico altamente conservado caracterizado pelo transporte de componentes celulares do autofagossomas bicamada a lisossomos para degradação e reciclagem em resposta ao nutriente fome ou estresse metabólico [21]. nucleação Autophagosome é iniciada pelo tipo de PI3-quinase III-Atg6 /beclin um complexo, ao passo que o alongamento é monitorizada por sistemas /LC3-fosfatidiletanolamina conjugados, ambos os quais são características chave da autofagia [21], [22] Atg12-Atg5 e Atg8 , [23]. Autophagy pode ser induzida por um número de agentes quimioterapêuticos, tais como o trióxido de arsénio e oxaliplatina [24], [25]: no entanto, o papel da autofagia no cancro é controverso [26], [27], [28]. Uma resposta autofágica regulamentado pode garantir o volume de negócios fisiológica de organelas danificadas e macromoléculas reciclados para atender às demandas de energia em resposta a fármacos citotóxicos, levando a sobrevivência prolongada de células [26], [29]. Em contraste, uma acumulação maciça de vacúolos autofágicos podem levar a uma morte autophagic célula (tipo II morte celular programada), ou a uma tentativa final da célula para sobreviver dependendo do tipo de tumor, estádio, contexto genético e o ambiente celular circundante [26] , [29], [30]

espécies reativas de oxigênio (ROS) é um termo coletivo que engloba a redução incompleta do oxigênio, incluindo o ânion superóxido (o

2

-)., peróxido de hidrogênio (H

2O

2) e o radical hidroxila (HO •) [31], [32]. As principais fontes de ROS celulares são gerados a partir do mitocondrial cadeia de transporte de elétrons (Mito-ETC), a NADPH oxidase (NOX) complexo e retículo endoplasmático [31], [32]. As células cancerosas de tumores avançados exibem frequentemente o stress oxidativo elevado, o que sugere que o aumento dos níveis de ROS desempenha um papel importante na progressão do tumor e também gerar células cancerosas com uma tolerância inferior para ROS [33], [34]. A activação dos oncogenes, perda de p53 funcional, metabolismo aberrante e tratamento químico, têm sido relatados para aumentar a produção de ROS nas células cancerosas [33], [34]. A homeostase redox intracelular é um factor determinante do destino da célula: a produção excessiva de ROS geralmente resulta em efeitos citotóxicos e podem conduzir à morte celular por apoptose, enquanto que os níveis moderados de ROS pode actuar como um segundo mensageiro para a regulação de diversos processos celulares, tais como células sobrevivência, proliferação e metástase [35], [36], [37]. Acumulação de ROS foi reportado para associar com o início de autofagia e invariavelmente ser envolvido no resultado de autofagia (sobrevivência celular ou a morte) [38], [39]. É geralmente aceite que as ROS pode induzir autofagia, e que autofagia, por sua vez, ajuda na depuração de excessiva de ROS para proteger as células de dano oxidativo, o que pode reflectir o equilíbrio de qualquer sobrevivência celular ou a morte [28], [38], [39].

estudos recentes mostram que o GA pode induzir a acumulação de ROS nas células cancerosas que contribui para a actividade anti-cancro [40], [41], [42], enquanto autofagia pode inibir o efeito terapêutico da GA em células de glioblastoma [43]. Neste estudo, descobrimos que GA poderia promover a apoptose e autofagia em células de câncer colorretal

in vitro

e

in vivo

e inibição da autofagia aumentou a sensibilidade contra o tratamento GA. Além disso, foi necessária a acumulação de ROS intracelulares decorrentes de 5-LOX para autofagia induzida por GA.

Materiais e Métodos

Cultura de Células e Reagentes

de células de carcinoma de cólon humano linhas, HCT116 e SW620, e a linha celular do carcinoma do cólon de murino C26 foram adquiridas a partir da ATCC. As células foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, 10

5 U /L de penicilina e 100 mg /l de estreptomicina a 37 ° C numa atmosfera contendo 5% de CO

2.

os seguintes reagentes foram usados ​​neste estudo: ácido gambogic (Gaia Chemical Corp, G1000), de MTT (Sigma, M2128), 3-metiladenina (3-MA) ​​(Sigma, M9281), NAC (Sigma, A9165), Z-VAD -fmk (Sigma, V116), laranja de acridina (Sigma, A6014), dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma, D2650) apocinina (Sigma, A10809), rotenona (Sigma, R8875), ácido Nordihydroguaiaretic (NDGA) (Sigma, 74540) , Pepstatina A (Sigma, P4265), E64D (Sigma, E8640). Para o armazenamento, uma solução 10 mM de GA foi preparada em DMSO, armazenado a -20 ° C, e depois diluiu-se conforme necessário no meio de cultura foram usadas

Anticorpos contra as proteínas seguintes:. Caspase 3 (a sinalização celular , 9664S), beclin 1 (Santa Cruz, SC-11427), LC3 (Abcam, ab58610), Atg5 (Abcam, ab78073), Atg7 (Abcam, ab53255), p62 (Abcam, ab91526), ​​5-LOX (Abcam, ab39347 ), actina (Santa Cruz, sc-1616), Akt (sinalização celular, 4685), fósforo-Akt (sinalização celular, 4051), mTOR (sinalização celular, 2983), fósforo-mTOR (sinalização celular, 2971), S6K p70 (Santa Cruz, sc-9027), de fósforo-p70 S6K (Santa Cruz, 7984-R), a peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpo secundário anti-coelho (Santa Cruz, sc-2004), conjugado com HRP anti-ratinho secundário anticorpo (Santa Cruz, sc-2005).

Ensaio de viabilidade celular

As células foram semeadas em placas de cultura de 96 poços e tratadas durante 12 h, 24 h e 36 h, respectivamente. Subsequentemente, a viabilidade celular foi avaliada utilizando o ensaio de MTT [44]. A absorvância foi medida a 490 nm (comprimento de onda teste) e 570 nm (comprimento de onda de referência) com um Espectrofotómetro de multi-poços (MDC, Sunnyvale, CA).

Anexina V-FITC /PI duplamente marcada Citometria de Fluxo

Para detectar a proporção de apoptose das células tratadas com GA (0,25, 0,5 ou 1,0 uM), a expressão de anexina V-FITC e a exclusão de PI foram detectadas utilizando bicolor de citometria de fluxo (FCM). células HCT116 ou SW620 foram recolhidos usando tubos de PE, lavadas duas vezes com PBS e ressuspensas em 500 ul de tampão de ligação. As amostras foram incubadas com 5 mL de anexina V-FITC durante 10 minutos a temperatura ambiente e, em seguida, foi adicionado 5 mL de PI. Cada amostra foi incubada durante mais 10 min à temperatura ambiente no escuro antes da intensidade de fluorescência foi quantificada utilizando um citómetro de fluxo (Beckman Coulter, Miami, FL, EUA).

GFP-LC3 Coloração de autofagossomas

células HCT116 e SW620 foram transfectadas com um plasmídeo pEGFP-LC3 (referido como GFP-LC3) utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen, 11668027) de acordo com as instruções do fabricante. A fluorescência de GFP-LC3 foi visualizada e a taxa de formação de vacúolo GFP-labled-LC3 (autofagossomas) foi contado sob um microscópio de fluorescência [45], [46]. As células com pontos puntiformes GFP-LC3 foram definidos como positivo se células que tinham 5 ou mais GFP-LC3 pontos no citoplasma [47].

Detecção de Ácido vesicular Organelos

células (1 × 10

5) foram plaqueadas em placas de 6 poços. Após o tratamento de droga, as células foram coradas com laranja de acridina /mL 1 ug durante 15 min, lavadas com PBS e examinadas por microscopia de fluorescência de [48], [49].

Electron Microscopy

Células eram colhido, sedimentadas e fixadas em paraformaldeído (0,1% de glutaraldeído em cacodilato de sódio 0,1 M) durante 2 h, pós-fixadas com 1% de OsO

4 durante 1,5 h, lavou-se e, finalmente, coradas durante 1 h em 3% de acetato de uranilo aquoso. As amostras foram então lavadas novamente com água, desidratados em álcool graduado (50%, 75% e 95-100% de álcool) e embebidos em Epon-resina araldite (Canemco, 034). Secções ultrafinas foram cortadas em um Reichert Ultramicrotome, contrastadas com citrato de chumbo de 0,3% e examinadas em um microscópio eletrônico de transmissão Philips EM420. As células com vacúolos autofágicos foram definidos como positivo se eles tinham 5 ou mais vacúolos autofágicos. A área ocupada pelos vacúolos autofágicos e citoplasma foram determinados com software da imagem Pro Plus Análise de Imagem versão 3 e utilizado para calcular a área citoplasmática ocupada pelos vacúolos autofágicos [50].

TUNEL Ensaio

ensaio TUNEL foi realizado utilizando o sistema de TUNEL deadend fluorométrico (Promega, G3250) de acordo com as instruções do fabricante. células positivas TUNEL foram examinadas sob um microscópio de fluorescência [51].

RNA Interferência

Atg5

,

beclin 1, 5-LOX Comprar e controle negativo siRNA foram sintetizados por Genepharma. As sequências de siRNA foram as seguintes: humano

Atg5

siRNA, sentido 5′- GAC GUU GGU AAC UGA CAA ATT-3 ‘e antisense 5′-UUU GUC AGU UAC CAA CGU CTT-3’; humana

beclin 1 | siRNA, sentido 5′-GGA GCC AUU UAU UGA AAC UTT-3 ‘e 5′-antisense AGU UUC AAU AAA UGG CUC CTT-3’. 5-LOX foi concebido de acordo com o estudo anterior (sequência de direccionamento: 5′-GCGCAAGTACTGGCTGAATGA-3 ‘; NM_000698) [52]. O siARN foram transfectadas com reagente Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668027) durante 24 h em células HCT116 de acordo com o protocolo do fabricante.

Espécie de oxigénio reactivos (ROS) Medição

nível intracelular de ROS foi detectado pela coloração de células com 2 ‘, 7’-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-dA) (GENMED, GMS10016.2) de acordo com as instruções do fabricante. O sinal de DCFH-DA foi medida com um fluorímetro Molecular Devices SPECTRAMAX M5 (excitação 490 nm e 530 nm de emissão).

Immunoblot

As proteínas foram extraídas em tampão RIPA (Tris-base 50, EDTA 1,0 mM, NaCl 150 mM, 0,1% de SDS, 1% Triton X-100, 1% desoxicolato de sódio, 1 mM de PMSF) e quantificadas com o kit de ensaio de proteína DC (Bio-Rad). As amostras foram separadas por 12% SDS-PAGE e transferidos para membranas de PVDF. As membranas foram bloqueadas durante a noite com uma solução salina tamponada com Tris com Tween 20 (TBST) (20 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 0,1% de Tween 20) em 5% de leite desnatado a 4 ° C, e subsequentemente sondadas utilizando os anticorpos primários: coelho-anti-beclin 1 (diluído 1:500), coelho-anti-Atg5 (diluído 1:1,000), coelho-anti-atg7 (diluído 1:500), coelho-anti-LC3 (diluído 1:1,000), coelho -anti-5-LOX (diluído 1:1,000), de coelho anti-Akt (diluído 1:1,000), de coelho anti-fosfo-Akt (diluído 1:1,000), de coelho anti-mTOR (diluído 1:1,000) , coelho-anti-fosfo-mTOR (diluído 1:1,000). As membranas foram incubadas com os respectivos anticorpos primários durante 2 h à temperatura ambiente. Após lavagem três vezes em TBST, as manchas foram incubadas com o anticorpo anti-anticorpo de coelho conjugado com HRP secundário (diluído 1:5,000) ou HRP-conjugado anti-ratinho secundário (diluído 1:6,000) durante 1 h à temperatura ambiente. As manchas foram visualizadas utilizando reagentes quimioluminescentes Immobilon ocidentais (Millipore, WBKLS0500).

Como uma medida de fluxo autophagic, imunoblots para LC3 foram realizadas na ausência ou presença de inibidores da enzima do lisossoma. fluxo LC3 foi determinada pela razão do valor densitométrico de LC3-II em relação ao controlo tratado com DMSO correspondente sem tratamento medicamentoso, tal como descrito noutro local [23], [53].

2-DE e Análise de MS /MS

a análise por MS /MS 2-dE e foi realizada como descrito anteriormente [54]. Resumidamente, as células foram dissolvidas em tampão de lise (ureia 7 M, 2 M tioureia, 4% CHAPS, DTT 100 mM, 0,2% pH3-10 anfotérico, Bio-Rad, EUA) na presença de inibidor da protease (Sigma). As amostras foram aplicadas em tiras de IPG (17 cm, pH3-10NL, Bio-Rad), utilizando um método de re-hidratação passiva, e, em seguida, submetido a focagem isoeléctrica (Bio-Rad). A segunda separação dimensão foi realizada utilizando 12% de SDS-PAGE, após o equilíbrio. Os géis foram corados com CBB R-250 (Bio-Rad). A identificação e quantificação de manchas de proteínas no gel foi conseguido usando o software PDQuest (Bio-Rad).

-gel a digestão de proteínas foi realizada utilizando tripsina de grau de espectrometria de massa de acordo com as instruções do fabricante. As manchas gel foram descorados com NH 100 mM

4HCO

3/50% de acetonitrilo (ACN) e desidratado com 100% de ACN. Os géis foram então incubados com tripsina (Promega, V5280), seguido por extracção duas vezes com 50% ácido trifluoroacético /5% de ACN (TFA). Os extractos peptídicos foram secos num concentrador Speed-Vac (Thermo), e submetido a análise por espectrometria de massa usando um espectrómetro de massa Q-TOF (Micromass, Manchester, UK) equipado com uma fonte de ESI.

A imuno-histoquímica

a imuno-histoquímica foi realizada utilizando o EnVision Sistema Dako (Dako Cytomation GmbH, Hamburgo, Alemanha). secções de tecido embebido em cera de parafina consecutivos (3-5 um) foram desparafinados e reidratadas. A recuperação de antígenos foi realizada pelo pré-tratamento das lâminas em tampão citrato (pH 6,0) em um forno de microondas durante 12 min. Em seguida as lâminas foram arrefecidos até à temperatura ambiente em água desionizada. A actividade da peroxidase endógena foi extinta por incubação das lâminas em metanol contendo 3% de peróxido de hidrogénio seguido por lavagem em PBS durante 5 min, após o que as secções foram incubadas durante 1 h a temperatura ambiente com soro de cabra normal, e subsequentemente incubou-se a 4 ° C durante a noite com o os anticorpos primários. Em seguida, as secções foram lavadas com tampão de lavagem (PBS com 0,1% de albumina de soro bovino) e incubaram-se com anticorpos anti-coelho de peroxidase de rábano ligada-cabra, seguido de reacção com diaminobenzidina e de contraste com hematoxilina de Mayer.

Tumor Modelo de Xenoenxerto

protocolos experimentais foram realizados em conformidade com a directiva de 24 de Novembro de 1986 (86/609 /CEE) Comunidades Europeias, com a aprovação do Comitê de Tongji Medical College de Ética. ratos saudáveis ​​fêmea (BALB /c, 6-8 semanas de idade, não fértil e de 18-20 g cada) foram injectados por via subcutânea com células C26 (um milhão de células por ratinho). Quando os tumores eram de aproximadamente 5 mm x 5 mm de tamanho (geralmente 10 dias após a inoculação), os animais foram aleatoriamente emparelhadas combinados em dois grupos (nove ratinhos por grupo) como se segue: um grupo de controlo (injecção intraperitoneal de veículo: 5% de DMSO , 50% de PEG-400 em PBS) e um grupo ácido gambogic (injecção intraperitoneal de 8 mg de ácido /gambogic kg uma vez a cada dois dias durante seis vezes). Os volumes tumorais foram avaliados como se segue: volume do tumor (mm

3) = (comprimento x largura

2) /2. Os animais foram sacrificados 12 dias após a injecção. Os tumores foram dissecados e congelados em azoto líquido ou imediatamente fixados em formalina.

Para testar a eficácia dos tratamentos combinatórias, quando os tumores tinham aproximadamente 600 milímetros

3, os animais foram-par correspondente em quatro grupos (oito ratinhos por grupo): um grupo de controle, GA, GA + NAC, e GA + 3-MA. Grupo controle: injeção intraperitoneal de veículo: 5% de DMSO, 50% PEG-400 em PBS. tratamento com GA: injecção intraperitoneal de 8 mg /kg de ácido gambogic uma vez a cada dois dias durante dez vezes. NAC tratamento: os animais receberam, quer água desionizada ou água contendo NAC (7 mg /ml; neutralizada para pH 7,4 com NaOH); Assumiu-se um peso médio de ratinho de 25 g e o consumo de água diário de 6,7 mL, a dose diária estimada materna foi de 1,9 g /kg /d [55]. tratamento 3-MA: injecções subcutâneas de solução salina (controlo) ou de 1 mg /kg de 3-MA, e a injecção foram repetidos todos os dias [56]. Os volumes tumorais foram avaliados os seguintes: volume do tumor (mm

3) = (comprimento x largura

2) /2

análise estatística dos dados

As comparações entre dois grupos eram. realizada pelo teste de Student. A significância estatística foi definida como

* p 0,05;

** p 0,01;

*** p 0,001

Resultados

GA induz a apoptose em células de cancro colorectal

Para determinar o efeito da. GA em células de cancro colorectal, as células HCT116 e SW620 foram tratadas com diferentes concentrações de GA durante 12 h, 24 h ou 36 h, respectivamente. ensaio MTT foi utilizado para determinar a viabilidade celular. Como mostrado na Figura 1A, o tratamento com GA, resultou na inibição de proliferação de células HCT116, tanto uma dose e forma dependente do tempo com IC

50 valores de cerca de 1,1 uM, 0,6 uM e 0,5 uM, durante 12 h, 24 h e 36 h, respectivamente. células SW620 mostrou apenas inibição dose-dependente com um IC

50 valor de cerca de 2 mM. Além disso, o efeito da GA em morte de células de cancro colo-rectal foi examinada utilizando isotiocianato de Anexina-V de fluoresceína (FITC) e iodeto de propídio (PI) de dupla marcação, bem como ensaios de TUNEL. Como mostrado na Figura 1B, a percentagem de células positivas para a Anexina-V, o que é indicativo de células mortas, foi significativamente aumentada após o tratamento com GA. Estes resultados foram consistentes com os obtidos a partir do ensaio de TUNEL (Figura 1C). A seguir, nós examinamos se a morte celular induzida por GA era dependente da caspase. Tal como mostrado na Figura 1D, clivada da caspase-3 foi acumulado após tratamento com GA. Além disso, a morte celular induzida GA pode ser acentuadamente invertida por um inibidor da pan-caspase, Z-VAD-fmk (Figura S1), sugerindo que o AG induziu uma morte celular por apoptose dependente da caspase

.

(A) e HCT116 células SW620 foram tratadas com concentrações crescentes de GA durante 12 h, 24 h ou 36 h, e o índice de viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT. células HCT116 e SW620 (B) foram tratadas com concentrações crescentes de GA durante 24 h, a apoptose das células foi detectada por isotiocianato de anexina-V de fluoresceína (FITC) e iodeto de propídio (PI) a coloração dupla seguida por análise de citometria de fluxo. Dot visor gráfico da anexina-V-FITC de fluorescência em função de propídio fluorescência iodeto é mostrada em escala logarítmica. As células vivas resultados negativos tanto para anexina V-FITC e PI. Populações de testes anexina V positiva /PI negativo foram classificados como células em apoptose em fase inicial, e as células double-positivos foram classificados como células mortas. diagrama de barras que mostra a percentagem de células mortas após diferentes tratamentos. células HCT116 e SW620 (C) foram tratadas com concentrações crescentes de GA durante 24 h, as células mortas foram detectados por ensaio de TUNEL. As células positivas TUNEL foram contadas a partir de pelo menos 100 campos aleatórios. (D) A análise de imunotransferência de clivada da caspase-3 a partir de lisados ​​de células HCT116 e SW620 tratados com várias concentrações de GA durante 24 h, tratada com um ou GA ^ M durante 12 h e 24 h.

GA inicia autofagia em células de câncer colorretal

Para entender melhor o efeito anti-câncer do GA, a ultra-estrutura das células HCT116 tratados com GA ou DMSO ( 0,1%) foi analisada por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Numerosos vacúolos ligados à membrana, característica de autofagossomas, foram observados no citoplasma de células tratadas com GA, ao passo que vacúolos ligadas à membrana pode raramente ser encontrado nas células tratadas com DMSO (Figura 2A). Além disso, a coloração com alaranjado de acridina foi utilizado para analisar a formação de organelos vesiculares ácidas (avos), uma outra característica importante da autofagia. Tal como mostrado na Figura 2B, as células HCT116 tratadas com GA resultou na formação de óbvio avos amarelo-laranja em comparação com as células tratadas com DMSO.

(A) painéis superiores. Micrografias de transmissão de electrões representativos que descrevem ultra-estruturas de células HCT116 tratadas com DMSO (controlo, 0,1%) ou 1 uM GA durante 24 h. painéis inferiores. As células com vacúolos autofágicos foram definidas como células que tinham cinco ou mais vacúolos autofágicos. A percentagem das células com autofagossomas e o número médio de vacúolos por célula foram analisados ​​a partir de pelo menos 100 campos escolhidos aleatoriamente de MET. Barras de escala: 1 m; 100 nm (ampliações indicados). (B) coloração com acridina laranja em células HCT116 tratadas com DMSO (controlo, 0,1%), de 0,5 uM ou 1,0 uM GA GA durante 12 h. Todos os dados são representativos de três experiências independentes. ** P . 0,01

A localização e agregação de LC3 é conhecido por ser importante para o transporte e maturação do autophagosome [57]. Portanto, o plasmídeo pEGFP-LC3 foi transitoriamente transfectado em ambas as células HCT116 e SW620 para confirmar ainda se GA inicia a autofagia em células de cancro colorrectal. Tal como indicado na Figura 3A, a percentagem de células GFP-LC3-positivos e quantidade média de pontos de GFP-LC3 foram ambos significativa aumentada após tratamento com GA de um modo dependente da dose. A forma lipidada da LC3 transformando de LC3-I lc3-II está correlacionada com a extensão da formação autophagosome [57]. GA também marcadamente aumentada do volume de LC3-I lc3-II, o qual foi adicionalmente acumulado na presença de E64D e pepstatina A (ambos os inibidores da protease lisossómica) (Figura 3B), o que sugere que poderia aumentar GA fluxo autophagic. Além LC3, as expressões de uma série de proteínas relacionadas autofágicos, incluindo p62, beclin 1, Atg7 e Atg12-Atg5, têm sido mostrados para ser alterada durante autofagia [23]. Por isso, foi investigada a expressão destas proteínas mediante tratamento com GA. Como mostrado na Figura 3C, GA regulada positivamente a expressão de um beclin, Atg7 e Atg12-Atg5 de uma forma dependente da dose, enquanto que a acumulação de p62 foi diminuída. Estes resultados demonstraram ainda que o GA pode induzir a formação de autofagossomas em células de cancro colorrectal.

(A) células HCT116 e SW620 transfectadas com um plasmídeo pEGFP-LC3 foram tratados com as concentrações indicadas de GA durante 24 h. As células foram definidas como positivas se tivessem 5 ou mais pontos de GFP-LC3 no citoplasma. A percentagem de células com os pontos de GFP-LC3 e o número médio de pontos de GFP-LC3 por célula foram analisados ​​a partir de pelo menos 100 campos aleatórios. (B) Análise de imunotransferência da conversão de LC3-I lc3-II em células HCT116 e células SW620 depois tratados com as concentrações indicadas de GA durante 24 h, ou com 1,0 um de GA durante 12 h e 24 h na ausência ou na presença inibidores de lisossomais (E64D e pepstatina cada a 10 ug /ml). Análise (C) de imunotransferência do nível de Atg12-Atg5 conjugado, Atg7, beclin 1 e p62 expressão depois tratada com concentrações indicadas de GA durante 24 h, ou com 1 uM de GA durante 12 h e 24 h. Actina serviu como um controlo de carga. * P 0,05; ** P . 0,01

Bloqueio de Autophagy Melhora GA-apoptose induzida

Considerando o papel paradoxal de autofagia em promover a morte celular ou sobrevivência, nós ainda tratado células do câncer colorretal com um inibidor autofagia utilizada (3-MA), quer isoladamente ou em combinação com GA para determinar o papel funcional de autofagia na apoptose induzida por GA. Como mostrado na Figura 4A, pré-tratamento de células HCT116 com 3-MA aumentou significativamente o efeito da supressão proliferativa induzida por GA. Consistente com isto, os resultados da Anexina-V /PI coloração dupla (Figura 4B) e ensaios de TUNEL (Figura 4c) também mostram que, em combinação com GA 3-MA exibiram um efeito pró-apoptótico mais forte em comparação com sozinho GA. Além disso, a transfecção transiente com Atg5- ou beclin1-alvo ARNsi para ablação Atg5 ou beclin uma expressão podem inibir a acumulação de LC3-II induzida por GA, assim como aumentar os efeitos anti-proliferativas e pro-apoptóticos de GA em células HCT116 (Figura 4D-G). Estes dados sugerem que a autofagia protege as células de cancro colorrectal-tratados GA de morte celular por apoptose.

(A-C) As células HCT116 foram tratadas com controlo de veículo (1 ‰ DMSO, Controlo), 3-MA, 1 uM GA (GA), ou 1 uM na presença de GA 3-MA (GA + 3-MA) ​​durante 24 h. E, em seguida, a viabilidade celular foi avaliada por um ensaio MTT (A) e o efeito apoptótico foi detectado por coloração de PI /anexina-V (B) e os ensaios de TUNEL (C). (D) de detecção de imunotransferência da expressão da Atg5, beclin-1 e em células HCT116 LC3 tratadas com GA no presente ou ausente com siATG5 siBeclin ou 1. (E-G) As células HCT116 foram tratadas com Lipofectamine 2000 (de controlo), o controle siRNA (siControl), siATG5 (siATG5), 1 mM GA (GA), GA no controle de presença siRNA (GA + siControl), siATG5 (GA + siATG5) ou siBeclin1 (GA + siBeclin 1) por 24 h. E, em seguida, a viabilidade celular foi avaliada por um ensaio MTT (E) e o efeito apoptótico foi detectado por coloração de PI /anexina-V (F) e os ensaios de TUNEL (L). * P 0,05; ** P . 0,01

Redox desregulação foi induzida após tratamento GA

proteínas

Para explorar o mecanismo pelo qual GA induz a autofagia, nós perfilado diferencialmente expressos em células HCT116 tratados com ou sem GA. Ao comparar 2-DE padrões, as proteínas expressas diferencialmente foram considerados como estatisticamente significativos (p 0,05), se ambos os dois critérios seguintes foram satisfeitas: 1) as alterações de intensidade de 2,0 vezes e 2) observadas em pelo menos três experiências individuais. 25 pontos que se encontraram foram seleccionados estes critérios e analisadas utilizando espectrometria de massa em tandem ESI-Q-TOF, e um total de 27 proteínas foram identificadas (Fig. 5A, Tabela I). Os dados de MS /MS foram consultados, utilizando o algoritmo de MASCOT de busca contra a base de dados de sequência de proteína Expasy. As proteínas foram identificadas com base em vários critérios, incluindo pi, MW, a identificação de péptidos, e a cobertura (Tabela I). Destes, 13 proteínas foram regulados negativamente Considerando que 14 proteínas foram pós tratamento GA (Fig. 5D)-regulada. As proteínas identificadas foram divididos em vários grupos com base na sua localização subcelular e funções biológicas (Fig. 5B e 5C). As proteínas foram encontrados para ser localizada no citoplasma (59%), o núcleo (4%), mitocôndria (15%), da membrana celular (11%), ou retículo endoplasmático (11%). A implicados papéis na proliferação e apoptose (37%), a regulação redox (22%), o metabolismo lipídico (15%), glicometabolismo (15%), translacional A modificação de proteínas (4%), e chaperona molecular (7%). Após a proliferação e apoptose, as proteínas mais próximos alterados foram envolvido na regulação redox mediante tratamento com GA, sugerindo ROS podem estar envolvidos na autofagia induzida por GA.

(a) Imagens de gel bidimensionais representativas do controlo e GA tenha sido tratada com (1 uM, 24 h), as células HCT116. extratos de proteínas totais foram separados em pH 3-10 não-lineares imobilizado tiras de gradiente de pH na primeira dimensão seguido por 12% SDS-PAGE na segunda dimensão e visualizados por coloração CBB. (B) As proteínas identificadas foram categorizados em grupos de acordo com suas localizações subcelulares. (C) 27 proteínas distintas foram classificados em 6 grupos com base nas suas funções biológicas. mapa (D) cluster de proteína gerada pelo software de cluster. Expressão de proteínas no controlo era constante a 0, enquanto que as proteínas regulados positivamente em células tratadas com GA está no vermelho, e as proteínas são regulados negativamente em verde. A intensidade da cor verde ou vermelho corresponde ao grau de alteração, respectivamente, de acordo com a faixa de cor na parte inferior da figura.

ROS é necessária para Autophagy induzida por GA <