(SCLC) é caracterizada por rápida progressão e baixas taxas de sobrevivência. Por conseguinte, os novos agentes terapêuticos são urgentemente necessários para esta doença. A capsaicina, o ingrediente ativo das pimentas, exibe actividade anti-proliferativa em próstata e câncer epidermóide

in vitro

. No entanto, a actividade anti-proliferativa da capsaicina não foi estudada em humanos CPPC. O presente manuscrito preenche este vazio de conhecimento e explora o efeito anti-proliferativo de capsaicina em SCLC

in vitro

e

In vivo

.

Metodologia /Apreciação Principais

ensaios de BrdU e PCNA ELISA mostrou que a capsaicina exibe forte actividade anti-proliferativa em quatro linhas de células SCLC humanas. Além disso, a capsaicina potente suprimiu o crescimento de tumores H69 SCLC humanos

in vivo

como comprovado por ensaios CAM e modelos de ratos nus. A segunda parte do nosso estudo tentou fornecer uma visão sobre os mecanismos moleculares subjacentes à actividade anti-proliferativa de capsaicina. Descobrimos que a actividade anti-proliferativa de capsaicina está correlacionada com uma diminuição na expressão de genes que respondem a E2F proliferativas, como a ciclina E, timidilato-sintase, Cdc25A e Cdc6, tanto no ARNm e os níveis de proteína. O factor de transcrição mediada E2F4 a actividade anti-proliferativa de capsaicina. A ablação de níveis E2F4 por metodologia siARN suprimida a paragem em G1 induzida por capsaicina. ensaios ChIP demonstrado que a capsaicina causou o recrutamento de E2F4 e p130 em promotores de proliferação E2F-responsivos, inibindo assim a proliferação celular.

Conclusões /Significado

Nossos resultados sugerem que os efeitos anti-proliferativa de capsaicina poderia ser útil na terapia de CPPC humanos

Citation:. Brown KC, Witte TR, Hardman WE, Luo H, Chen YC, Carpenter AB, et al. (2010) Capsaicina Mostra Anti-proliferativa Atividade contra Human pequeno Cell Lung Cancer em cultura de células e modelos de ratinhos nus através do E2F Caminho. PLoS ONE 5 (4): e10243. doi: 10.1371 /journal.pone.0010243

editor: Dong-Jin Yan, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 08 de janeiro de 2010; Aceito: 24 de março de 2010; Publicação: 20 de abril de 2010

Direitos de autor: © 2010 Brown et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por um Centro de Biochemical Research Excellence Pilot Research Grant do National Institutes of Health (número de concessão 5P20RR020180); a Fundação Research Association arranque Grant fabricantes farmacêuticos; a comunhão Marshall University ADVANCE; uma bolsa de iniciação científica Grant-in-Aid da National Aeronautics and Space Administration; e um Prêmio Jovem Cientista Clínica pela hospedeiros de bordo Medical Research Institute (número de concessão 82.115). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) é uma neoplasia agressiva representando 13% de todos os casos de câncer de pulmão, com uma taxa de sobrevida em 5 anos total inferior a 5% [1], [2]. Tais estatísticas sublinham a necessidade de novas estratégias de tratamento para esta doença. Os avanços recentes na compreensão básica de eventos moleculares envolvidos na progressão SCLC levaram à identificação de agentes potenciais para intervenção terapêutica, [2], [3], [4], [5]. Estas estratégias incluem o factor de crescimento /inibidores específicos do receptor, inibidores de proteína-quinase e agentes nutricionais. A identificação de agentes nutricionais que exibem actividade anti-proliferativa podem representar uma nova via terapêutica, em SCLC humano.

A capsaicina, o ingrediente activo principal de pimenta, é utilizado topicamente para tratar a dor e a inflamação associada com uma variedade de doenças [6], [7]. Quimioprevenção estudos demonstram que a capsaicina pode suprimir a carcinogénese da pele, cólon, pulmão, próstata língua e [8], [9], [10], [11], [12]. Embora esses estudos têm abordado o potencial quimiopreventivo de capsaicina, poucos têm abordado o seu potencial como um agente anti-cancro. Por exemplo, a capsaicina tem sido demonstrado que induz a apoptose no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), células de leucemia de células T, carcinoma esofágico, astroglioma, próstata, cólon e cancro gástrico em modelos de cultura de células [13], [14], [15], [16], [17]. Além disso, a administração de capsaicina foi mostrado para suprimir o crescimento do tumor do cancro da próstata em modelos de ratinhos nus [10], [18].

Além de causar apoptose, a capsaicina foi encontrada para induzir a paragem do ciclo celular no cancro humano células. Vários estudos convergentes têm mostrado que a paragem em G1 induzida por capsaicina em CE 81T /VGH células de carcinoma epidermóide humano e células de cancro da próstata ocorrer através da indução de p53 e o inibidor de p21 dependente de ciclina-cinase (CDK) [10], [17], [19 ], [20], [21]. O tratamento de células HL-60 leucémicas de humano com capsaicina causou a paragem em G1 através da inibição da actividade de CDK2. A actividade anti-angiogénica de capsaicina é atribuída à sua capacidade para causar a paragem em G1 em células endoteliais. paragem em G1 induzida por capsaicina está correlacionado com a supressão dos níveis de ciclina D1, a inibição de actividade de cdk4 e a fosforilação de Rb em células endoteliais e de cancro da mama [21], [22]. Estes dados levantam a possibilidade de que a actividade anti-proliferativa de capsaicina é mediada pelos seus efeitos sobre a via de E2F-Rb.

A família E2F de factores de transcrição, que consiste em oito genes de membros (E2F1-E2F8), execuções um papel central na regulação da progressão do ciclo celular e a proliferação de células [23], [24], [25], [26]. Estes E2F foram ainda subclassificados em dois grupos com base em suas propriedades reguladoras da transcrição de genes promotores. E2F1, E2F2 e E2F3 são muitas vezes referidos como “activadores” E2F porque transcricionalmente activar genes alvo E2F proliferativas, tais como a ciclina E, Cdc25A Cdc6 e [25], [27], [28], [29]. Estes genes alvo, em seguida, induzir a entrada das células na fase S, promovendo assim a progressão do ciclo celular. A segunda subclasse, E2F4 e E2F5, são referidas como os “E2F repressoras” porque elas reprimem a transcrição de genes alvo E2F proliferativas. membros da família E2F E2F6, E2F7 e E2F8 são também repressores. E2F7 e E2F8 são os membros mais recentemente identificados desta família, e muito menos se sabe sobre sua função e regulação [25]. Apesar do facto de que todos os E2F transcricionalmente activos ligam-se ao mesmo local de reconhecimento de ADN de promotores alvo, eles possuem diferentes papéis funcionais na célula [26], [29].

estudos nos últimos anos têm demonstrado que a actividade de E2F é rigorosamente regulamentada pela família de proteínas de bolso, ou seja, Rb, p130 e p107. E2F 1-3 pode ligar-se à proteína Rb, mas E2F 4 e 5 ligam-se preferencialmente a P107 e P130 proteínas [24], [25], [26], [29], [30]. As proteínas da família Rb se ligar a uma porção da região de activação da transcrição de E2F, reprimir eficazmente a sua actividade. Assim, as células quiescentes contêm altos níveis de proteínas E2F ligados a Rb, p130 e p107. O início de estímulos mitogênica causa fosforilação de rb, p130 e p107 por ciclina D e E e seus quinases associadas. A fosforilação de Rb, P107 e P130 resultados na sua inactivação e dissociação das proteínas E2F [25]. Estes E2F livres, subsequentemente, se ligam a promotores alvo proliferativas, como a ciclina E, timidilato-sintase (TS), Cdc25A e Cdc6, que regulam a progressão do ciclo celular [31], [32]. Destes, E2F1-3 estimular a transcrição dos genes acima referidos, enquanto que E2F4 e E2F5 reprimir a transcrição [25]. A maioria dos SCLC humano são deficientes na proteína Rb [3]. Portanto, é provável que os outros dois bolso proteínas, p107 e p130, desempenham um papel vital na regulação E2F e proliferação celular no CPPC humanos.

A actividade anti-proliferativa de capsaicina não foi estudado no CPPC humanos . O presente manuscrito preenche esta lacuna de conhecimento e mostra pela primeira vez que a capsaicina pode potencialmente inibir a proliferação de CPPC humanos utilizando cultura de células múltipla e

in vivo

modelos. Estudos anteriores demonstraram que a maioria dos CPPC humanos têm mutações em p53 e Rb, bem como uma desregulação na via de E2F-RB [3], [4], [5]. Dados obtidos a partir de microarrays, amostras de tecido de pacientes com câncer de pulmão e linhas de células de câncer de pulmão humanos indicam que moléculas reguladoras do ciclo celular, como E2F1-5, p130, Skp2, ciclina D1 e p16, contribuir para o crescimento e progressão de tumores de pulmão [33] . Portanto, temos a hipótese de que a capsaicina exibe atividade anti-proliferativa em CPPC humanos através da regulação da actividade da família E2F de fatores de transcrição.

O presente manuscrito é um estudo inicial teve como objetivo investigar a atividade anti-proliferativa de capsaicina em SCLC humano em ambos os modelos de cultura de células e em animais. Aqui, demonstramos pela primeira vez que a capsaicina exibe potente actividade anti-proliferativa em quatro linhas de células SCLC humanas

in vitro

. Além disso, os nossos resultados mostram que a capsaicina suprime o crescimento de tumores SCLC humanas em modelos de CAM e ratos nus. Nós também exploraram a contribuição da família E2F de factores de transcrição nos efeitos inibidores do crescimento de capsaicina em células SCLC. Observamos que a capsaicina inibe a proliferação de CPPC humanos através de um membro específico da família E2F, a saber E2F4. A ablação de níveis E2F4 por duas siARN independente foi encontrada para reverter o efeito anti-proliferativo de capsaicina. Além disso, a paragem do crescimento induzida por capsaicina foi associada com uma diminuição na expressão dos genes alvo de E2F ciclina E, TS, Cdc25A e Cdc6. Finalmente, (ChIP) análise de IP cromatina das células SCLC humanas demonstraram que o tratamento de capsaicina diminuiu o recrutamento de E2F activadores, isto é, E2F2, E2F3 e para promotores proliferativa, como a ciclina E, TS, Cdc25A e Cdc6. Por outro lado, o recrutamento de E2F4 repressor foi reforçada pela capsaicina tratamento. Tomados em conjunto, os nossos dados sugerem que a capsaicina exibe potente actividade anti-proliferativa em células SCLC humanas por diferencialmente regulação da família E2F de factores de transcrição. Além disso, nossos resultados levantam a possibilidade de que agentes nutricionais, como a capsaicina pode ser útil para o tratamento de Quimioterapia humano.

Materiais e Métodos

camundongos nus

Ética Declaração

foram obtidos a partir Charles River Laboratories e aclimatados durante uma semana. Eles foram alojados em gaiolas autoclavadas com o

ad libitum

acesso a comida e água em racks HEPA-filtrado e acompanhada de perto pela equipe da unidade animal. Todos os procedimentos envolvendo ratos nus foram conduzidos de acordo com as diretrizes Animal Care e uso em uma instalação credenciada pela Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care (AAALAC) Internacional e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) de Joan C. Edwards Escola de Medicina da Universidade Marshall (protocolo nº 371).

Cultura de células e Transfecção

As linhas de células SCLC humanas NCI-H69, NCI-H82 (a seguir referidas como H69 e H82, respectivamente), e DMS53 DMS114 foram obtidas da American Type Culture Collection, Rockville, MD. Estas linhas celulares foram escolhidas porque foram extensivamente estudada, e as suas características físicas moleculares e assemelham-se muito em pacientes SCLC. Gazdar et ai., (1985), originalmente isolado e caracterizado as linhas de células H69 e H82 [34], [35]. Eles descobriram que a morfologia e características de crescimento das células H69 e H82 eram típicas de células tumorais em pacientes com SCLC encontrados. Além disso, o perfil bioquímico destas células (presença de descarboxilase de L-dopa, marcadores neuroendócrinos, imunorreactividade semelhantes à bombesina, enolase específica dos neurónios e altas concentrações de isoenzima cerebral da creatina quinase) verificou-se ser idêntico a tumores SCLC humanas encontradas em pacientes . Da mesma forma, as células foram DMS114 DMS53 e isolado pela primeira vez a partir de biópsias SCLC humanas e caracterizado por Pettengill et al., (1980). Eles descobriram que tanto DMS53 DMS114 e manteve o perfil físico, morfológicas e bioquímicas de tumores SCLC humanas observados na clínica [36].

H69 e H82 foram mantidas em meio RPMI-1640 suplementado com 2 mM de glutamina, 100 unidades /ml de penicilina, 50 ug /ml de estreptomicina e soro bovino fetal a 10% (FBS). DMS53 células SCLC humanas foram cultivadas em 1 MB752 meios de Waymouth /contendo 2 mM de glutamina, 100 unidades /ml de penicilina, 50 ug /ml de estreptomicina e 10% de FBS. Obtiveram-se os meios de cultura para células SCLC humanas DMS114 era idêntico ao DMS53, excepto que os meios continham um adicional de bicarbonato de sódio a 2%.

As células primárias humanas normais epiteliais brônquicas NHBE) (e células epiteliais pequenas das vias respiratórias (SAEC) da Lonza Technologies, Suíça. NHBEs foram mantidas em meio contendo factores de crescimento BEBM. Da mesma forma SAECs foram mantidas em meios SABM suplementado com factores de crescimento. Ambos BEMB SABM e meios foram preparados de acordo com as instruções do fabricante. Todas as experiências utilizando NHBEs e SAECs foram realizadas entre as passagens 3-8 [31].

foram realizadas Ensaio MTT

ensaios MTT como descrito por Heo et al., (1990). As células H69 e H82 foram plaqueadas em placas de 96 poços a uma densidade de 50000 células /poço. células DMS53 DMS114 e foram plaqueadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5000 células /poço. As placas foram incubadas durante 24 horas para permitir a religação completa das células. Subsequentemente, as células foram tratadas com 50? M capsaicina durante 24 horas, 48 ​​horas ou 72 horas. Após os pontos temporais indicados, 50 ul de solução de MTT (5 mg /ml) foi adicionada a cada poço, e as placas foram incubadas durante 4 horas a 37 ° C [37]. Em seguida, o meio foi aspirado e 150 mL de DMSO foi adicionado a cada poço para solubilizar os cristais de formazano. A absorvância das placas foi medida num leitor de ELISA (Índice de referência, BioRad) a um comprimento de onda de 540 nm. Cada amostra foi executada em triplicado, e toda a experiência foi repetida duas vezes.

BrdU e PCNA Ensaios de Proliferação

Bromodeoxiuridina (BrdU) enzima de marcação linked immunosorbent assay (ELISA kits) foram obtidos de Roche Biochemicals e foram utilizados para examinar os efeitos da capsaicina sobre a proliferação de quatro linhas de células humanas de SCLC, H69, H82, DMS114 e DMS53. BrdU é um análogo da timidina nucleótido que é incorporado durante a fase S (em vez de timidina) apenas no ADN das células em proliferação [31], [32], [38].

H69 e H82 células foram plaqueadas em placas de 96 poços a uma densidade de 50000 células /poço. células DMS53, DMS114, SAEC e NHBE foram plaqueadas em placas de 96 poços a uma densidade de 10.000 células /poço. DMS53 DMS114 e foram incubadas com meio isento de soro durante 36 horas para remover o efeito de factores de crescimento endógenos. Depois de 36 horas, estas células foram então re-estimuladas com SBF a 10%, na presença ou ausência das concentrações indicadas de capsaicina durante 18 horas, que é o tempo requerido para a entrada da fase S [31], [32], [38] . O NHBEs SAECs e foram tornadas quiescentes em meio basal contendo ¼ a quantidade (v /v) de factores de crescimento durante 24 horas (CIT). Subsequentemente, as células foram estimuladas com meio completo contendo o volume total de factores de crescimento durante 18 horas como descrito anteriormente. A taxa de incorporação de BrdU foi medida pela técnica de ELISA, e a percentagem de células na fase S quantificada por avaliação colorimétrica (λ = 405 nm). A absorvância de células tratadas com FBS a 10% ou meio completo foi assumido ser 100%, e diminui induzida por capsaicina em fase S foram calculadas como uma percentagem das células tratadas de controlo de FBS. Cada amostra foi testada em triplicado, e o ensaio foi repetido duas vezes.

A proliferação celular foi também avaliada através da medição dos níveis de antigénio nuclear de proliferação celular (PCNA), utilizando um kit de ELISA da Calbiochem PCNA. H69, H82, DMS114 e DMS53 foram plaqueadas em placas de 96 poços e tratadas de um modo idêntico como o ensaio BrdU descrito acima. Subsequentemente, o meio foi removido, e o tampão de ressuspensão (50 mM de Tris, pH 8, EDTA 5 mM, 0,2 mM de PMSF, 1 ug /mL de pepstatina, 0,5 ug /ml de leupeptina) foi adicionado às células. O nível de PCNA nas células foi quantificada pela medição da absorvância a 405 nm, de acordo com o protocolo do fabricante. Cada amostra foi testada em duplicado, e o ensaio foi repetido duas vezes para cada tipo de célula.

foram usadas análise do ciclo celular

células SCLC H69 para análise do ciclo celular, utilizando uma modificação do iodeto de propídio técnica [15], [39]. Resumidamente, 5 x 10 5>

lisados ​​e Western Blotting

Os lisados ​​de cada linha celular foram feitas usando a base-NP-40 protocolo de lise [ ,,,0],31], [38], [40]. DMS114 células foram cultivadas em pratos de 100 cm a cerca de 70% de confluência. As células foram tornadas quiescentes por incubação em meio isento de soro durante 36 horas. Subsequentemente, as células foram re-estimuladas com SBF a 10%, na presença ou ausência de doses indicadas de capsaicina durante 18 horas. As células foram colhidas e lavadas três vezes com PBS gelado. As células foram então lisadas com tampão de M2 ​​de lise (Tris 20 mM, pH 7,6, 0,5% de NP-40, NaCl 250 mM, EGTA 3 mM, EDTA 3 mM, 4 fiM de DTT, PMSF 5 mM, fluoreto de sódio 1 mM, de sódio 1 mM ortovanadato, 25 ug /mL de leupeptina, 5 ug /mL de pepstatina, 5 ug /ml de aprotinina, 25 ug /mL de inibidor de tripsina-quimotripsina). Setenta microlitros de tampão de lise foi adicionada por cada 20 uL de volume da célula embalada. O lisado foi girado a 4 ° C durante 30 minutos e, subsequentemente, centrifugadas a 15000 g durante 15 minutos a 4 ° C. O sobrenadante foi recolhido para análise posterior. A concentração de proteína do ligado foi medida usando um reagente de Bradford (Bio-Rad Labs). Uma alíquota de cento e cinquenta microgramas de proteína foi corrida num gel de SDS-PAGE 10% e transferidas para membranas de nitrocelulose (BioRad Labs).

A expressão relativa das proteínas indicadas foi analisada por Western blotting. monoclonal e E2F1 E2F2-6 anticorpos policlonais foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology. Os anticorpos monoclonais para TS, Cdc25A Cdc6 e também foram obtidos a partir de Santa Cruz Biotechnology. O anticorpo monoclonal para a ciclina E foram obtidas da BD Biosciences. anticorpo monoclonal β-actina foi obtido a partir de Sigma Chemical Company, EUA. O anticorpo policlonal de GAPDH foi obtido a partir de Trevigen, Inc. Os anticorpos secundários foram obtidos de Pierce biotecnologias. O sinal obtido nas experiências de Western blot foi detectado pelo SuperSignal Oeste Dura Substrato duração prolongada (Pierce Biotechnologies). Os resultados dos ensaios de transferência de Western foram quantificados por análise densitométrica (sistema de documentação de gel BioRad) utilizando o software de análise Quantidade 4.5.2.

embrião de galinha Membrana Corioalantóide (CAM) Ensaio

pathogen- específico (SPF) ovos de galinha férteis (Charles River Laboratories, North Franklin, CT) foram incubados a 37,5 ° C com 75% de humidade relativa, e continuamente rodado lentamente por uma turner ovo automático (GQF Manufacturing Company, Savannah, GA). No dia 9, os ovos foram candled e janelas abertas na casca para expor o CAM [41]. células H69 (3 x 10

6) foram suspensos em 100 ul de meio isento de soro frio, misturou-se com 100 ul de Matrigel frio BD matriz (BD Biosciences, San Jose, CA) e 50 uM de capsaicina. Estas células foram aplicadas para a CAM de cada embrião de galinha. Os ovos foram incubados a 37 ° C durante 4 dias antes de implantes de tumor foram removidos, pesados ​​e fotografados. Um total de 12 ovos foram ensaiados para cada grupo [41].

Estudos antitumorais em ratinhos nus

Oito ratinhos nus do sexo masculino com 4 semanas de idade foram obtidos a partir de Charles River Laboratories e aclimatizados durante um semana. Eles foram alojados em gaiolas autoclavadas com o

ad libitum

acesso a comida e água em racks HEPA-filtrado e acompanhada de perto pela equipe da unidade animal. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes Animal Care e uso em uma instalação credenciada pela Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care (AAALAC) Internacional e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) de Joan C. Edwards Faculdade de Medicina da Universidade Marshall (protocolo nº 371).

H69 células foram colhidas e re-suspensas em uma solução 1:01 (v /v) de meios livres de soro e matriz Matrigel (BD Biosciences). Dois milhões de células em 100 uL foram injectados por via subcutânea entre as escápulas de cada ratinho [42]. Após os tumores atingiram 100 mm

3, os ratos foram transferidos para controlar a dieta AIN-76A com base contendo 10% de óleo de milho, até os tumores atingiram 800 mm

3. Subsequentemente, os ratos foram divididos em dois grupos. O grupo de tratamento (N = 4) foi alterada para uma dieta contendo 50 mg de capsaicina /kg de alimento (que é cerca de 10 mg de capsaicina /kg de peso corporal de rato por dia). O grupo controle (N = 4) foi continuada na dieta controle. Os ratos foram pesados ​​uma vez por semana. O seu consumo de alimento foi monitorizado por pesagem a restos de comida, uma vez por semana. A administração de capsaicina causou nenhum desconforto ou perda de peso em ratos. Além disso, a ingestão de alimentos foi semelhante entre o controle e os ratos tratados com capsaicina.

O tratamento medicamentoso foi mantido até tumores do grupo de controlo atingiu 2.000 milímetros

3. comprimentos (L) dos tumores, as larguras (W) e da altura (h) foram medidos diariamente (6 dias por fora de uma semana) para cada rato. Os volumes tumorais foram calculados como (L x W x H) /2 [43], [44]. Após a eutanásia dos ratos, os tumores foram excisados. Metade do tumor foi congelado rapidamente em azoto líquido e usada para fazer lisados. Os lisados ​​de tumor foram preparados utilizando o t-Por tampão de lise (Pierce Biotechnology), de acordo com o protocolo do fabricante [38]. A outra metade do tumor foi fixada em formalina e utilizado para imuno-histoquímica.

Clivagem de Caspase Ensaio

ensaio de clivagem de caspase foi realizada com lisados ​​tumorais preparados a partir de murganhos de controlo e murganhos tratados com capsaicina usando o caspase -3 kit de clivagem (Chemicon, Temecula). Os lisados ​​de tumor foram preparados utilizando o t-Por tampão de lise como acima descrito. Uma alíquota de 60 ul de lisado foi utilizado para cada reacção. Além disso, 60 ul de H69 tratados com cisplatina lisado (feita de tratamento de células H69 com 30 uM de cisplatina durante 72 horas) foi utilizado como controlo positivo, de acordo com o protocolo do fabricante. Cada amostra foi testada em duplicado, e o ensaio foi repetido duas vezes para cada tipo de célula.

Imunohistoquímica

A imunocoloração foi realizada utilizando o M.O.M. kit de coloração (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). secções embebidas em parafina de tecido de xenotransplante de rato H69 (4 uM) foram desparafinados em xileno e re-hidratadas em etanol posteriormente. As secções foram submetidas a tratamento de recuperação de antigénio usando o kit Antigen retrival (BioGenex Inc.), de acordo com o protocolo do fabricante. As secções foram depois tratadas com o tratamento com proteinase K (20 ug /ml) durante 15 minutos e extinguiu-se de peroxidases endógenas em 0,3%

solução H

2O 2 em metanol durante 30 minutos. As secções foram bloqueadas usando o bloqueio avidina-biotina kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA). As secções foram incubadas com anticorpo anti-PCNA (BioGenex Inc.) anticorpo monoclonal primário (diluição 1:100) durante uma hora à temperatura ambiente. As secções foram lavadas em PBS para remover o excesso de anticorpo e desenvolvidos usando o M.O.M. e peroxidase kit de DAB, obtido a partir de Vector Laboratories (Burlingame, CA). As secções foram contrastadas com hematoxilina, desidratadas, montadas em Permount montagem Médio (Fisher Biotech) e fotografados em Olympus BX41 microscópio brilhante campo. Hematoxilina e eosina (H e E) imagens foram fotografadas em 40X. coloração PCNA foi fotografada no 1000X ampliação usando óleo. células positivas para PCNA, que são as células em proliferação, foram quantificados por contagem de 5 campos de 100 células. Os dados são apresentados como a percentagem de células positivas PCNA.

siRNA transfecção e Ensaios

quimicamente sintetizada, de cadeia dupla siRNA para E2F1, E2F2, E2F3, E2F4, E2F5 e E2F6 foi comprado de Santa Cruz Biotechnology. As experiências de transfecção foram realizadas em células H69 e DMS114 [31], [45]. assíncronos células foram colhidas e re-plaqueadas em placas de 96 poços a cerca de 40% de confluência em meio de crescimento contendo 10% de FBS, na ausência de antibióticos. A transfecção do siARN acima mencionado foi realizada utilizando reagente Oligofectamine (Invitrogen Corporation), de acordo com o protocolo do fabricante. Dezoito horas após a transfecção, as células foram tornadas quiescentes durante 36 horas, por incubação em meio sem soro. Subsequentemente, as células foram tratadas com 10% de FBS na presença de 50 uM de capsaicina durante 18 horas. A capsaicina foi adicionado 30 minutos antes da adição do meio contendo 10% de FBS. Após 18 horas, a percentagem de células na fase S foi medida pelo kit ELISA de BrdU (Roche Laboratories). Um não-sequência alvo ARNsi (Santa Cruz Biotechnology) foi utilizado como um controlo negativo para as experiências de transfecção. Cada transfecção foi efectuada em duplicado, e todo o ensaio foi repetido duas vezes.

Os resultados das experiências de transfecção E2F4 foram verificados utilizando um segundo conjunto de siRNA independente obtido a partir de Ambion Biotechnologies [31], [45]. O protocolo de transfecção foi o mesmo que descrito anteriormente. Um não-controlo-direccionamento siARN foi usada como controlo negativo em todas as experiências. Cada transfecção foi efectuada em duplicado, e todo o ensaio foi repetido duas vezes.

experiências de transferência de Western foram realizadas para avaliar a expressão de proteínas após transfecção siRNA [31], [45] em H69 e tanto células DMS114. Cada transfecção nas células H69 foi feito usando 5 × 10

5 células semeadas em frascos T-10 (Midwest Scientific) em meio RPMI contendo FBS a 10% sem antibióticos. No caso das células DMS114, a transfecção foi efectuada em placas de 6 poços, utilizando 5 x 10

5 células /poço. Em ambas as células H69 e células DMS114, cada transfecção foi efectuada em duplicado, e toda a experiência foi repetida duas vezes. A transfecção do siARN indicava foi realizada utilizando o reagente Oligofectamine (Invitrogen Corporation), de acordo com o protocolo do fabricante. Um não-controlo-direccionamento siARN foi utilizado como controlo negativo. Após 36 horas da transfecção, os lisados ​​foram efectuadas tal como descrito acima e a expressão da família E2F de proteínas foi determinada por análise de transferência de Western.

-PCR em tempo real

H69 células foram sujeitas a inanição soro durante 36 horas e, subsequentemente, estimulada com 10% de FBS durante 8 horas [46]. O ARN total foi isolado utilizando o kit miniprep da Qiagen RNeasy. Um micrograma de ARN foi tratado com DNase usando RQ1 ADNase (Promega), seguido de síntese de ADNc da primeira cadeia utilizando o kit de síntese de ADNc iScript (Bio-Rad). Uma fracção (1/20) do volume de reacção final foi de ADNc utilizado em cada PCR [46]. As sequências dos iniciadores [46], [47] são os seguintes:

A ciclina E (primer forward): 5’TTCTTGAGCAACACCCTCTTCTGCAGCC3 ‘.

A ciclina E (iniciador inverso): 5’TCGCCATATACCGGTCAAAGAAATCTTGTGCC3′.

TS (iniciador directo): 5’CTGCCAGCTGTACCAGAGAT3 ‘

TS (iniciador inverso):. 5’ATGTGCATCTCCCAAAGTGT3′.

Cdc6 (primer forward): 5’CCCCATGATTGTGTTGGTAT3 ‘.

Cdc6 (iniciador inverso): 5’TTCAACAGCTGTGGCTTACA3 ‘

18S (primer forward):. 5’CTCAACACGGGAAACCTCAC3′

18S (iniciador inverso):. 5’AAATCGCTCCACCAACTAAGAA3 ‘ .

PCR em tempo real foi realizada em um Bio-Rad iCycler.

Cromatina imunoprecipitação (CHIP) Ensaio

H69 foram privadas de soro durante 36 horas, incubando-as em isento de soro RPMI-1640 [31], [40], [32], [48]. Subsequentemente, estas células H69 quiescentes foram re-estimuladas com SBF a 10%, na presença ou na ausência de 50 uM por 8 horas a capsaicina. Vinte e cinco milhões de células foram usadas por reacção de IP. As células foram tratadas com 1% de formaldeído durante 10 minutos à temperatura ambiente para reticular as proteínas e o ADN. A ligação cruzada foi terminada pela adição de 0,125 M de glicina. anticorpo secundário anti-ratinho de coelho foi usado como controlo para todas as reacções. As reacções de PCR foram realizadas utilizando 5 uL de ADN a partir das reacções de imunoprecipitação ou 1 uL de ADN a partir da reacção de entrada como molde. condições dos ciclos de PCR para TS e Cdc6 foram como se segue: 94 ° C durante 2 min; depois 35 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 56 ° C durante 30 s e 65 ° C durante 30 s; seguido por 65 ° C durante 2 min. condições dos ciclos de PCR para a ciclina E foram como se segue: 94 ° C durante 2 min; depois 35 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 66 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 30 s; seguido por 72 ° C durante 2 min. O iniciador para a ciclina E englobados dois dos três locais de ligação de E2F no promotor como descrito em Nevins et al., (1994). Estes locais de ligação compreendem a elevada afinidade de E2F locais no promotor de ciclina E humana [49] de ligação. PCR para o promotor de c-fos (que não é regulada por E2F) foi utilizado como um controlo negativo em todas as experiências. As sequências dos iniciadores de PCR utilizados nas PCRs foram como se segue:

Ciclina E (iniciador directo): 5’CCCCGTCCCTGCGCCTCGCTG3 ‘.

Ciclina E promotor (iniciador reverso): 5’CGGCGGCGGCGACGGCAGTGG3′ .

promotor Cdc6 (primer forward): 5’GGCCTCACAGCGACTCTAAGA3 ‘.

promotor Cdc6 (iniciador inverso): 5’CTCGGACTCACCACAAGC3′

TS promotor (primer forward).: 5’TGGCGCACGCTCTCTAGAGC3 ‘.

TS promotor (iniciador inverso): 5’GACGGAGGCAGGCCAAGTG3′

O Cdc25A, primers c-fos e condições de PCR são descritas em [29]

análise estatística

Todos os dados foram expressos como a média ± SEM e representado utilizando Graph Pad Prism 5. as diferenças entre o controlo e as amostras tratadas foram analisados ​​por análise de variância (ANOVA), seguida pelo teste de comparações múltiplas de Dunnett . As taxas de crescimento tumoral em ratinhos atímicos foram analisados ​​por ANOVA seguida pelo teste de Neuman-Keuls. Nos experimentos de imunohistoquímica, todos os núcleos PCNA positivos foram contadas em cinco campos independentes por dois observadores independentes, de forma duplo-cego randomizado.