Abstract

Introdução

Vários fatores influenciam o desenvolvimento da gastrintestinal (GI) câncer. O eixo do factor de crescimento semelhante a insulina (IGF) desempenha um papel no crescimento embrionário e pós-natal e a reparação de tecidos. Os níveis elevados de IGF, baixos níveis de proteínas de ligação IGF (IGFBPs) e sobre-expressão do receptor do IGF (IGFR-I) foram associados com vários estágios do câncer. Aqui, a prevalência do rs6214 polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) no

IGF tipo I

(

IGF-I

) gene e rs6898743 no receptor de hormônio de crescimento (

GHR

) gene em pacientes com câncer gastrointestinal e controles foi estudada

Materiais Métodos

Neste estudo caso-controle holandês, DNA isolado a partir de sangue de 1.457 pacientes com câncer de GI; 438 pacientes com câncer de cabeça e pescoço (CCP), 475 com câncer de esôfago (CE) e 544 com câncer colorretal (CRC) e 1.457 controles pareados, foi utilizado para determinar os rs6214 e rs6898743 genótipos por reação em cadeia da polimerase. A associação entre esses SNPs e câncer gastrointestinal, HNC, adenocarcinoma esofágico (EAC), carcinoma de células escamosas do esôfago (ESCC) e proximal ou CRC distal foi estudada. odds ratio (OR) com intervalo de confiança de 95% (IC 95%) foram calculados através de regressão logística não condicional.

Resultados

Em geral, para o cancro GI, as RUP para rs6214 e rs6898743 SNPs foram de aproximadamente 1,0 (valor de p 0,05), utilizando os genótipos GG mais comuns como referência. OR de 1,54 (95% CI, 1,05-2,27) foi encontrado para CE para o genótipo AA de rs6214. As RUP para EAC foram 1,45 (95% CI, 1,04-2,01) e 1,71 (95% CI, 1,10-2,68), para os genótipos GA e AA, respectivamente. Genótipo GC de rs6898743 mostrou um OR de 0,47 (95% CI, 0,26-,86) para ESCC.

Conclusão

O alelo A rs6214 SNP no

IGF-I

gene foi associado com EAC, e com HNC em mulheres. O genótipo GC de rs6898743 no

gene GHR

foi negativamente associado com CICAc

Citation:. Ong J, Salomon J, te Morsche RHM, Roelofs HMJ, Witteman BJM, Dura P, et al . (2014) Polimorfismos no Insulin-like growth factor Axis estão associadas ao câncer gastrointestinal. PLoS ONE 9 (3): e90916. doi: 10.1371 /journal.pone.0090916

editor: Yousin Suh, Albert Einstein College of Medicne, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de novembro de 2013; Aceito: 06 de fevereiro de 2014; Publicação: 07 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Ong et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

em todo o mundo, o cancro é uma das causas mais prevalentes da morte [1]. Em 2011, a incidência global de câncer na Holanda era 100,577 casos, cerca de 20% o fizeram desenvolver gastrointestinal (GI) câncer [2]. O número de novos pacientes com câncer de GI está aumentando na Holanda nos últimos 20 anos [2].

Dez a vinte por cento dos cancros gastrointestinais são hereditárias [3]. Existem vários outros factores que desempenham um papel no desenvolvimento do cancro gastrointestinal, incluindo a idade, o sexo, o tabagismo, a obesidade e a actividade física [4], [5]. Também fatores dietéticos, como a ingestão de álcool, o consumo de pequenas quantidades de vegetais e frutas, consumo excessivo de carne vermelha, e muitos outros fatores dietéticos podem ter um impacto sobre o desenvolvimento do cancro GI [5]. Além disso, o risco de modulação de fatores genéticos com baixa penetrância, como numerosos polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), podem estar envolvidos no desenvolvimento de câncer gastrointestinal.

A este respeito eixo do fator de crescimento semelhante à insulina (IGF) podem ser de interesse, uma vez que a evidência de que ele está envolvido em várias fases do cancro está a aumentar [6] – [8]. O eixo IGF desempenha um papel no crescimento embrionário e pós-natal, na reparação de tecidos e diversos outros processos importantes [6], [9], [10]. Os níveis elevados de IGF, baixos níveis de proteínas de ligação a IGF (IGFBPs) na circulação e a sobre-expressão do receptor de IGF tipo I (IGFR-I) foram associados com o cancro [7], [11].

In vitro

estudos indicaram que vários componentes do eixo IGF induzir a mitose e previne a apoptose em células cancerosas [12], [13].

IGF é produzida principalmente pelo fígado e é mediada pela família da hormona de crescimento (GH). A isoforma predominante desta família somatotropina é um hormônio de crescimento (GH1). A hormona de libertação de hormona de crescimento (GHRH), secretado pelo hipotálamo, regula a produção de GH no adenohipófise da glândula pituitária [14]. A GH liga-se ao receptor da hormona de crescimento (GHR) no fígado e outros tecidos alvo. Esta interacção promove a síntese de IGF-I e IGF-II [15].

IGF é capaz de se ligar aos membros da família de IGFBP [16]. A maioria dos IGFs circulam no sangue estão ligados a IGFBPs com elevada afinidade de ligação, o que resulta num aumento da semi-vida dos IGFs. A maioria dos IGF na circulação se ligam a IGFBP-3, uma subunidade de ácido lábil (ALS) complexo [17]. Vários fatores, incluindo hormônios, dieta, etnia, idade e sexo, influenciam os níveis de IGF e IGFBP-3 no soro e tecidos [18].

Além dos membros da família IGFBP, IGF-I e IGF -II se ligam aos dois tipos de receptores de IGF-I, IGFR e IGFR-II. IGFR-I, um receptor transmembranar da tirosina quinase, é expresso em todo o corpo humano. Ambos os tipos de IGF são capazes de interagir com este receptor com diferentes afinidades de ligação. A activação da via IGFR-I em causa pode conduzir a proliferação, diferenciação, migração e prevenção de uma célula de entrar em apoptose [8].

A função de IGFR-II, um catião-independente manose-6- receptor de fosfato, é menos claro. Este receptor interage com IGF-I, bem como com o IGF-II. A ligação deste receptor com o IGF-I é fraca, ao passo que IGFR-II tem uma elevada afinidade de ligação para o IGF-II. Em contraste com IGFR-I, estas interacções não conduzem à activação de vias de sinalização celular. A principal função deste receptor é provavelmente o sequestrante de IGF-II e, eventualmente, a degradação desta proteína [9].

Diversas variantes genéticas nos componentes do eixo IGF foram já investigados em associação com o risco de cancro. McElholm et ai. analisou 102 SNPs no eixo IGF [17] e caracterizada três variantes genéticas que parecem estar associados com adenocarcinoma de esôfago: rs6214 no

gene IGF-I

, rs6898743 no

GHR

gene e a CA-repeat na região promotora (5′-UTR) do

gene IGF-I

, a última variante no entanto ser muito raro. A associação entre os SNPs rs6214 e rs6898743 e outros cancros gastrointestinais ainda não foi investigada

O rs6214 SNP (c * 2716G . A). Reside no

IGF-I

gene [19] . Este gene está localizado no braço longo do cromossoma 12 na posição 23.2 e é composto por seis exões [20]. O rs6214 SNP está localizado em três privilegiada região não traduzida (3′-UTR), que tem um papel importante na tradução, localização e estabilidade de ARNm [21] – [23]. Na Europa, as freqüências alélicas do ge um alelos são 55% e 45%, respectivamente [24]

Os rs6898743 SNP (c.71-26648G C). É um SNP intrônica no

GHR

gene, localizado no cromossoma 5 [17]. Na população europeia, cerca de 75% e 25% são G e C alelos, respectivamente [25].

Neste estudo, a prevalência dos rs6214 SNPs e rs6898743 em pacientes com câncer de GI e controles foram investigados uma população holandesa.

Materiais e Métodos

estudo da população

Para este estudo de caso-controle de base populacional, sangue total ou tecido saudável dos pacientes caucasianos com câncer GI e controles foi coletada entre 2002 e 2013 em vários hospitais na Holanda. Os critérios de inclusão foram casos que foram incluídos na ordem de entrada para os hospitais, e apenas os pacientes que há de diagnóstico foi confirmado por um patologista, foram incluídos no estudo. Todos os pacientes subsequentes que estavam dispostos a participar, deram o seu consentimento informado por escrito. As investigações foram aprovados pelos médicos éticos Comissões de Revisão da Universidade de Maastricht Medical Center e da Universidade Radboud Nijmegen Medical Center (RUNMC).

As amostras de sangue e tecidos de pacientes com CCR ou CE foram obtidos a partir da RUNMC eo Gelderse Vallei Hospital, Ede. Pacientes com CE também foram incluídos no Canisius-Wilhelmina Hospital Nijmegen eo Hospital Rijnstate, Arnhem. As amostras de sangue dos controles saudáveis, para comparação com os grupos de pacientes de CRC e da CE, foram recrutados a partir da área de Nijmegen, por anúncio nos jornais locais. Sangue de pacientes com HNC foi coletado no Hospital Universitário de Maastricht. controles saudáveis ​​para este grupo de pacientes foram recrutados a partir do banco de sangue, área de Maastricht. Os controles foram comparados com os pacientes com relação à idade e sexo.

CE foi classificada por um patologista como o carcinoma subtipos histológicos de esôfago de células escamosas (CCEE) ou adenocarcinoma esofágico (EAC). Em pacientes com CRC, a localização do tumor foi identificado como estando na proximal (ceco, ascendente do cólon, cólon transverso) ou distais (descendens cólon, cólon sigmóide, reto) parte do cólon.

O sangue foi armazenadas a -20 ° C no laboratório do Departamento de Gastroenterologia, RUNMC. Controles foram pareados aos pacientes por sexo, idade, etnia e área de recrutamento para criar dois grupos comparáveis.

Isolamento DNA

Em pacientes, o DNA foi isolado do sangue ou tecido saudável, obtido após ressecção de o tumor. Em controlos de ADN foi isolado a partir do sangue. Para o isolamento de ADN foi utilizada a Pure PCR Template Preparation Kit alta (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha), de acordo com o protocolo do fabricante. Amostras de DNA foram armazenadas a 4 ° C até o uso.

A genotipagem

Os rs6214 e polimorfismos rs6898743 foram estabelecidas por meio de reação em cadeia da polimerase técnicas em tempo real (RT-PCR). Um conjunto específico de iniciadores, que flanqueiam a região dos SNPs, foi utilizada para amplificar o ADN. No ensaio TaqMan, duas sondas marcado com um fluoróforo na extremidade 5 ‘e um extintor na extremidade 3’, foram adicionados à mistura de PCR. Os iniciadores e as sondas foram desenhadas para cada SNP, usando o software de Beacon Designer 7,0 (Premier Biosoft, Palo Alto, Califórnia, EUA). Os iniciadores e sondas TaqMan foram preparados por Sigma-Aldrich Chemie BV. (Zwijndrecht, Holanda) e foram verificados por polimorfismos nos seus locais de ligação utilizando SNPCheck versão 3 (https://ngrl.manchester.ac.uk/SNPCheckV3/snpcheck.htm). As sequências dos iniciadores e sondas são dadas na Tabela 1. A amidite 6-f luoresceina (6-FAM) e amidite hexacloro-fluoresceína (HEX) foram covalentemente ligados às sondas para os alelos mais comuns e dos alelos menos frequentes, respectivamente. O Black Hole Refrescante-1 (BHQ1), foi usado o qual foi ligado à extremidade 3 ‘da sonda TaqMan. RT-PCR foram realizadas com o tempo real do sistema CFX96 PCR detecção (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, Califórnia, EUA) e os resultados foram analisados ​​com o software de análise de dados de Bio-Rad CFX Manager 2.0 (Bio-Rad Laboratories Inc ).

Análises Estatísticas

os resultados da RT-PCR, as distribuições de genótipos e freqüência do alelo, foram analisados ​​usando IBM SPSS Statistics software versão 20 (International Business Machines Corp., Armonk, Nova York, EUA).

a igualdade de a média de idade foi testada usando o-amostras independentes t-teste. Na análise, idade e sexo foram considerados como fatores de confusão. odds ratio (OR) com intervalo de confiança de 95% (IC95%) foram calculados para os genótipos e para os alelos frequências através da realização de regressão logística não condicional, bem como condicional analisa. Homozigose para o alelo mais comum foi tomado como referência.

Quando a média de idade entre o grupo de pacientes (sub) eo grupo controle foi significativamente diferente, as RUP calculados com a regressão logística não condicional foram corrigidos para esta variável. Resultados com um

p

-valor 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

resultados

As características da população de estudo eo número de indivíduos por subtipo de câncer GI são resumidos. na Tabela 2. neste estudo, 1.457 pacientes com câncer de GI e 1.457 controles foram incluídos, com idade entre 16 e 95 anos. A média de idade dos pacientes e controle de grupos do cancro GI foi de 63,8 ± 11,5 e 62,4 ± 11,3 anos, respectivamente (

p

-valor = 0,001).

Na sub-análise , em que a associação entre os SNPs e do desenvolvimento de cada subtipo de câncer foi investigada, a média de idade entre os pacientes HNC e o grupo de controle correspondente foi significativamente diferente (p = 0,0001).

a distribuição dos genótipos para SNPs rs6214 e rs6898743 em pacientes com cancro gastrointestinal e controles são apresentados na Tabela 3. para os SNPs rs6214 e rs6898743, a distribuição dos genótipos no grupo global de cancro gastrointestinal do paciente, nos sub-grupos do cancro gastrointestinal, bem como na grupos de controle não desviar-se do equilíbrio de Hardy-Weinberg (todos os valores de p 0,05), exceto para o sub-grupo de doentes ESCC, que mostrou um

p

-valor de 0,003 para rs6898743 SNP

para ambos SNPs, nenhuma associação com câncer de GI foram vistos (RUP entre 1,01 e 1,20,

p

-Valores 0,05), exceto para uma expressão mais significativa do genótipo GA de rs6214 em pacientes do sexo feminino (OR 1,38, 95% CI 1,01-1,87).

a Tabela 4 resume a distribuição dos genótipos e as RUP (IC 95%) para rs6214 SNPs e rs6898743 por subtipo de câncer. Neste sub-análise, uma associação significativa com a CE (OR 1,54, 95% CI, 1,05-2,27) foi encontrada para o genótipo AA de rs6214 (

p

-valor = 0,029), enquanto que o genótipo GA mostrou uma não significativa OR de 1,27 (IC 95% 0,96-1,69). O A-alelo foi significativamente mais presente no grupo de pacientes (p-valor = 0,021). Analisados ​​de acordo com o sexo, genótipo AA de rs6214 em homens mostrou uma ainda maior OR de 1,68 (IC 95%, 1,09-2,59), com um valor-p de 0,019.

Não foram encontradas associações significativas entre pacientes com HNC ou CRC e controles para os genótipos de ambos os SNPs. No entanto, para HNC em mulheres um OR de 2,19 (IC 95%, 1,09-4,39) foi encontrada para o genótipo GA de rs6214, enquanto um OR de 0,08, 95% CI, 0,01-0,65 foi encontrado para o genótipo CC de rs6898743 SNP . As RUP calculados para os genótipos rs6214 e rs6898743, por subtipo histológico de CE estão apresentados na Tabela 5. Um OR de 1,45 (IC de 95%, 1,04-2,01) foi encontrada para os heterozigotos de GA em rs6214 EAC (p-valor = 0,028) , ao passo que os homozigotos para o alelo variante AA mostrou um OR de 1,71 (IC de 95%, 1,10-2,68; p = 0,018). Nos homens com genótipo AA de rs6214, a associação foi ainda mais forte (OR CI 1,87, 95%, 1,14-3,07;

p =

0,013). O A-alelo foi significativamente mais presente no grupo de pacientes EAC, bem como no sub-grupo masculino (p-valores 0,008 e 0,009, respectivamente).

Para rs6898743 SNP, uma associação inversa com ESCC foi notado por genótipos GC (OR 0,47, 95% CI, 0,26-0,86) com um

p

-valor de 0,014. Em contraste, o CC genótipo homozigoto variante revelou um OR de 2,54 (IC de 95%, 0,66-9,81). No entanto nestes subgrupos CC o número de indivíduos são muito pequenas. Da mesma forma, uma associação inversa significativa com CICAc foi encontrado em homens com GC genótipo (OR CI 0,31, 95%, 0,15-0,66;

p

= 0,002). Não foram encontradas associações significativas quando os pacientes CRC foram analisados ​​de acordo com a localização do tumor, quer proximal ou distal (Tabela 5).

Os principais resultados deste estudo são visualizados na Figura 1.

Apenas significativa associações são visualizados. Associações são dadas como segue: rs número do SNP, genótipo, odds ratio com correspondente a 95% de intervalo de confiança. O homozigoto genótipo mais comum é tomado como referência. EAC, adenocarcinoma de esôfago; ESCC, carcinoma de células escamosas do esôfago.

Discussão

Este estudo de caso-controle de base populacional foi realizado para investigar o papel do IGF associado rs6214 SNPs e rs6898743 no desenvolvimento de gastrointestinal Câncer. Os rs6214 e rs6898743 SNP não foram encontrados associados com câncer gastrointestinal, no entanto, em subgrupos de câncer gastrointestinal, algumas associações interessantes foram notados.

O genótipo AA de rs6214 no

IGF-I

gene foi associado com CE, mas este efeito de risco modificação dos rs6214 alelo a foi principalmente o resultado de uma associação com o subgrupo histológico da EAC; indivíduos que carrega o GA ou genótipos AA apresentaram risco relativo de 1,45 e 1,71, respectivamente. O rs6214 SNP tem sido investigada em vários estudos anteriores sobre o risco de câncer gastrointestinal. Feik et ai. relatou um risco significativamente maior de CRC para portadores do genótipo AA [26]. Uma tendência semelhante foi observado em nosso estudo, mas sem significância foi alcançada. Esta diferença pode ser explicada pelo facto de a população do estudo foi de Feik et ai. só continha 178 pacientes de CRC. Além disso, suas RUP foram ajustados para sexo, idade e índice de massa corporal (IMC), enquanto o IMC não esteve envolvido no estudo.

McElholm et al. relataram uma significativa diminuição do risco de esôfago de Barrett (BE) para o genótipo AA de rs6214 em uma população estudo irlandês (OR = 0,43, 95% CI 0,24-0,75) [17]. BE é uma substituição anormal no esófago do epitélio escamoso por epitélio especializado alinhado-colunar, e é um dos principais factores de risco para EAC [27]. Por isso, é surpreendente que nós encontramos uma associação inversa significativa com EAC para o rs6214 GA e os genótipos AA

Duas explicações principais podem ser dadas:. Em primeiro lugar, o grupo de pacientes com BE e o grupo controle no estudo da McElholm et ai. eram relativamente pequenas (n = 207 e n = 244, respectivamente). Mais importante, contudo, é a grande diferença de frequências alélicas, sendo 48% e 52% para o rs6214 G e A alelos como relatado por McElholm et ai. em seus controles, enquanto foram relatados valores de 57% e 43% para os europeus na base de dados HapMap [24]. Os últimos valores estão de acordo com os nossos dados de frequência de alelos de controle (60,5% L e 39,5% alelo).

O papel da variante genética do rs6214 em câncer de pâncreas em uma população japonesa foi avaliada por Nakao et ai. [28]. Usando AA como o genótipo de referência, não foi encontrada associação entre rs6214 e câncer pancreático na análise global, ao passo que 20 anos portadores dos genótipos AG e GG com um IMC ≥25 kg /m

2 mostraram um risco aumentado de pâncreas Câncer. No entanto, o número de pacientes incluídos neste sub-categoria era muito baixa e, portanto, a confiabilidade é limitada.

níveis plasmáticos elevados de IGF-I foram sugeridos para ser um risco para vários tipos de câncer, incluindo CRC [29], [30]. Portanto, Canzian et ai., Al-Zahrani et ai. e D’Aloisio et ai. investigou o papel do SNP rs6214 sobre os níveis de IGF-I circulante em caucasianos [20], [31], [32]. Contudo, foram obtidos resultados inconsistentes. No estudo de D’Aloisio et al., O genótipo AA pareceu estar associado com níveis médios plasmáticos elevados de IGF-I, ao passo que os outros dois estudos não encontraram uma associação entre este SNP e os níveis circulantes de IGF-I.

Os rs6898743 SNP não foi exaustivamente investigado até agora. Portadores dos genótipos CC foram encontrados inversamente associado com EAC por McElholm et al. [17], ao passo que nossos resultados mostraram uma tendência para o oposto. Também foi notável que as freqüências alélicas na população do estudo irlandês como relatado por McElholm et al. [17] (19% G e 81% de C para os controlos) foram completamente diferentes das frequências na população hapmap Europeia [25] (77,9% e 22,1% L C). Nossos dados de 76,9% alelo G e 23,1% alelo C em controles totalmente adequado com os dados HapMap relatados para os europeus [25]

Algumas diferenças relacionadas interessante género foram encontrados.; nas mulheres, o genótipo GA de rs6214 SNP foi significativamente associada com GI e HNC, enquanto homozigose para o alelo variante C do rs6898743 foi inversamente associado com HNC. Nos homens, exatamente efeitos opostos foram notados, porém os resultados aqui não são significativas. Deve ser notado, contudo, que o número de pacientes do sexo feminino no sub-grupo de pacientes HNC era pequeno (N = 93), o que fez o significado discutível.

A força do presente estudo é que os pacientes e controles foram emparelhados com sucesso por sexo, raça, área de recrutamento e também em grande parte pela idade. Isto permitiu uma avaliação da associação entre os SNPs e os resultados, sem serem influenciadas por estes fatores de confusão. Além disso, a população total do estudo era grande.

Este estudo também tem suas limitações. Primeiro de tudo, a correspondência por idade não foi sucedido por completo, como as idades médias entre os pacientes e controle de grupos GI e HNC diferiram significativamente. Portanto, a regressão logística incondicional foi usada que, teoricamente, cria uma potência inferior em comparação com regressão logística condicional. Em segundo lugar, as RUP calculados nos sub-análises não foram ajustados para testes múltiplos. Isso pode ser aconselhável uma vez que os testes múltiplos pode aumentar a mudar para encontrar uma associação significativa e, assim, cria viés. Em terceiro lugar, neste estudo nenhuma informação sobre tabagismo, consumo de álcool, dieta e outros fatores de estilo de vida está disponível. Além disso, a obesidade do que o IMC ea relação de hip-a-cintura são indicadores adequados, é um fator de confusão importante para o câncer GI [33]. A obesidade pode influenciar o risco de cancro colo-rectal, e do excesso de gordura corporal e a distribuição de gordura também parece estar relacionada com EAC [33]. Co-morbidades, diabetes mellitus especialmente no início diagnosticados, está associado a vários tipos de câncer, incluindo câncer de colorectum [34]. Além disso, ao analisar a relação entre os polimorfismos nas componentes do eixo IGF e cancro nas mulheres, a utilização de pílulas anticoncepcionais precisa ser levado em consideração, uma vez que o estradiol hormona sexual tem uma, assim como uma influência directa, indirecta no produção de IGF-I nos tecidos que respondem ao estrogénio e o fígado [35]. Outra limitação do estudo é que as populações de estudo nas sub-análises eram relativamente pequenos, e que apenas um controle foi combinado com um paciente.

Em conclusão, o alelo A rs6214 SNP do

gene IGF-I

está associado ao câncer de esôfago. Esta associação pode ser principalmente o resultado de efeitos sobre o subtipo de adenocarcinoma de esôfago histológico em homens. Além disso, as mulheres com o alelo de SNP rs6214 podem ter um risco aumentado de desenvolver cancro gastrointestinal, mais em particular de HNC. Estes SNPs podem ser utilizados como marcadores para avaliar o risco de cancro (para estes subtipos histológicos).