da arte abstracta

Fundo

A baixa densidade relacionada com o receptor de lipoproteína de proteína-1 (LRP-1 ) é um receptor de endocitose mediando o apuramento de várias moléculas extracelulares envolvidos na disseminação das células cancerosas. LRP-1 apareceu assim como um receptor de direccionamento atraente para o comportamento invasivo das células malignas. No entanto, resultados recentes sugerem que a PRL-1 pode facilitar o desenvolvimento e o crescimento de metástases de cancro in vivo, mas a contribuição exacta do receptor durante a progressão do cancro continua a ser elucidados. A falta de perspectivas mecanicistas para o intracelular redes a jusante da LRP-1 sinalização tem impedido a compreensão da sua contribuição para o câncer.

Metodologia /Principais Achados

Através de um silenciamento mediado por RNA curto hairpin abordagem, identificou-se LRP-1 como um regulador principal de ERK e JNK sinalização num contexto de células tumorais. experiências de co-imunoprecipitação revelou que a PRL-1 constitui um local de ancoragem intracelular para os complexos contendo MAPK. Por utilização de agentes farmacológicos, constitutivamente activas e cinases dominante-negativos, nós demonstramos que a PRL-1 mantém as células malignas em um estado adesivo que é favorável para a invasão por activação de ERK e JNK inibição. Nós ainda demonstrado que o regulamento 1-dependente de PRL de sinalização MAPK organiza a arquitetura do citoesqueleto e medeia volume de negócios complexo adesivo em células cancerosas. Além disso, descobrimos que LRP-1 é tethered à rede de actina e aos locais de adesão focal e controla ERK e JNK alvo a estruturas ricas em Talin.

Conclusões

Foram identificados ERK e JNK, como os principais relés moleculares pelos quais LRP-1 regula a desmontagem de adesão focal de células malignas para apoiar a invasão

Citation:. Langlois B, Perrot G, Schneider C, Henriet P, Emonard H, Martiny L, et al. (2010) LRP-1 promove o câncer invasão celular através do apoio a ERK e inibir a JNK vias de sinalização. PLoS ONE 5 (7): e11584. doi: 10.1371 /journal.pone.0011584

editor: Bill Hooker, Calypte Biomedical Corporation, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de abril de 2010; Aceito: 20 de junho de 2010; Publicação: 14 de julho de 2010

Direitos de autor: © 2010 Langlois et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), La Ligue Nationale Contre Cancer le (Comite de la Marne), CPER (Contrat de Projets Etat-Região) 2007-2013 e Fonds National pour la Santé ACI (Acção Concertée incitative) 2008 (Projeto Cancéropôle Grand-Est). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a lipoproteína de baixa densidade (LDL), proteína relacionada com o receptor-1 (LRP-1) é um receptor endocítico ubiquamente expressa pertencente à família do receptor de LDL [1]. Descrito pela primeira vez como um receptor de carga medeia a internalização e a degradação lisossomal dos α2-macroglobulina [2], LRP-1 foi, em seguida, verificou-se estar envolvida na internalização de mais de 30 ligandos funcionalmente e estruturalmente não relacionados extracelulares. Estes incluem proteases, os complexos inibidor da protease, as proteínas macromoleculares e factores de crescimento. Inicialmente sintetizadas como uma kDa precursor de 600, LRP-1 é ainda processado no trans-Golgi por um furina-convertase para a expressão na superfície da célula na forma de cadeia dupla madura composta de um 515 kDa subunidade extracelular (cadeia α), não covalentemente ligada a uma cadeia β de 85 kDa contendo o domínio transmembranar e a cauda citoplasmática. Os LRP-1 de cadeia α portos quatro grupos de ligação ao ligando envolvidas no reconhecimento específico de ligantes extracelulares e o conjunto de complexos multiprotein na superfície da célula. O domínio intracelular da cadeia β LRP-1 pode recrutar moléculas envolvidas na maquinaria endocítica e citoplasmáticos moduladores de vias de sinalização [3].

A diversidade dos seus ligandos pode explicar porque LRP-1 foi identificado como sendo um fator crítico em diversos contextos patológicos incluindo a aterosclerose e doenças neurodegenerativas como o mais frequentemente descritos [4], [5]. Um número crescente de evidências reforçaram o papel putativo da LRP-1 em eventos cruciais durante o cancro progressão [6]. LRP-1 foi, na verdade relatado para mediar a eliminação de várias metaloproteinases de matriz tais como MMP-2, MMP-9 e MMP-13, [7], [8], [9] e para regular a activação da plasmina cascata através de endocitose de tecido- tipo (tPA) ou ativadores de plasminogênio uroquinase-tipo (uPA) [10], [11]. Considerando a sua função bem conhecida no controlo da proteólise da matriz [12], LRP-1 foi inicialmente proposto como uma nova supressor de tumor. O nível de expressão fraca de LRP-1 observado nas células de cancro humano de alto grau e tecidos parece apoiar esta hipótese [13], [14]. No entanto, a função global do LRP-1 na carcinogênese parece ser muito mais complexa do que se pensava. Estudos recentes têm relatado uma contribuição positiva de LRP-1 a migração e invasão eventos de vários tipos de células [10], [15], [16], incluindo células de tumor maligno [17], [18], [19], [20 ]. LRP-1 expressão também foi relatado para ser hipoxia-responsive e apoiar a disseminação metastática de xenoenxertos de tumor de rato [21]. Além disso, LRP-1 foi mostrado para sustentar o mitogénica e /ou efeitos promigratory de vários factores solúveis presentes no meio peritumoral, apoiando assim um papel pro-tumorigénese do receptor [15], [22], [23]. Recentemente, demonstrou que a PRL-1 contribui para a invasão de células de carcinoma, controlando subtilmente volume complexo adesiva [17]. Assim, parece que os mecanismos pelos quais a progressão controlos LRP-1 de tumores são não exclusivamente relacionado com a sua função de endocitose.

Para além endocitose, LRP-1 foi distinguido pela sua capacidade de desencadear vias de sinalização intracelular que regula a proliferação celular, diferenciação , migração ou sobrevivência [15], [24], [25], [26]. Seu domínio curto intracitoplasmática (ICD) contém dois motivos NPxY para a fosforilação de tirosina quinases que são então capazes de se ligar domínio de ligação de fosfotirosina (PTB) molecular contendo proteínas. Levedura de dois híbridos ensaios e proteómica análise revelou que Shc (Src homologia 2 domínio que contém proteína), Fe65, DAB1 (desativado 1), PI3K (fosfatidil-inositol 3-quinase) ou um PIP-4,5-quinase (fosfatidil-inositol -4,5-quinase) homóloga pode associar com a LRP-1-CDI [27], [28]. Assim, em resposta a estímulos extracelulares, LRP-1 pode recrutar proteínas intracelulares de andaime para desencadear de sinalização a jusante. LRP-1 tem sido identificada como um parceiro de sinalização molecular para o receptor do factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR), que conduz a sinalização e desenvolvimento de lesões ateroscleróticas migratório e proliferativo [4], [29]. Mais recentemente, o efeito promigratory do inibidor do activador de plasminogénio de PAI-1 apareceu para ser activado LRP-1-dependente da JAK (cinase Janus) /STAT (transdutores de sinal e activador da transcrição) via de sinalização [30]. Além disso, Ma e colegas relataram que a PRL-1 pode regular a migração de fibroblastos embrionários de murídeo por suprimir a Rac1 e quinase regulada por sinal extracelular (ERK vias) [31].

No campo do cancro, há uma falta notável de conhecimento sobre a sinalização intracelular a jusante da LRP-1 e compreensão da sua possível contribuição para a progressão do câncer. No presente estudo, caracterizamos os relés de sinalização moleculares envolvidos na estimulação LRP-1 mediada por invasão de células de câncer e identificou a cadeia β LRP-1 como uma docking site principal para adesão focal (FA) componentes e proteína ativada por mitógeno quinase (MAPK) molecular contendo complexos.

Resultados

Identificação da LRP-1 como um regulador de MAPK vias de sinalização no contexto de células tumorais

Para avaliar o papel do LRP- 1 na regulação da transdução de sinal intracelular, foi utilizado um método previamente validado para gerar shLRP-1 de células clonais que sobre-expressam de forma estável uma sequência de gancho de cabelo específico dirigido contra LRP-1 [17]. Como mostrado na Fig. 1, observou-se ~ 90% a sub-regulação de endógena LRP-1 em células shLRP-1 em comparação com células shCTRL, tanto ARNm (Fig. 1A) e os níveis de proteína (Fig. 1B). Nós, portanto, analisou os efeitos de silenciamento LRP1 na ativação de vários potenciais vias de sinalização LRP-1-regulamentados. Os estados de activação de duas principais vias de MAPK, isto é, ERK-1/2 e SAPK /JNK (activada por stress das proteínas quinase /c-Jun N-terminal quinase), foram analisados ​​em primeiro lugar (fig. 1C). Verificou-se que o nível de ERK-1 fosforilada /2 foi selectivamente reduzida em células silenciados-LRP1 e um aumento da fosforilação de JNK-1/2/3 foi detectado após LRP-1 silenciamento. No entanto, os níveis de fosforilação de Akt e p38 MAPK não se alterou significativamente em carcinomas LRP-1-deficiente. Estes resultados demonstram que a PRL-1 pode actuar como um modulador de sinalização intracelular, a activação de ERK e inibição das vias de sinalização JNK.

(A) Os ARNs totais foram purificados a partir da linha celular clonal FTC133 controlo (shCTRL) ou células clonais que estavelmente sobreexpressam shRNAs para LRP-1 (shLRP-1). O nível de transcrição de LRP-1 foi avaliada por RT-PCR. iniciadores de p-actina foram usadas como um controlo de normalização. (B) extractos de células completas a partir de cada linha de células foram submetidas a análise de immunoblot com LRP-1 anti-anticorpo de cadeia β (5A6). anticorpo de p-actina foi utilizada para normalização. (C) shCTRL e shLRP-1 de células clonais foram cultivadas durante 24 horas em superfícies revestidas com gelatina em 10% de meio contendo FBS. extractos de células completas foram coradas imunologicamente usando fosfo-ERK, JNK, fosfo-, fosfo-Akt e anticorpos fosfo-p38. Os anticorpos para ERK, JNK, p38 e β-actina foram usadas para assegurar a igualdade de carga e para a normalização. O gel e imunoblots apresentados são representativos de pelo menos três experiências separadas. Os números sob o gel e immunolots indicam as induções de dobragem por comparaison com células shCTRL.

LRP-1 medeia a activação induzida por soro de ERK-1/2 e inibição constitutiva de JNK-1/2 /3

o regulamento LRP-1-mediada de sinalização intracelular pode depender da ligação de ligandos extracelulares ou no recrutamento de andaimes intracelulares. Foram avaliados regulação LRP-1 mediada por ERK de ambos (Fig. 2A a 2D) e vias JNK (Fig. 2E) de 2H, em resposta a estimulação com soro e revestimento de gelatina. Observou-se a activação LRP-1 mediada por ERK-1/2 fosforilação apenas na presença de soro (Fig. 2A e 2B vs 2C e 2D). Em contraste, a activação de JNK-1/2/3 em células LRP-1-silenciados não foi condicionada pela presença de soro (Fig. 2E para 2H). Em ambos os casos, a regulação da MAPK por LRP-1 não foi afectada pelo revestimento de gelatina (Fig. 2A, 2C, 2E e 2G). Por conseguinte, o receptor de LRP-1 desencadeia a activação extracelular dependente de ligando de ERK-1/2 e actua como um inibidor constitutiva da via JNK.

shCTRL e células shLRP-1 foram plaqueadas sobre plástico ou gelatin- pratos revestidos durante 24 horas na ausência ou na presença de FBS. extractos de células completas foram sujeitos a análise de Western-blot para estudar a activação de ERK (A-D) e de JNK (E-H) na ausência ou na presença de FBS. As respectivas taxas de activação de ERK (B, D) e JNK (F, H) foram determinados tal como rácios de intensidade de fosfo-proteína a correspondente pan-proteína e expressa em unidades relativas +/- SD, com um valor de 1 atribuído a shCTRL células. NS, não significativo; *,

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LRP-1 constitui um local de ancoragem para Src, ERK e JNK complexos contendo

O LRP-1 C-terminal final podem interagir com moléculas de andaime envolvidas na transdução de sinal [28]. Coimmunoprecipitation experiências foram realizadas para testar se o domínio intracelular de LRP-1 é capaz de recrutar alvos envolvidos na regulação de vias de sinalização de ERK e JNK num contexto de células tumorais. Como mostrado na Fig. 3, que foram capazes de imunoprecipitar com sucesso LRP-1-cadeia β com um anticorpo criado contra o extracelular de cadeia α LRP-1. Ambas as ERK e JNK cinases foram co-imunoprecipitada com LRP-1-cadeia β. Nós também examinou o estado de fosforilação destas cinases. formas fosforiladas de ERK-1/2 foram encontrados associados com LRP-1, onde fosforilada de JNK não eram. . Src, uma cinase bem conhecida para ser activado a jusante dos receptores e mitogénio de matriz, foi também detectada em complexos de cadeia β contendo 1-LRP

imunoprecipitações de LRP-1 contendo complexos (IP: LRP-1 -α) foram realizadas usando um anti-PRL de cadeia α (8G1) anticorpos e os imunocomplexos foram imunotransferidas (IB), usando 8G1, anti-LRP-1-β cadeia (5A6), anti-ERK-1/2 , anti-fosfo-ERK-1/2, anticorpos anti-fosfo-JNK-1/2/3 e anti-src anti-JNK-1/2/3,. IgGs não específicos foram utilizados como controle negativo de imunoprecipitação.

ativação ERK dependente LRP-1-contribui para a invasão de células de carcinoma

Nós recentemente descrito um papel fundamental para a LRP-1 em tumor progressão [17]. Com efeito, como mostrado na Fig. 4A, as células LRP-1-deficient exibiram uma diminuição de duas vezes da capacidade invasiva, em comparação com células de controlo clonais. Por conseguinte, investigado se a activação LRP-1-dependente de ERK poderia contribuir para a invasão de células de carcinoma. Em primeiro lugar, as células de controlo foram tratadas com U0126, um inibidor selectivo de MEK-1/2 (MAPK quinase ERK-1/2) ou transfectadas com um mutante dominante-negativa de MEK-1. A eficiência de ERK-1/2 inibição nestas condições pode ser visto na Fig. 4B. Nenhuma alteração na fosforilação de JNK foi detectado por inibição de ERK (Fig. S1). invasão de células de controlo foi inibida por tratamento U0126 de um modo dependente da dose (Fig. 4C e 4D). Além disso, as células shCTRL superexpressam uma forma cinase morta de MEK-1 apresentaram redução propriedades invasivas (Fig. 4C e 4D). Estes resultados indicam que o módulo de sinalização de ERK é activada durante a invasão de células de carcinoma. Em segundo lugar, para resgatar a via ERK activada em células LRP-1-silenciados, um ERK-2-constitutivamente activo foi sobre-expresso. O estado de activação de ERK-1/2 foi avaliada por imunotransf erência (Fig. 4E). Como mostrado na Fig. 4F e 4G, a capacidade das células LRP-1-deficiente para invadir foi parcialmente restaurada quando ERK-2 foi sobre-expresso. Uma vez que a Src de tirosina-quinase poderia potencialmente activar ERK sinalização a jusante de LRP-1 (Fig. 3), a invasão de células foi quantificada na presença de um inibidor de Src quinase. No entanto, a inibição de Src não afectou as capacidades de ambas as células invasoras shCTRL e shLRP-1 (Fig. 4H), excluindo assim o contributo quinase Src para a activação de ERK LRP-1 mediada por durante a invasão de células de carcinoma.

Matrigel Invasão ensaio foi realizado para shCTRL e shLRP-1 de células de carcinoma em condições basais (a), após a modulação da actividade de ERK em shCTRL (B-D) e shLRP-1 células (e-L) ou na presença de inibidor de Src ( H). (C, D) a capacidade das células para invadir shCTRL matrigel foi quantificada após a inibição da actividade de ERK usando tratamento U0126 (10 ou 25 fiM) ou a expressão de um mutante de cinase morta de MEK-1 (DN-MEK). (F, G) As propriedades invasivas das células shLRP-1 foram examinados após uma activação constitutiva de ERK-2 (CA-ERK). A eficiência da inibição de ERK em shCTRL (B) e a activação de ERK em células shLRP-1 (E) foi controlada pela utilização de fosfo-ERK, ERK e anticorpos de p-actina. Anti-HA foi usado para controlar o nível de expressão de proteínas marcadas com HA sobre-expresso. (H) a invasão de células do tumor foi medido após a inibição da actividade de Src-dependente, utilizando 10 uM de inibidor de Src cinase I (Src INH). Imagens representativas são mostrados para cada condição (D, L). Os resultados foram obtidos a partir de três experiências separadas, cada uma realizada em triplicado. Invasão foi determinada por contagem de células oito campos aleatórios por poço. Os resultados foram expressos como os meios +/- SD após normalização em comparação com o veículo, isto é, DMSO para tratamentos com drogas ou de lipofectamina (lipo) para a transfecção. NS, diferenças com controle correspondente não foram significativas. *,

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A inibição da JNK mediada pela LRP-1 sustenta a invasão de células malignas

Da mesma forma, nós examinamos até que ponto LRP- inibição da via JNK poderá apoiar a invasão de células de carcinoma 1-mediada. JNK1 e MKK-7 (MAPK cinase-7) foram também co-expressos em células shCTRL (Fig. 5A). A invasão de células shCTRL foi reduzida em 25% quando sobre-expressam o tipo selvagem de JNK (Fig. 5B e 5C), sugerindo que a inibição da JNK é necessário para promover a invasão. Em seguida, utilizou-se o inibidor de JNK SP600125 selectivo e um mutante dominante-negativa de JNK para recuperar inibição de JNK em carcinomas LRP-1-deficient (Fig. 5D). Nós não observamos qualquer modulação significativa da ERK fosforilação sob estas condições (Fig. S1). células Curiosamente, a fraca capacidade da LRP-1-silenciados para invadir foi significativamente aumentada sob inibição da JNK (Fig. 5E e 5F). Estes resultados suportam o conceito de que a inibição da via de sinalização JNK mediada por PRL-1 contribui para a invasão de células de carcinoma.

Os ensaios de invasão celular foram realizadas com shCTRL (B, C) e shLRP-1 células ( E, F) depois da modulação da actividade de JNK (A, D). células ShCTRL (B, C) foram transfectadas pelo vector de expressão de codificação para o tipo selvagem MKK-7 /JNK-1 antes da invasão celular foi quantificada. (E, F) As propriedades invasivas das células LRP-1-silenciados foram medidos após o tratamento SP600125 (5 ou 10 uM), ou transfecção por um mutante negativo dominante de JNK-1 (DN-JNK). activação de JNK em shCTRL (A) e a inibição de JNK em células shLRP-1 (D) foi avaliada através da utilização de fosfo-JNK, JNK e anticorpos de p-actina. Anti-HA e anti-FLAG foram utilizados para controlar a expressão de proteínas marcadas com sobre-expressos. Imagens representativas são mostrados para cada condição (C, F). Os resultados foram obtidos a partir de três experiências separadas, cada uma realizada em triplicado. Invasão foi determinada por contagem de células oito campos aleatórios por poço. Os resultados foram expressos como os meios +/- SD após normalização em comparação com o veículo, isto é, DMSO para tratamentos com drogas ou de lipofectamina (lipo) para transfecções. *,

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O regulamento LRP-1 mediada por MAPK controla a fixação de células de carcinoma

Nós informou recentemente que LRP-1 silenciando severamente prejudicada a invasão de células malignas consecutivamente a uma forte alteração de células-matriz interação turn-over. Nós portanto postulado que o controlo LRP-1-dependente de ambas as vias JNK e ERK contribui para modular a interacção de células-matriz para suportar capacidade de invasão. Como esperado, as células shLRP-1, em que a actividade de ERK é reduzida, apresentada uma taxa acelerada de ligação a superfícies de gelatina-revestido, em comparação com células de controlo clonais (Fig. 6A). Além disso, a sobre-expressão de um MEK-1 mutante da cinase inactiva em células shCTRL levaram a um aumento da taxa de aderência (Fig. 6B), enquanto que a ERK-2 constitutivamente activa diminuiu a capacidade de LRP-1 deficiente em células para anexar (Fig. 6C). Na verdade, após 60 minutos de ligação, as células aderentes foram aumento de 2 vezes da inibição da via ERK (Fig. 6B). Ao mesmo tempo de ligação, a percentagem de células aderentes LRP-1-silenciados foi diminuiu 2 vezes sob a activação de ERK (Fig. 6B e 6C). Da mesma forma, a sobre-expressão do tipo selvagem MKK-7 /JNK-1 em células de controlo levou a uma de 2 vezes a aderência melhorada após 60 min (Fig. 7A). Além disso, o aumento da taxa de fixação observada em células LRP-1-deficient foi invertido por expressão de uma forma negativa dominante de JNK-1 (Fig. 7B). Estes dados suportam o conceito de que LRP-1 mantém as células malignas em estado adesiva intermediária que é favorável para a invasão através da ativação ERK e inibição de JNK.

(A) shCTRL (caixas brancas) e shLRP-1 (caixas cinzentas células) foram semeadas em placas revestidas com gelatina e as células não aderentes foram descartados após 30, 60 ou 90 min. ensaios de adesão foram também realizados com células que sobre-expressam um mutante shCTRL cinase morta de MEK-1 (DN-MEK) (B) e shLRP-1 sobre-expressam um constitutivamente activa de ERK-2 (CA-ERK) (C). Para cada condição, os resultados são expressos como percentagens de células aderentes de controlo correspondentes aos 90 minutos. Cada valor é a média +/- DP de quatro experiências separadas, cada uma realizada com em triplicado. *,

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shCTRL (caixas brancas) e shLRP-1 (caixas cinzentas), as células foram semeadas em placas revestidas com gelatina e as células não aderentes foram descartados após 30, 60 ou 90 min. Os ensaios de adesão foram realizados com células que sobre-expressam shCTRL tipo selvagem MKK-7 /JNK1 (A) e shLRP-1 sobre-expressam um mutante dominante negativo de (B) cinases de JNK-1 (DN-JNK). Para cada condição, os resultados são expressos como percentagens de células aderentes de controlo correspondentes aos 90 minutos. Cada valor é a média +/- DP de quatro experiências separadas, cada uma realizada com em triplicado. *,

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A rede de actina de carcinomas-invadindo rápidas é resgatado em células LRP-1-silenciados seguintes reativação da ERK ou inibição de JNK hyperactivated

Nós investigado se o regulamento LRP-1 dependente da sinalização MAPK poderia orquestrar a coordenação de actina e de adesão dinâmica durante a invasão de células malignas. Por conseguinte, analisada a distribuição celular da actina fibrilar após modulação das actividades de ERK e JNK (Fig. 8). as células de controlo aderentes apresentaram uma morfologia polarizada com extensões celulares filopoidais e uma rede de actina principalmente corticalmente distribuída (Fig. 8A). Em nítido contraste, LRP-1-silenciando morfologia povoada induzida com fibras numerosas de estresse, filamentos transversais proeminentes e uma rede de actina ramificada desenvolvido (Fig. 8F). A inibição da sinalização de ERK em células cancerosas de controlo por tratamento U0126 (Fig. 8B vs 8A) ou uma forma dominante negativa de MEK-1 (Fig. 8D vs 8C) induziu alterações morfológicas drásticas semelhantes aos obtidos sob LRP-1 silenciamento. O mesmo resultado foi observado após expressão do tipo selvagem MKK-7 /JNK-1 em células de carcinoma de controlo (Fig. 8E vs 8C). Em células, a inibição da sinalização de JNK por SP600125 (Fig. 8G vs 8F) ou sobre-expressão de cinase inactiva de JNK-1 LRP-1-silenciados (Fig. 8J vs 8H) restaurou a morfologia mesenquimal semelhante de células de carcinoma de tipo selvagem. Além disso, constitutivamente activo de ERK-2 (Fig. 8I vs 8H) era suficiente para reverter a morfologia povoada causada pelo silenciamento da LRP-1. Estes resultados demonstraram que a PRL-1 induz silenciamento grandes rearranjos do citoesqueleto de actina ligados directamente à inibição de ERK e JNK hiperactivação.

shCTRL células (A-E) e shLRP-1 (M-J) foram semeadas em gelatina-revestido placas para 120 min. actividades de ERK ou JNK foram modulados. As células de controlo foram tratadas por 25 U0126? M (B) ou transfectadas por um mutante de cinase morta de MEK-1 (DN-MEK) (D) para inibir a via e JNK, a activação dependente de ERK foi obtido por sobre-expressão de ambos de tipo selvagem MKK-7 e de JNK-1 (e). Para as células LRP-1-deficiente, a inibição da via de JNK foi conseguida usando tratamento SP600125 (10 uM) (G) ou a sobre-expressão de uma forma negativa dominante de JNK-1 (J), enquanto que a reactivação da via ERK foi obtido pela utilizando um vector de expressão para constitutivamente activa de ERK-2 (I). DMSO (A, F) serviu como controlo para tratamentos com drogas (B, G) e Lipofectamine (C, H) serviu como controlo para testes de transfecção (D, E, I, J). As células foram coradas para filamentos de actina (vermelho) e os núcleos foram contrastadas com DAPI (azul). As imagens são representativos de pelo menos três conjuntos separados de culturas. Bares, 20 um.

activação dependente LRP-1-de inibição de ERK e JNK é necessário para a FA desmontagem em carcinomas-invadindo rápidas

Considerando o impacto da LRP-1 silenciamento em que o adesivo e morfológicas propriedades das células de carcinoma (Figs. 6, 7 e 8), investigou-se o controle LRP-1-mediada de MAPK é necessário para turn-over FA. Assim, a distribuição celular de complexos focais foi analisada em shCTRL e shLRP-1 de células após a activação diferencial das ERK e JNK vias (Fig. 9A a 9J). LRP-1-silenciamento conduziu a uma acumulação de complexos focais numerosos e altamente estruturados na periferia da célula (Fig. 9F vs 9A). A interferência com a activação de ERK em células de controlo com U0126 (Fig. 9B vs 9A) ou uma forma de cinase inactiva de MEK-1 (Fig. 9D vs 9C) aumentou o número e tamanho dos contactos focais contendo talina na mesma medida como se observa em células (Fig. 9F) LRP-1-silenciados. Assim, a sobre-expressão do tipo selvagem MKK-7 /JNK-1 em LRP-1, células de controlo que expressam estimulou a acumulação de estruturas de adesão periféricas contendo talina (Fig. 9E vs 9C). Por outro lado, o número de estruturas ricas em talina foi drasticamente reduzida em células silenciados LRP-1-usando um inibidor selectivo de JNK (Fig. 9G vs 9F) ou a expressão de um JNK-1 mutante negativo dominante (Fig. 9J vs 9H ). Resultados semelhantes foram obtidos quando um de ERK-2-constitutivamente activa foi expressa em células de LRP-1-deficiente (Fig. 9a vs 9H). Estes dados demonstraram que a activação de JNK ou inibição de ERK em células LRP-1-deficient podia restaurar a distribuição inicial dos complexos de adesão. A percentagem de células positivas para FA foi subsequentemente quantificado, como já descrito [17]. Como mostrado na Fig. 9K e 9L, o número de células cancerosas LRP-1-expressam positivos para complexos de adesão rica em talina foi aumentada em cerca de 1,4 vezes sob inibição de ERK (U0126 e DN-MEK) e 1,7 vezes sob activação de JNK (MKK-7 /JNK-1). Em contraste, o aumento do número de contactos focais causada pela LRP-1 silenciamento foi parcialmente revertida por activação de ERK (ERK-CA) ou inibição da JNK (SP600125 e DN-JNK). Consequentemente, LRP-1 aparece como um mediador principal da perturbação de adesão através da regulação das vias de sinalização ERK e JNK.

shLRP-1 células

(A-J) shCTRL (A-E) e (F-J) foram semeadas em placas revestidas com gelatina durante 120 min. via de sinalização de ERK foi inibida em células shCTRL usando 25 U0126? M (B) ou uma MEK-1 mutante de cinase morta (DN-MEK) (D) e reactivada em células shLRP-1 através de uma activação constitutiva de ERK-2 (CA -ERK) (I). O vector MKK-7 /JNK1 foi usado para desencadear a activação de JNK em células shCTRL (E) enquanto que a inibição de JNK em células de LRP-1-deficient foi obtida utilizando um SP600125 10 uM (L) ou um morto-quinase de JNK-1 ( DN-JNK) (J). DMSO (A, F) serviu como um controlo para tratamentos com drogas (B, G) e Lipofectamine (C, H) serviu como um controlo para transfecções (D, E, I, J). As células foram então coradas para a talina (verde) e os núcleos foram contrastadas com DAPI (azul). As imagens são representativos de pelo menos três conjuntos separados de culturas. Bares, 20 um. (K, l). A percentagem de células positivas para adesões focais foi quantificado seguindo a modulação das actividades de ERK e JNK, utilizando tratamentos selectivos de drogas (k) ou o constructo de MAPK indicada (G). Para cada condição foram avaliadas três centenas de células de três experiências separadas. Os resultados foram expressos em por cento, em comparação com as células tratadas com DMSO shCTRL (K) ou lipofectamina (G). *,

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LRP-1 está ligada a componentes do citoesqueleto e FA e controla o recrutamento de MAPK ativo para focal complexos

Para esclarecer o mecanismo molecular pelo qual LRP-1 controla a FA dinâmica e do citoesqueleto organização através da regulação MAPK, ensaios de imunoprecipitação foram realizados (Fig. 10). Os dados apresentados na Figura 10A revelou que α-actinina, talina e paxilina interagir com a LRP-1-β cadeia em células de carcinoma de fast-invasoras. Curiosamente, também detectada uma associação entre a PRL-1 e fosfo-SHP-2 (contendo o domínio de tirosina-proteína-fosfatase-2 SH2), PP2A (serina /treonina proteína fosfatase 2A), e PAK (p-21-cinase activada) activa que são reguladores-chave de sinalização MAPK. Outros relés molecular, tais como Ras e MEK também foram encontrados associados a LRP-1-ICD (Fig. S2). A composição de complexos contendo talina foi então analisada em células LRP-1-silenciados em comparação com células de controlo do tumor (Fig. 10B). Como esperado, observou-se um aumento da quantidade de talina em células LRP-1-deficiente. Além disso, a quantidade de paxilina em complexos contendo talina foi especificamente alterada sob LRP-1 enquanto que o silenciamento α-actinina não foi. Curiosamente, as formas activas de ERK foram detectados principalmente em complexos contendo talina de células LRP-1-expressam. Além disso, observou-se uma forte acumulação de fosfo-JNK nestes complexos sob LRP-1 silenciamento.

shCTRL e células shLRP-1 foram plaqueadas em superfícies revestidas com gelatina e extractos de células inteiras foram utilizadas para realizar as experiências de imunoprecipitação (IP). (A) Imunoprecipitação do LRP-1-contendo complexos foi realizada usando os anticorpos monoclonais anti-LRP-1 (8G1). Os imunocomplexos foram então imunotrans (IB), usando anticorpos específicos para a LRP-1-cadeia β, α-actinina, talina, paxilina, fosfo-SHP-2, PP2A e PAK. (B) Talin complexos contendo foram imunoprecipitados e analisados ​​por Western-blot utilizando anti-talina, anti-fosfo-ERK, anti-fosfo-JNK, anti-α-actinina e anticorpos anti-paxilina. IgGs não específicos foram utilizados como controle negativo de ensaios de imunoprecipitação.

Discussão

Considerando a falta de conhecimento molecular sobre LRP-1 no campo do cancro, nós investigamos a rede de sinalização intracelular de ligação LRP-1 para o comportamento agressivo de células tumorais. Os nossos resultados evidenciaram que a PRL-1 mantém as células malignas em um estado adesivo favorável para a invasão, controlando ERK e JNK dependente de vias.

demonstrou pela primeira vez que a PRL-1 em células de carcinoma desencadeia a activação mediada por soro de ERK e é responsável pela inibição constitutiva de JNK. Consistente com os nossos resultados, estudos prévios relataram uma diminuição da fosforilação de ERK-1/2 em células não tumorais LRP-1 deficientes em [15], [32]. Por outro lado, Ma e colaboradores relataram que a PRL-1 pode reprimir a activação de ERK para controlar a mobilidade de células [31]. Em células de fibrossarcoma HT1080, Webb e colaboradores demonstraram que a deficiência de LRP-1 levou a um aumento do nível de ERK fosforilada que estimula a migração celular e invasão [33]. Nestes estudos, a activação de ERK em células LRP-1-deficient necessária a expressão de uPAR, o receptor de uPA, o qual se liga vitronectina. Estes resultados parecem ser altamente vitronectina dependente desde interacção uPAR-vitronectina é bem conhecido por ser suficiente para iniciar mudanças jusante na migração celular e na transdução de sinal [34]. A capacidade de LRP-1 para mediar a captação endocítica de uPAR e infra-regular a quantidade de superfície celular do uPA: uPAR complexo foi frequentemente evocada a explicar o controle da activação de ERK pela LRP-1 [31], [33], [35 ]. No entanto, shRNA mediada knock-down de LRP-1 não afectou o nível da superfície celular de uPAR no nosso modelo [17]. Embora a ativação ERK foi relatado em resposta à ligação do ligando a LRP-1 [15], [19], [32], [36], uma visão clara dos mecanismos subjacentes ainda está faltando.