Abstract

A quinase Nek11 é um mediador potencial do DNA danos resposta cuja expressão é regulada nos cancros colo-rectais fase precoce (CRCs). Aqui, usando depleção RNAi-mediada, que examinaram o papel de Nek11 em HCT116 e células WT CRC p53 expostas à radiação (IV) ou o fármaco quimioterapêutico, irinotecano ionizante. Nós demonstramos que a depleção de Nek11 impede a G2 /M de captura induzida por estes agentes genotóxicos e promove a apoptose dependente de p53, tanto na presença como na ausência de danos no ADN. Curiosamente, a depleção Nek11 também levou a perda a longo prazo da viabilidade das células que era independente de p53 e exacerbadas após a exposição IR. células de CRC expressar quatro variantes de splicing de Nek11 (G /S /C /D). Estes são predominantemente citoplasmática, mas que são submetidos vaivém nucleocitoplasmático mediada através de sinais de importação e exportação nuclear adjacentes no domínio não catalítico C-terminal. Em células HCT116, Nek11S em particular, tem um papel importante na resposta a danos no ADN. Estes dados fornecem fortes evidências de que Nek11 contribui para a resposta das células CRC a agentes genotóxicos e é essencial para a sobrevivência com ou sem exposição a danos no DNA

Citation:. SR Sabir, Sahota NK, Jones GDD, Fry AM (2015) Perda de Nek11 Previne G2 /M detenção e promove a morte celular em células de cancro colo-rectal HCT116 expostos ao DNA terapêutico agentes prejudiciais. PLoS ONE 10 (10): e0140975. doi: 10.1371 /journal.pone.0140975

editor: Claude Prigent, Institut de Genética e Développement de Rennes, França |

Recebido: 15 Agosto, 2014; Aceito: 03 de outubro de 2015; Publicação: 26 de outubro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Sabir et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento: Este trabalho foi apoiado por subsídios a AMF de The Wellcome Trust (082.828; https://www.wellcome.ac.uk), Cancer Research UK (. C1420 /A9363; https://www.cancerresearchuk.org), Associação de Câncer Research International (AICR 13-0042; https://www.aicr.org.uk), e uma bolsa de estudo de doutoramento da Universidade de Leicester (http : //www.le.ac.uk). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é o terceiro câncer mais comumente diagnosticado no mundo ocidental. o tratamento padrão atual para pacientes com CCR após a cirurgia envolve combinações de quimioterapia que geralmente incluem agentes que danificam o DNA. Por exemplo, muitos pacientes recebem Folfiri como terapia de primeira linha, uma combinação de ácido folínico, 5-fluorouracilo (5-FU) e irinotecano [1]. 5-FU é um análogo da pirimidina que bloqueia a síntese de ADN através da inibição da polimerase de ADN, enquanto que o ácido folínico potencia o efeito do 5-FU por inibição da timidilato-sintase. O irinotecano é um inibidor da topoisomerase I, que provoca quebras de ADN de cadeia simples, os quais são geralmente em seguida, convertido em quebras de cadeias duplas (DSB). Estes ativar a postos de controle de danos ao DNA e causar parada do ciclo celular em G1 /S ou G2 /M.

O DNA danos resposta (DDR) é uma rede complexa de processos celulares que levam a múltiplos resultados, incluindo a reparação do ADN , a paragem do ciclo celular, senescência e a apoptose [2, 3]. O resultado específico é determinada por vários fatores, incluindo o nível eo tipo de dano, e integridade de diferentes vias de DDR. O sucesso de agentes que danificam o DNA no tratamento do câncer depende do aumento da sensibilidade das células cancerosas de rápido ciclismo que enfraqueceram vias de DDR. Estas diferenças para as células normais proporcionar a janela terapêutica necessária para a eficácia. No entanto, a seleção atual desses agentes com base predominantemente do tipo de tumor está associado com uma toxicidade significativa e uma melhor compreensão do que fatores determinam a resposta a estas drogas levaria a tratamentos mais refinados e personalizados.

vias de DDR são iniciadas através da ativação de ATM ou ATR em resposta a LAP, garfos de replicação paralisadas ou mudanças na estrutura da cromatina associada a adutos de DNA [2, 3]. Para iniciar a paragem do ciclo celular, estas quinases fosforilam alvos a jusante incluindo Chk1, Chk2 e p53. Fosforilação de p53 leva à sua estabilização e aumento da expressão de seu alvo transcricional, p21. Chk1 e Chk2 fosforilar e inactivar a fosfatase Cdc25 através da promoção da sua degradação ou sequestro citoplasmático. Juntos, o aumento da expressão de p21 e perda de função de Cdc25 bloquear a activação das CDK necessário para G1 /S e G2 /M transições. No entanto, isto representa uma pequena ideia do que estão agora a ser entendida percursos altamente complexos que envolvem muitos outros enzimática, regulamentar e componentes estruturais.

Um conjunto de proteínas que estão começando a emergir como importantes reguladores da DDR são a relacionada com o NIMA, ou NEK, família de proteína-quinase [4]. Esta família é composta por onze membros, dos quais pelo menos quatro, Nek1, Nek8, Nek10 e Nek11, ter suspeitas papéis no DDR [5-10]. Nek11 foi o primeiro destes a ser implicado quando a sua actividade de quinase foi encontrada em níveis elevados em células expostas a agentes que danificam o ADN e inibidores da replicação [9]. Além disso, esta actividade é perdida após a adição do inibidor /ATR ATM, cafeína, sugerindo que Nek11 actua a jusante de ATM ou ATR. Estudos mais recentes revelaram que mecanicistas Nek11 é activada através de fosforilação de Ser-273 por Chk1 após exposição de células a radiação ionizante (IR) [7]. Activado Nek11 é capaz de fosforilar Cdc25A em sites dentro de um phosphodegron que promove o recrutamento de β-TRCP. Este, por sua vez, leva a degradação mediada por ubiquitina do Cdc25A e paragem do ciclo celular [11-13]. No entanto, outros têm argumentado que a degradação dependente da fosforilação de Cdc25 é mediada por quinases alternativos, tais como a caseína-quinase 1 [14, 15]. No entanto, Nek11 também tem sido relatada como sendo um biomarcador cancro potencialmente relevantes como Nek11 expressão elevada foi detectada num conjunto de adenomas colorectais [16]. Nós, portanto, a intenção de testar se Nek11 é necessário para a resposta das células CRC a agentes que danificam o DNA clinicamente relevantes, bem como buscar evidências adicional para um papel para Nek11 na RDA.

Resultados

Nek11 é necessário para G2 induzida pelo IR /M detenção de células HCT116

para explorar como Nek11 pode contribuir para as células DDR de CRC, foi estabelecido um protocolo que permitiu a progressão do ciclo celular a ser monitorado por citometria de fluxo seguinte depleção Nek11 e exposição IV (Fig 1A). Nek11 foi empobrecido usando um de dois siRNAs distintas com a eficácia destes oligonucleótidos confirmada após 72 horas de transfecção por RT-PCR e Western blot (S1A e S1B figura). Utilizando um intervalo de dose de IR, determinou-se que a linha celular HCT116 CRC exibiu um grande aumento na G2 /M fracção 16 horas após exposição com 10 Gy IV (S1C figura). Por isso, nestas experiências, as células foram primeiro transfectados com controlo (GL2 luciferase) ou Nek11 siRNAs e, em seguida, depois de 56 horas, que foram ou não tratados ou expostas a 10 Gy de IV. Seguindo mais 16 horas, eles foram recolhidos para análise por iodeto de propídio (PI) à base de citometria de fluxo (Fig 1B e 1C, S1D, S1E, S2A e S2B Figs).

A. Representação esquemática de tempo-curso para tratamentos com células. 24 horas após a sementeira, as células foram transfectadas com ARNsi de oligonucleótidos. 56 horas mais tarde, as células foram ou não tratados ou irradiados (± IR). Eles foram, em seguida, recolhidas e fixadas por citometria de fluxo à base de PI, após mais 16 horas. B C. Seguindo o protocolo descrito em A, HCT116 WT e células sem p53 foram transfectadas com ARNsi como indicado e não tratada (B) ou tratados com 10 Gy de IV (C), antes da análise por citometria de fluxo. Distribuição de células de acordo com o perfil de citometria de fluxo é indicada (2n, G1; 2n-4n, S; 4n, G2 /M). D-L. Os histogramas representam percentagem de células (F, G) ciclismo HCT116 WT (D, E) e p53 nulo em G2 /M. H-K. Os histogramas mostram a percentagem de todas as células HCT116 WT (H, I) e p53-null (J, K) com ADN sub-2N. Histogramas em DK foram obtidos de dados mostrados na B e C.

valores p Quais são calculados em relação ao siGL2.

Usando este protocolo, nenhuma mudança significativa foi observada na fração do ciclismo as células na fase G2 /M do ciclo celular após a depleção Nek11 sem IV (~ 30%; Figura 1D). No entanto, após a exposição de IV, células esgotadas de Nek11 exibiu uma redução substancial da fracção G2 /M, em comparação com células esgotadas com oligonucleótidos de controlo, com siNek11-2 causar um retorno para o nível basal de G2 /M células (Figura 1E). Notamos que siNek11-2 deu um knockdown mais robusta do que siNek11-1 por RT-PCR e transferência de Western. Para examinar o papel da p53 nesta resposta, a mesma abordagem experimental foi aplicado a isogénico HCT116 p53 nulo (

p53 – /-) células. Depleção de Nek11 sozinha de novo não teve nenhum efeito significativo sobre a distribuição do ciclo celular na ausência de IR, enquanto que houve uma redução marcante na G2 M prisão /em resposta ao tratamento IR após a depleção Nek11 (Fig 1F e 1G). No entanto, neste caso, nem siARN causou um retorno completo para níveis basais de G2 /M células, sugerindo que a perda de controlo G2 do ponto de verificação /M, na ausência de Nek11 é parcialmente p53-dependente.

Para além de permitindo que a distribuição do ciclo celular a ser determinada, a citometria de fluxo de análise revelou a presença de morte celular, tal como indicado pelo pico sub-2N. A comparação da percentagem nesta fracção (em relação a todas as células na amostra) revelou um modesto aumento na morte celular após depleção Nek11 sem IR, apesar de significância (p 0,05), apenas foi alcançada com um oligonucleótido (Figura 1H). No entanto, a morte celular aumentada para uma maior extensão na Nek11 empobrecido amostras após a exposição IV sugerindo que o tratamento combinado melhorada morte celular (Figura 1I). Em contraste, houve apenas um ligeiro aumento na população sub-2N de células sem p53 HCT116 seguintes depleção Nek11 antes da exposição ao IV e, embora houvesse mais células na fracção sub-2N após exposição IR, não houve um aumento consistente após depleção Nek11 (Figura 1J e 1K). Concluímos, portanto, que a indução da morte celular que resulta da perda Nek11 combinadas e exposição de IR é em grande parte dependente de p53.

Nek11 é necessária para impedir a apoptose e promover a sobrevivência celular a longo prazo

Como fluxo baseado em PI citometria de morte celular indicado após a depleção Nek11, com ou sem exposição IR, decidimos para medir especificamente a apoptose. Para isso, o mesmo protocolo foi seguido como antes, excepto que a citometria de fluxo foi realizada utilizando anexina V coloração à base de medir a perda de assimetria de fosfolípido da membrana plasmática que surge durante a apoptose. Depleção de Nek11 sem exposição IR levou a um aumento de ~ 2-3-vezes na apoptose em células HCT116 WT Nek11 confirmando que promove a sobrevivência na ausência de danos no ADN (Fig 2A). Além disso, enquanto a exposição a 10 Gy IR sozinho não aumentou a percentagem de células que sofrem apoptose HCT116 WT, houve um aumento na fracção apoptótica após a depleção Nek11 combinadas e exposição IV em comparação com Nek11 depleção sozinho (Fig 2B). Nas células sem p53 HCT116, depleção Nek11 sozinha não causou um aumento significativo na apoptose, enquanto que houve apenas um pequeno aumento da apoptose em células sem p53 HCT116 quando depleção Nek11 foi combinado com IR (fig 2C e 2D). Estes dados são consistentes com os obtidos utilizando coloração à base de PI e indicam que a perda de Nek11 conduz a uma indução dependente de p53 de apoptose que é exacerbado pela exposição IR.

A-D. Seguindo o protocolo descrito na figura 1A, HCT116 WT (A, B) e as células sem p53 (C, D) foram transfectadas com ARNsi como indicado, antes da irradiação e por análise de fluxo baseado no anexina V citometria. Os histogramas representam a percentagem de todas as células em apoptose.

p

valores são em relação ao siGL2. E. HCT116 WT e células sem p53 foram transfectadas com siRNAs como indicado e depois de 56 horas tratados ± 2 Gy IR. As células foram recolhidos após mais 16 horas e semeadas em ensaios clonogénicos (50 células por placa de siGL2, 500 células por placa de outros tratamentos). As colónias foram coradas com violeta de cristal. F. As colónias de E foram contados e determinada% de sobrevivência, tal como descrito em Materiais e Métodos. células sem p53 G. HCT116 foram transfectadas com qualquer siGL2 ou siNek11-2 e depois de 56 horas, quer não tratadas esquerda ou irradiados. As células foram fixadas 48 horas pós IR e coradas com anticorpo α-tubulina (verde). DNA foi corado com Hoechst para observar a morfologia nuclear. Barras de escala, 10 um. H. histograma representa a percentagem de células que exibem vários núcleos seguintes os tratamentos indicados, conforme descrito no G. 500 células foram contadas por amostra e a percentagem média de células multinucleadas foi determinada através de dois experimentos independentes.

Para examinar a sobrevivência a longo prazo, foram realizados ensaios clonogénicos em que as células foram esgotadas com controlo ou ARNsi Nek11 durante 56 horas e, em seguida, expostos a uma dose mais baixa (2 Gy) de IV antes do plaqueamento para fora 16 horas mais tarde. Após duas semanas, as colónias foram fixadas e contadas (Figura 2E e 2F). Em primeiro lugar, isto demonstrou que, mesmo em amostras de controlo empobrecido, esta dose de IV era suficiente para fazer com que (~ 3 vezes) Número de colónias não só nas células HCT116 WT, mas também a HCT116 células sem p53 substancialmente reduzidas. Assim, embora IR não induz a morte celular ou apoptose substancial em curtos intervalos de tempo após a exposição, que não causa perda a longo prazo de sobrevivência que ocorre de um modo independente de p53. Curiosamente, a depleção de Nek11 só também teve um efeito deletério sobre a sobrevivência fortemente com uma redução de 5 vezes no número de colónias em células HCT116 WT. Novamente, uma redução semelhante no número de colónias foi observado com as células sem p53 HCT116. A combinação da depleção Nek11 e exposição IR LED para a maior perda de viabilidade com redução de 10 vezes no número de colónias em ambas as HCT116 WT e células sem p53 ~. Por conseguinte, conclui-se que a sobrevivência a longo prazo das células HCT-116 é drasticamente reduzida, em resposta à exposição ao IV, depleção Nek11 ou uma combinação de ambos. Além disso, essas respostas não são dependentes de p53, indicando que vias de morte independente de p53 são ativados.

Para verificar se a perda a longo prazo da sobrevivência celular após estes tratamentos podem resultar de uma catástrofe mitótico, simulada ou Nek11- células HCT116 decréscimos foram ou não tratados ou expostos a IR e, em seguida, fixo por análise microscópica após mais 48 horas. A presença de grandes células multinucleadas indicativos de divisões mitóticas falharam (ou seja, de catástrofe mitótica) foram observados em resposta a qualquer um esgotamento Nek11 ou exposição IV (Figura 2G). No entanto, a quantificação das células multinucleadas revelou que a depleção de Nek11 sozinho conduziu a um relativamente pequeno frequência de catástrofe mitótica, ao passo que uma frequência substancialmente mais elevado foi observado em resposta ao tratamento IV sozinho (figura 2H). Resultados semelhantes foram observados em ambos WT e células sem p53, excepto que catástrofe mitótica em resposta a IV era ainda mais pronunciada nas células sem p53 consistentes com relatórios anteriores [17, 18]. Os níveis elevados de catástrofe mitótica induzidas por IV sozinho sugerem que esta é uma das principais causas da viabilidade reduzida visto nos ensaios clonogénicos. No entanto, os níveis mais baixos de catástrofe mitótica induzida pela depleção de Nek11 sozinho em vez argumentar em favor de mecanismos alternativos de formação de colónias reduzida, como senescência induzida por danos.

Nek11 medeia /M detenção G2 em células HCT116 tratados com irinotecan

pacientes com CCR recebam frequentemente irinotecan, um inibidor da topoisomerase I, como parte de seu tratamento de quimioterapia. fluxo à base de PI citometria confirmou que as células HCT116 exibem uma resposta de dose para este agente de danificação do ADN, com uma acumulação de células em G2 /M, a seguir 24 horas de tratamento (Fig S3A). Um protocolo foi, portanto, utilizado que nos permitiu comparar a resposta de HCT116 WT e células sem p53 de irinotecano ao observado para o IR. Neste caso, as células foram esgotadas de Nek11 durante 52 horas antes da adição de irinotecano a 5 uM. Após mais 20 horas, as células foram colhidas para análise por citometria de fluxo (Fig 3A-3C e Fig S2C e S2D). Em primeiro lugar, este revelou que, tal como com IV, a acumulação de células HCT116 WT em G2 /M, em resposta ao irinotecano foi suprimido após a depleção Nek11 (Fig 3D e 3E e Fig S3B). Da mesma forma, irinotecan induziu um G2 /M prisão em células sem p53 HCT116 que foi parcialmente suprimida por Nek11 esgotamento (Fig 3F e 3G e S3C Fig). Quanto à exposição IR, observou-se que a depleção Nek11 sozinho induziu um nível modesto de morte celular, mas isso foi reforçada em combinação com irinotecan em células HCT116 WT (Fig 3H e 3I). Em contraste, foi observado um nível mais baixo e menos consistentes de morte celular nas células sem p53 HCT116 após a depleção Nek11 com ou sem irinotecano (Figura 3J e 3K). Concluímos, portanto, que o irinotecano também induz uma Nek11 G2-M dependente prisão /que é, em parte, dependentes do estado de p53 em células HCT116, e que a morte celular aumenta quando combinado com irinotecano depleção Nek11 de uma forma que é dependente de p53. Assim, Nek11 é susceptível de desempenhar um papel semelhante na resposta das células HCT116 para IR e irinotecano.

A. Representação esquemática de tempo-curso para tratamentos com células. 24 horas após a sementeira, as células foram transfectadas com ARNsi de oligonucleótidos. 52 horas mais tarde, as células foram ou não tratados ou tratados com 5 jiM de irinotecano. Eles foram, em seguida, recolhidas e fixadas por citometria de fluxo à base de PI, após mais 20 horas. B C. Seguindo o protocolo descrito em A, HCT116 WT e células sem p53 foram transfectadas com ARNsi como indicado e não tratada (B) ou tratadas com o irinotecano (C), antes da análise por citometria de fluxo. Distribuição de células de acordo com o perfil de citometria de fluxo é indicada (2n, G1; 2n-4n, S; 4n, G2 /M). D-L. Os histogramas representam percentagem de células (F, G) ciclismo HCT116 WT (D, E) e p53 nulo em G2 /M. H-K. Os histogramas mostram a percentagem de HCT116 WT (H, I) e p53-null (J, K) células com ADN sub-2N. Histogramas em DK são baseados em dados em B e C.

p

valores são em relação ao siGL2.

Identificação de quatro variantes de processamento Nek11 que sofrem nucleocitoplasmático vaivém

a primeira caracterização de Nek11 humana descrita duas variantes de processamento, uma versão longa de 74 kDa, denominada Nek11L, e uma versão curta de 54 kDa, denominada Nek11S [9]. Através da análise de bases de dados de expressão de genes, foram identificadas mais duas variantes de processamento putativos que nós denominados Nek11C e Nek11D, com tamanhos previstos de 56 e 69 kDa, respectivamente. Todas as quatro variantes tem uma sequência N-terminal idêntico de 466 resíduos, que abrange o domínio catalítico e duas previu coiled-bobinas. Nek11S e Nek11C terminar logo depois, embora com diferentes sequências. Nek11L e Nek11D ter mais prolongado C-terminais, inicialmente compartilhando um adicional idêntica ~ 50 resíduos antes de terminar com sequências alternativas (Fig 4A). Para determinar se estas variantes tinham propriedades distintas, primeiro gerado células U2OS que expressavam estavelmente versões de GFP marcadas com cada variante Nek11. Estas células foram usadas para os efeitos de estudos de localização subcelular, embora tenha sido demonstrado que a depleção Nek11 perturba a DDR nestas células [7]. Nós também gerou uma linha celular U2OS expressar uma versão ‘cinase-dead “(KD) de Nek11L com mutação em dois resíduos catalíticos essenciais (K61R /D158A) para determinar se a localização pode ser dependente de atividade.

A. Representação esquemática das isoformas da proteína quatro Nek11. O C-terminais diferentes e são indicados linhas a tracejado indicam as posições em que as proteínas divergem. As posições de domínio quinase, enrolados-coils, números de resíduos e pesos moleculares previstos são indicados. B. Os lisados ​​de U2OS: linhas celulares estáveis ​​GFP-Nek11 ou células parentais U2OS foram analisadas por SDS-PAGE e Western blotting com anticorpos contra Nek11, GFP e α-tubulina. C. células U2OS foram transfectadas com as construções indicadas e, após 20 horas, tratou-± MG132 durante 4 horas. Os lisados ​​foram analisados ​​por Western blot com anticorpos indicados. M.wts. (KDa) são indicados à esquerda em linhas de células B e C. D. única GFP e GFP-Nek11 como indicado foram tratadas ± LMB durante 3 horas antes da fixação e coloração com anticorpos para GFP. As barras de escala, 5 uM.

análise de mancha de Western revelou que a variante de GFP-Nek11D foi expresso em níveis muito reduzidos em comparação com as outras variantes em linhas celulares estáveis ​​(Figura 4B). A incubação com o inibidor de proteassoma, MG132, levou a supra-regulação selectiva desta isoforma o que sugere que a variante Nek11D é único entre estes quatro variantes possuindo sequências que têm como alvo que para a degradação mediada por ubiquitina, presumivelmente na sua única extremidade C-terminal (Figura 4C). Microscopia de imunofluorescência revelou que, embora as isoformas Nek11L e Nek11D foram restrito para o citoplasma, Nek11S Nek11C e foram detectadas tanto no citoplasma e no núcleo (Fig 4D). Nek11L cinase morta foi restringido para o citoplasma, como a proteína de tipo selvagem. Como Nek11 foi relatado para localizar a nucléolo [19], que avaliou se as variantes pode shuttle entre o citoplasma e núcleo. Inibição de exportação nuclear com o inibidor CRM1, leptomycin B (LMB), causada todas as quatro variantes Nek11 a acumular-se no núcleo, embora sem concentração óbvio no nucléolo. Cinase morta Nek11L também sofreu vaivém nucleocitoplasmático indicando que este não está dependente da sua actividade enzimática.

Identificação de sequências que regulam vaivém nucleocitoplasmático de Nek11

Para mapear as regiões da proteína necessários para a importação nuclear e exportação, analisou-se a localização de uma série de mutantes de truncagem Nek11 (Fig 5A). O domínio catalítico N-terminal por si só (resíduos 1-287) localizadas no citoplasma, e não de transporte. Em contraste, o domínio não catalítico de terminal-C de Nek11L (resíduos 288-645) foi citoplasmática na ausência de LMB mas concentrada no núcleo com LMB. Isso indica que ele contém motivos necessárias para transportar nucleocitoplasmático (Fig 5B e 5C). Como sequências de localização e de exportação nucleares canônicas não estavam presentes, geramos cinco construções adicionais que representam truncagens C-terminal de Nek11L (Fig 5A e 5D). Uma construção que abrange o domínio catalítico e ambos os motivos em espiral espiralada (resíduos 1-388) foi nuclear independentemente do tratamento LMB, enquanto que uma construção de extensas englobando os resíduos 1-541 comportou-se como proteína de comprimento total sendo citoplasmática em células não tratadas e nuclear com LMB ( Figura 5E). Uma construção que representou a região conservada entre todas as quatro Nek11 variantes, 1-466, exibiu uma distribuição nuclear-citoplasma mais iguais que lembra o S e C variantes que terminam logo após este ponto. Semelhante a essas variantes, este constructo concentrada no núcleo após tratamento LMB. Por isso, propõe-se que as regiões de espiral enrolada conter sequências necessárias para a importação nuclear, enquanto que a região entre os resíduos 388 e 465 contém sequências necessárias para a exportação nuclear.

. Representação esquemática de construções de GFP-Nek11L utilizados para examinar a localização subcelular. localização predominante para o citoplasma (C), o núcleo (N) ou igual distribuição (C /N) ± LMB tratamento é indicado. B. manchas de Western com GFP e anticorpos alfa-tubulina de lisados ​​preparados a partir de células U2OS transfectadas transientemente durante 24 horas com as construções indicadas Nek11L. domínio de cinase inclui os resíduos 1-287 e C-terminal do domínio inclui os resíduos 288-645. M. WTS (kDa) são indicados à esquerda. C. células U2OS foram transfectadas com as construções indicadas e, após 24 horas, tratou-se ± LMB durante 3 horas antes da fixação e coloração com anticorpos para GFP. D E. Ocidental borrões e imunofluorescência coloração foi realizada como em B e C, respectivamente, com as construções indicadas. As barras de escala, 5 uM.

Nek11S desempenha um papel chave no ADN G2 induzida pelo dano /M prisão em células HCT116

Para determinar se todas as quatro variantes de splicing Nek11 são expressos em HCT116 células, assim como a três outras linhas de células de CRC (HT29, SW480 e SW620), RT-PCR foi realizada com os iniciadores específicos de isoforma (S4A e Fig S4B). Estes mRNAs identificados para cada variante em todas as quatro linhas celulares, com Nek11L e Nek11C consistentemente sendo o mais e menos abundante, respectivamente (S4C figura). Em seguida, em relação a sua abundância nestas linhas celulares de CRC em relação ao que na linha colonocyte humanas imortalizadas, HCEC. Isto indicou notável variação com o aumento Nek11S em HT29 e aumentou Nek11C em SW620 (Fig S4D). Caso contrário, os níveis de cada variante foram semelhantes ou reduzida em comparação com as células HCEC.

Para testar a contribuição destas variantes de processamento para a DDR em células HCT116, dois conjuntos de ARNsi foram validados, um que co-esgota ambas as isoformas mais longos, e Nek11L Nek11D, e uma que se esgota selectivamente Nek11S (Fig S4E). Estes foram, em seguida, aplicado a WT HCT116 e células sem p53, utilizando os protocolos descritos anteriormente para analisar as respostas à RI e irinotecano por citometria de fluxo à base de PI (Fig S5). Em células HCT116 WT, houve uma redução modesta na G2 /M sobre população depleção de Nek11L /D em resposta a IV, mas não em resposta ao irinotecano. Em contrapartida, houve uma redução substancial no G2 /M população em resposta a ambos os tratamentos após o esgotamento dos Nek11S (Fig 6A-6C, S2E e S2F Fig). No HCT116 células sem p53, uma pequena mas significativa redução na G2 /M população foi visto sobre Nek11L depleção /D em resposta a irinotecano, mas não IV, ao passo que Nek11S depleção levou a uma redução significativa em resposta a ambos os tratamentos (figura 6D -6F). Como para a depleção do total Nek11, foi notável que a fracção de G2 /M células retornou aos níveis basais após esgotamento de Nek11S no WT, mas não células sem p53. Assim, embora a eficiência esgotamento relativo pode variar, estes dados indicam que pelo menos Nek11S desempenha um papel importante na mediação de DNA-danos induzidos G2 /M prisão em células HCT116, confirmando que esta resposta é, em parte, dependente de p53.

AL. Utilizando os protocolos descritos na Fig 1A em termos de irradiação e a Fig 3A para o tratamento de irinotecano, HCT116 WT (AC, GI) e células HCT-116 do p53-null (DF, JL) foram transfectadas com oligonucleidos de siRNA para co-esgotar Nek11L e Nek11D (L /D ), ou empobrecem Nek11S ou luciferase (siGL2). Os histogramas mostram a percentagem de células em divisão em G2 /M (A-F) e do total de células com ADN sub-2N (G-G).

P

valores são em relação ao siGL2 para cada tratamento.

Exame da população sub-2n através de citometria de fluxo à base de PI revelou que a depleção de Nek11S, mas não Nek11L /D, resultou num aumento significativo na morte celular em células HCT116 WT expostos a IR ou irinotecano (Figura 6G-6I). Depleção de Nek11S, mas não Nek11L /D, também levou a níveis significativos de morte celular em células sem p53 expostos a IR ou irinotecano (Fig 6J-6L). Este último resultado foi inesperado tendo em conta as observações anteriores de que a morte celular em células Nek11-empobrecido expostos a estes tratamentos é dependente de p53. No entanto, o esgotamento dos Nek11S também levou a um aumento significativo na morte celular na ausência de tratamento genotóxico em células sem p53, sugerindo que esta não era uma resposta específica a danos no DNA exógeno.

Discussão

estudos anteriores revelaram que a actividade de quinase de Nek11 é estimulada em células HeLa expostos a agentes que danificam o ADN e inibidores da replicação [9]. Além disso, foi identificada em Nek11 uma tela de genes necessários para a G2 /M prisão em células U2OS expostos a IV, com Nek11 promover Cdc25A degradação jusante de Chk1 [7]. Aqui, mostramos que a perda de Nek11 anula G2 /M prisão e reduz a sobrevivência celular em células HCT116 CRC expostas quer a IR ou o agente quimioterapêutico, irinotecano. Além disso, mostramos que sofre de vaivém Nek11 nucleocitoplasmático de um modo reminiscente de outras proteínas DDR. Essas descobertas fornecem evidências adicionais de que Nek11 é um importante mediador da resposta a danos G2 /M do ADN, bem como sendo necessária para a sobrevivência de células de CRC.

Células normais expostas a danos no ADN prisão principalmente no G1 /S de transição . No entanto, este ponto de verificação é por vezes ausente em células cancerosas que perderam tanto p53 ou Rb. Estas células são, portanto, mais dependente da G2 /M do ponto de verificação, quando expostos a agentes que danificam o DNA. Os nossos estudos revelaram que, embora a exposição de células HCT116 para ambos RI e irinotecano conduziu a um aumento significativo na fracção G2 /M, consistente com a activação do G2 /M do ponto de verificação, esta fracção foi substancialmente reduzida após a remoção da Nek11. Nas células WT, depleção Nek11 reduzida a fracção G2 /M para o nível da linha de base presente numa população de ciclismo apoiando um papel potencial para Nek11 na fase G2 /M do ponto de verificação em células HCT116. No entanto, nas células sem p53, a fracção G2 /M, embora significativamente reduzidas, manteve-se acima da linha de base. Isto sugere que não só impõe Nek11 um independente de p53 G2 /M detenção seguinte danos no DNA, mas, além disso, impede uma perda dependente de p53 de células G2 /M (Fig 7).

Este modelo esquemático ilustra a papéis de Nek11 proposto na resposta de células de CRC para os agentes que perturbam a integridade do DNA quer através de dano de ADN directa ou replicação parado. Estudos anteriores indicaram que Nek11 encontra-se a jusante da ATM /ATR e Chk1 e age para prevenir a progressão da mitose através da promoção de degradação do Cdc25A. Os nossos resultados revelam que em células de CRC, Nek11 é necessário não só para assegurar a G2 /M de captura, mas também para proteger contra a apoptose dependente de p53. A falha da G2 /M do ponto de verificação pode levar à morte celular de um modo independente de p53, em parte, através de catástrofe mitótica.

De acordo com isto, foi observado um aumento modesto no número de células na sub fracção 2n, indicativo de células moribundas, em que as células WT-Nek11 empobrecido expostos a IR ou irinotecano que não foi observado com as células sem p53. Da mesma forma, a análise específica da fracção de apoptose pelo ensaio de anexina V revelou que uma pequena fracção de Nek11-empobrecido WT, mas não sem p53, as células expostas a apoptose entrou IR ou irinotecano. Assim, na ausência de Nek11, algumas células HCT116 expostos a danos no ADN exógeno submetidos a uma apoptose dependente de p53, ao passo que outros, presumivelmente, re-entrar no ciclo celular de um modo independente de p53.