Abstract

Objetivos

mutações do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR)

genéticas em tumores prever a resposta do tumor aos inibidores EGFR de tirosina-quinase (EGFR-TKI) em não- cancro do pulmão de células pequenas (NSCLC). No entanto, a obtenção de tecido do tumor para análise de mutação é um desafio. Aqui, nós teve por objetivo detectar peptídeos de soro /proteínas associadas com a

EGFR

estado de mutação de genes, e testar se um algoritmo de classificação com base em perfis de proteômica soro poderia ser desenvolvido para analisar

EGFR

estado de mutação de genes para auxiliar tomada de decisão terapêutica.

pacientes e Métodos

O soro coletado de 223 estágio IIIB ou IV NSCLC doentes com conhecido

EGFR

status de mutação genética em seus tumores antes da terapia era analisada por laser de dessorção /ionização por espectrometria de massa assistida por matriz-tempo de voo (MALDI-TOF-MS) e software ClinProTools. Diferenças no soro péptidos /proteínas entre pacientes com

EGFR

gene mutações sensíveis ao TKI e do tipo selvagem

EGFR

genes foram detectados em um grupo de treinamento de 100 pacientes; com base nessa análise, um algoritmo de soro de classificação de proteômica foi desenvolvido para classificar

EGFR

estado de mutação do gene e testado em um grupo de validação independente de 123 pacientes. A correlação entre o

EGFR

estado de mutação de genes, identificados com o classificador proteômica soro e resposta ao EGFR-TKI foi analisada.

Resultados

Nine peptídicas picos /proteína foram significativamente diferente entre os pacientes com NSCLC com

EGFR

gene mutações sensíveis ao TKI e do tipo selvagem

EGFR

genes no grupo de treinamento. Um modelo de algoritmo genético consiste de cinco péptidos /proteínas (m /z 4092,4, 4585,05, 1365,1, 4.643,49 e 4.438,43) foi desenvolvido a partir do grupo de treinamento para separar pacientes com

EGFR

gene mutações sensíveis ao TKI e do tipo selvagem

EGFR

genes. O classificador exibiram uma sensibilidade de 84,6% e uma especificidade de 77,5% no grupo de validação. Nos 81 pacientes do grupo de validação tratado com EGFR-TKI, 28 (59,6%) dos 47 pacientes cujas amostras foram rotuladas como “mutante” pelo classificador e 3 (8,8%) dos 34 pacientes cujas amostras foram rotuladas como ” selvagem “alcançada uma resposta objectiva (p 0,0001). Os pacientes cujos combinado amostras foram rotulados como “mutante” pelo classificador tiveram uma sobrevida significativamente mais longa livre de progressão (PFS) do que os pacientes cujos combinado amostras foram rotulados como “selvagem” (p = 0,001).

Conclusão

Peptídeos /proteínas relacionadas ao

EGFR

estado de mutação do gene foram encontrados no soro. Classificação de

EGFR

estado de mutação de genes utilizando o classificador proteômica soro estabelecido no presente estudo em pacientes com estágio IIIB ou IV NSCLC é factível e pode prever a resposta do tumor ao EGFR-TKI

Citation.: Yang L, Tang C, Xu B, Wang W, Li J, Li X, et al. (2015) Classificação da

Crescimento Epidérmico Receptor do Factor de

Gene Mutation status usando Serum proteômica Profiling prevê a resposta do tumor em pacientes no estágio IIIB ou IV não-pequenas células do cancro do pulmão. PLoS ONE 10 (6): e0128970. doi: 10.1371 /journal.pone.0128970

Editor do Academic: Ramon Andrade de Mello, Universidade do Algarve, PORTUGAL

Recebido: 03 de fevereiro de 2015; Aceito: 21 de março de 2015; Publicação: 05 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento: Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Ministério da Ciência e Tecnologia da República Popular da China (chinês Programa Nacional de Instrumentação, No. 2011YQI70067; URL do site do financiador:. www. most.gov.cn; XQL recebeu o financiamento). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [1]. cancro do pulmão de não-pequenas células (CPNPC) é o tipo histológico mais comum da doença e é responsável por aproximadamente 80% dos cancros do pulmão [2]. Porque mais de 70% dos pacientes com cancro do pulmão são diagnosticados com a doença em estágio avançado [3], o tratamento sistémico desempenha um papel importante no manejo clínico. A quimioterapia tem sido a pedra angular do tratamento para NSCLC por muitos anos. No entanto, os inibidores de factor de crescimento epidérmico tirosina-quinase de receptor (EGFR-TKI), tais como erlotinib, gefitinib e icotinib, têm sido mostrados para melhorar significativamente os resultados clínicos e segurança quando comparada com a quimioterapia, em alguns doentes com NSCLC avançado [4-8]. sensibilidade EGFR-TKI tem sido associado com mutações ativadoras no domínio de cinase do

gene EGFR

, especialmente um

exão 19

exclusão e mutações em

exão 21 (L858R)

e

exão 18 (G719X)

[9-11]. Todos

EGFR

mutações de genes sensíveis ao TKI resultar em activação do domínio da tirosina-cinase EGFR, a qual é o alvo de EGFR-TKI. Portanto, os pacientes com estes

EGFR

gene mutações sensíveis ao TKI têm um significativamente melhor resposta ao EGFR-TKI, enquanto que aqueles com o tipo selvagem

EGFR

genes apresentam uma resposta do tumor pior. Avaliação da

EGFR

estado de mutação do gene é criticamente importante para a tomada de decisão terapêutica.

Comprehensive Cancer Network

Nacional (NCCN) afirmam que o DNA análise mutacional em células tumorais é o método preferido para avaliar

EGFR

estado de mutação do gene. No entanto, em alguns casos, o tecido do tumor, quer seja inadequada para testes moleculares devido ao seu conteúdo de tumor quantidade pequena ou muito baixo ou não está prontamente disponível [3]. Diversos grupos têm detectado

EGFR

mutações de genes em DNA isolado a partir de plasma [3, 12-16] ou de soro de amostras de [17, 18], que servem como substitutos de tecido de tumor; alguns grupos têm demonstrado uma correlação entre o estado de mutação no plasma /soro e tecido tumoral [3, 12, 13, 15-18]. Além disso,

EGFR

mutações genéticas detectadas no plasma ou soro podem ser preditivos da resposta ao EGFR-TKI [3, 13, 14, 16, 18]. No entanto, os métodos utilizados para avaliar

EGFR

estado de mutação de genes em amostras de plasma ou soro não são aprovados pelas diretrizes atuais. Assim, outras abordagens sensíveis e não-invasivos para a avaliação

são ainda precisava de EGFR

estado de mutação de genes utilizando tecidos tumorais substitutos para prever a eficácia EGFR-TKI.

assistida-Matrix dessorção /ionização por laser time-de- espectrometria de massa de voo (MALDI-TOF-MS) é uma técnica sensível, rápido, barato e simples para a análise proteoma em amostras biológicas complexas, tal como o tecido, sangue e urina [19-26]. Os picos no espectro de massa corresponde a iões formados a partir de espécies relativamente abundantes na amostra, em que predominam os péptidos e proteínas. Recentemente, as impressões digitais da massa dos péptidos com base em MALDI-TOF-MS tem sido amplamente utilizada para detectar biomarcadores proteomic de diagnóstico, prognóstico, e preditivo. Em estudos publicados recentemente, as impressões digitais da massa dos péptidos tem sido aplicado com sucesso para analisar soros de pacientes e controlos saudáveis ​​para detectar diferenças em péptidos /proteínas; essas diferenças foram usadas para desenvolver algoritmos de classificação para o diagnóstico da doença [22-25]. Além disso, as impressões digitais da massa dos péptidos pode detectar diferenças em soro /plasma de péptidos /proteínas entre os subgrupos de pacientes com o mesmo tipo de doença. Taguchi [26] e Wu [27] utilizado MALDI-TOF-MS encontrado para analisar soro ou plasma de pacientes com NSCLC; eles observaram diferenças sutis no soro /plasma péptidos /proteínas entre dois subgrupos que apresentaram significativamente diferentes eficácias EGFR-TKI e algoritmos de classificação desenvolvido utilizando diferenciais péptidos /proteínas para prever a eficácia de EGFR-TKI em pacientes com NSCLC. Uma vez que a eficácia do EGFR-TKI tem sido associada com

EGFR

estado de mutação genética, os péptidos /proteínas que constituem os algoritmos de classificação de soro /plasma desenvolvidos por Taguchi e Wu para prever a eficácia de EGFR-TKI pode ser associada com

EGFR

estado de mutação do gene [27, 28].

neste estudo, o objetivo foi detectar peptídeos de soro /proteínas associadas com a

EGFR

estado de mutação genética e testar se uma classificação algoritmo baseado no perfil proteômico do soro poderia ser desenvolvido para a análise de

EGFR

estado de mutação do gene para auxiliar na tomada de decisão terapêutica. Para alcançar este objetivo, foi aplicado fingerprinting da massa dos péptidos utilizando MALDI-TOF-MS juntamente com software ClinProTools para analisar o soro de 223 pacientes com NSCLC com um conhecido

EGFR

estado de mutação do gene (ou seja, determinadas por amplificação sistema de mutação refractária [ARMS ] no tecido tumoral) e detectar diferenças de soro péptidos /proteínas entre pacientes com NSCLC com

EGFR

gene mutações sensíveis ao TKI e pacientes com NSCLC com o tipo selvagem

EGFR

genes. Foi desenvolvido um classificador proteômica do soro para avaliar

EGFR

estado de mutação do gene e testou o classificador em um grupo de validação independente. Foram também analisadas as correlações entre

EGFR

estado de mutação de genes, conforme identificado pelo classificador proteômica soro e resposta ao EGFR-TKI para testar a utilidade potencial de

EGFR

estado de mutação do gene identificado pelo classificador proteômica do soro para prever a resposta clínica ao tratamento EGFR-TKI.

pacientes e Métodos

estágio IIIB

pacientes e amostras

para serem elegíveis para o estudo, foram obrigados pacientes ter confirmado patologicamente ou IV NSCLC, um performance status Eastern Cooperative Oncology Group de 0 a 2, predefinida

EGFR

estado de mutação de genes em tecidos tumorais com base em ARMS (escorpiões amplificação sistema de mutação refractária, Qiagen, Alemanha) antes da terapia, e disponível sérum. Somente os pacientes tratados na 307 Hospital de PLA a partir de maio de 2011 a abril de 2013, foram inscritos. Este estudo foi realizado de acordo com protocolos aprovados pelo comitê de ética local (as Comissões de Ética de 307 Hospital, PLA), e todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito para participar neste estudo e deu permissão para o uso de suas amostras de sangue. Para a avaliação da resposta tumoral, avaliamos respostas objetivas após 8 semanas de tratamento com base na tomografia computadorizada (TC). A resposta do tumor foi determinado de acordo com RECIST 1.0. A sobrevida global (OS) foi definido como o tempo entre a data de diagnóstico de câncer de pulmão para a data da morte. sobrevivência livre de progressão (SLP) foi definido como o tempo desde o início do tratamento de EGFR-TKI à data da progressão da doença ou morte devido a qualquer causa. A data de corte para acompanhamento foi de 10 de novembro de 2014. Tabagismo foi baseado em registros de primeiras consultas clínicas dos pacientes, e as pessoas que fumaram mais de 100 cigarros em sua vida foram considerados fumantes. Os dados laboratoriais foram obtidos e gravados de forma independente por investigadores que estavam cegos aos dados clínicos até que as análises foram concluídas por um biostatistician.

Cinquenta pacientes foram selecionados aleatoriamente de pacientes com

EGFR

gene TKI-sensitive mutações e do tipo selvagem

EGFR

genes respectivamente (um total de 100 pacientes) para formar o grupo de treinamento para a detecção de diferenças de soro péptidos /proteínas entre pacientes com NSCLC com

EGFR

TKI- gene mutações sensíveis e pacientes com NSCLC com o tipo selvagem

EGFR

genes, ea geração do modelo de classificação, e os pacientes restantes formaram o grupo de validação para testar o modelo.

os pacientes jejuaram durante a noite. Todas as amostras de sangue foram coletadas antes dos pacientes receberam tratamento de primeira linha. As amostras de sangue foram colhidas em tubos de colheita de sangue contendo coagulante vácuo e o gel de separação e centrifugada a 3000 rpm durante 10 min a 4 ° C para separar o soro. O sobrenadante foi dividido em alíquotas de 100 ul-e armazenado a -80 ° C até processamento.

isolamento peptidoma

As amostras de soro foram descongeladas em gelo e fraccionados com pérolas magnéticas de permuta catiónica fraca (MB- WCX, Centro Nacional de Biomedical Analysis, China). As amostras foram processadas a seguir três passos: ligação, lavagem e eluição. Para cada análise, 5 ul de pérolas lavadas três vezes em 50 ul de solução de ligação (National Center of Biomedical Analysis, China), 20 ul de solução de ligação e 5 ul de amostra foram adicionados a um tubo Eppendorf e incubadas durante 10 min a sala temperatura. O tubo foi colocado em um dispositivo de separação de esférulas magnéticas para isolar o peptidoma. O sobrenadante foi removido, e as esferas foram lavadas três vezes com 100 ul de solução de lavagem (National Center of Biomedical Analysis, China) para descartar as proteínas não ligadas. Finalmente, as esferas foram lavadas com 20 ml de solução de eluição (National Center of Biomedical Analysis, China) adquirir proteínas ligadas para análise MALDI-TOF-MS.

análise de MALDI-TOF-MS

Para a análise de MALDI-TOF-MS, 1 ul de péptido eluído misto 1: 1 (v /v) com uma solução de matriz que consiste de-ciano-4-α hidroxi-ácido cinâmico saturado (α-HCCA, Bruker Daltonics, Alemanha ) em 50% de acetonitrilo (ACN, Sigma-Aldrich, EUA) e 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA, Sigma-Aldrich, EUA) foi manchada sobre os pontos de ancoragem de amostra de uma placa de alvo AnchorChip 600/384 (Bruker Daltonics, Alemanha) e deixou-se secar ao ar à temperatura ambiente para permitir que a matriz de cristalizar. ClinProt Péptido de calibração padrão I (Bruker Daltonics, Alemanha), uma mistura de calibradores de proteína /péptido disponível comercialmente que consistia de angiotensina II (m /z 1,047.19), angiotensina I (m /z 1,297.49), substância P (m /z 1,348.64) , bombesina (m /z 1,620.86), grampo de ACTH 1-17 (m /z 2,094.43), ACTH clip de 18-39 (m /z 2,466.48) e somatostatina (m /z 3,149.57) foi misturado 1: 1 (v /v ) com solução de matriz, e 0,5 ml foi depositada sobre os pontos de ancoragem de calibração da placa do alvo AnchorChip para calibração do instrumento.

a espectrometria de massa as análises foram realizadas num Ultraflex III MALDI-TOF-MS (Bruker Daltonics, Alemanha). As condições de funcionamento foram as seguintes: modo de ião positivo linear; taxa de repetição, 200 Hz; tensões da fonte de iões, 25 e 23.50 kV; tensão lente, 6,5 kV; pulsado de tempo de extracção de iões, 100 ns. Para a supressão da matriz, foi utilizado um alto fator de gating com supressão de sinal de até 300 m /z. Para cada espectro, 3000 tiros foram adquiridos manualmente a partir de seis posições aleatórias sobre a superfície do local (isto é, 500 disparos por posição). A aquisição de dados foi levada a cabo a 43% do máximo de energia do laser. Cada espectro foi calibrado externamente. Picos na faixa m /z de 800-10,000 Da foram registrados com o v3.4 software de aquisição FlexControl (Bruker Daltonics, Alemanha).

Bioinformatics

processamento espectral.

v2.1 software ClinProTools (Bruker Daltonics, Alemanha) foi utilizado para processar automaticamente os dados de espectros MALDI-TOFMS usando as configurações de preparação de dados de acordo com o seguinte fluxo de trabalho padrão: Cada espectro bruto foi normalizada à sua ion total atual; todos os espectros foram recalibrado usando os valores de destaque, m comum /z; baseline subtração, alisamento, e detecção de pico foram realizadas; e áreas de pico para cada espectro foram calculados. A razão sinal-ruído foi fixado em 5 de detecção de pico. As áreas de pico foram calculados usando o tipo de integração nível zero. Spectra também eram ” top hat “linha de base subtraída com a largura da base do mínimo definido para 10%, alisou e processadas no intervalo Da 800-10,000.

Formação e criação modelo de classificação no grupo de treinamento.

Apenas espectros de foram utilizados o grupo de treinamento. Diferenças em picos peptídicas entre pacientes com

EGFR

gene mutações sensíveis ao TKI e pacientes com o tipo selvagem

EGFR

genes foram selecionados usando áreas de pico com base em diferenças estatísticas. Built-in modelos matemáticos em ClinProTools 2.1 (ou seja, algoritmo genético (GA), supervisionado rede neural (SNN) algoritmo e classificador rápido (QC) algoritmo) foram então usados ​​para selecionar picos de peptídeos e configurar modelos de classificação para determinar os planos de separação óptima entre amostras de pacientes com

EGFR

gene mutações sensíveis ao TKI e do tipo selvagem

EGFR

genes. Depois de cada modelo foi gerado, um processo de validação cruzada aleatória foi realizado com o software, eo percentual de deixar de fora e número de iterações foram fixadas em 20 e 10, respectivamente.

Para determinar a precisão do modelo de previsão de classe, o software quantifica validação cruzada e capacidade de reconhecimento. A validação cruzada é uma medida da fiabilidade de um modelo e pode ser utilizado para prever como um modelo irá comportar no futuro. Este método é utilizado para avaliar o desempenho de um algoritmo para um determinado conjunto de dados e sob uma determinada parametrização. capacidade de reconhecimento descreve o desempenho de um algoritmo, ou seja, a classificação adequada de um determinado conjunto de dados.

teste cego do modelo de classificação que a maioria eficientemente separadas amostras de pacientes com

EGFR

TKI- gene mutações sensíveis a partir de amostras provenientes de pacientes com o tipo selvagem

EGFR

genes no grupo de validação.

Esta validação foi realizado de forma cega em que a análise de MALDI-TOF-MS foi realizada e as amostras eram classificadas antes dos dados de resultados clínicos foram colocados à disposição dos investigadores

.

para cada paciente a partir dos grupos de validação, um espectro correspondente foi apresentado ao modelo selecionado classificação (chamado classificador), que, em seguida, voltou a etiqueta, tanto ” mutante “(ou seja, a classificação para a classe que consiste em amostras de pacientes com

EGFR

gene mutações sensíveis ao TKI) ou” selvagem “(ou seja, a classificação para a classe que consiste em amostras de pacientes com o tipo selvagem

EGFR

gene), ou a saída de uma mensagem de que o espectro era inclassificável. Os resultados do modelo de classificação selecionados foram comparados com os resultados de armas em tumores para estimar a eficiência de separação do modelo.

A análise estatística

As características clínicas e doença entre as diferentes armas, a resposta objetiva taxa de taxa (TRG) e controle da doença (DCR) entre pacientes cuja correspondência amostras foram rotulados como “mutante” e “selvagem” foram comparados usando um χ

2 ou teste exato de Fisher. A concordância entre os braços em tumores e o classificador proteômica do soro na avaliação

EGFR

estado de mutação do gene foi avaliada através de um teste Kappa. As curvas de sobrevida foram estimadas pelo método de Kaplan-Meier e as diferenças entre as curvas foram avaliadas pelo teste de log-rank. As análises estatísticas foram realizadas com o software SPSS, v19.0 (SPSS Inc., EUA). Um valor de p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

características do paciente

Um total de 223 pacientes preencheram os critérios de inclusão e foram incluídos neste estudo. Com base no critério de armas em tumores, havia 102 pacientes com

EGFR

gene mutações sensíveis ao TKI e 121 pacientes com o tipo selvagem

EGFR

genes. Cinquenta pacientes foram selecionados aleatoriamente entre aqueles com

EGFR

gene mutações sensíveis ao TKI e daqueles com o tipo selvagem

EGFR

genes (ou seja, um total de 100 pacientes) para formar o grupo de treinamento, e os restantes 123 pacientes (ou seja, 52 pacientes com

EGFR

gene mutações sensíveis ao TKI e 71 com o tipo selvagem

EGFR

genes) formaram o grupo de validação. As características clínicas de doenças e de todos os pacientes estão listados na Tabela 1. Os pacientes foram equilibradas entre o grupo de treino e validação do grupo (Tabela 2). No grupo de treinamento, não houve diferenças significativas entre pacientes com

EGFR

gene mutações sensíveis ao TKI e do tipo selvagem

EGFR

genes com relação à idade, tipo histológico, ou estágio da doença, mas foram observadas diferenças de sexo e tabagismo história entre estes dois braços, com mais mulheres e mais não-fumantes em pacientes com

mutações sensíveis ao TKI EGFR

gene (Tabela 3).

Diferenças de picos no soro entre pacientes com

EGFR

gene mutações sensíveis ao TKI e pacientes com o tipo selvagem

EGFR

genes no grupo de formação