Abstract
Combinado segmentação da MAPK e PI3K vias de sinalização no cancro pode ser necessário para a actividade terapêutica óptima. Para apoiar os estudos clínicos de terapia de combinação, 3′-desoxi-3 ‘- [
18F] -fluorothymidine ([
18F] -FLT) absorção medido por Positron Emission Tomography (PET) foi avaliada como um não-invasivo biomarcador substituto resposta em modelos pré-clínicos. O
In vivo
eficácia anti-tumoral e PK-PD propriedades do inibidor de MEK PD 0325901 e o inibidor de PI3K GDC-0941, isoladamente e em combinação, foram avaliados em HCT116 e xenoenxerto de cancro portador de tumor colo-rectal humano HT29 ratos, e [
18F] -FLT PET investigada em camundongos com xenoenxertos HCT-116. segmentação dual de PI3K e MEK induzida inibição do crescimento tumoral marcado
in vivo
e atividade antitumoral foi previsto por [
18F] digitalização -FLT PET após 2 dias de tratamento. Farmacodinâmica análises usando a combinação do inibidor de PI3K GDC-0941 e o DP inibidor MEK 0.325.901 revelou que o aumento da eficácia está associado com uma inibição melhorada da fosforilação de ERK1 /2, S6 e 4EBP1, em comparação com a observada com qualquer um dos agentes individuais, e mantida a inibição da fosforilação de AKT. Os estudos de farmacocinética indicaram que não houve interação PK marcante entre as duas drogas. Em conjunto, estes resultados indicam que a combinação de inibidores de PI3K e MEK pode resultar em eficácia significativa e demonstram pela primeira vez que [
18F] -FLT PET pode ser correlacionado com a melhoria da eficácia do tratamento com inibidor de PI3K e MEK combinado.
Citation: Haagensen EJ, Thomas HD, Wilson I, Harnor SJ, SL Payne, Rennison T, et al. (2013) O avançado
In Vivo
actividade da combinação de um MEK e um PI3K Inibidor correlaciona-se com ratos [
18F] -FLT PET in Human Colorectal Cancer xenoenxerto tumor-rolamento. PLoS ONE 8 (12): e81763. doi: 10.1371 /journal.pone.0081763
editor: Seema Singh, University of South Alabama Cancer Institute Mitchell, Estados Unidos da América
Recebido: 05 de julho de 2013; Aceito: 16 de outubro de 2013; Publicação: 10 de dezembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Haagensen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. HDT, IW, SJH, SLP, TR, KMS, RJM e DRN são financiados pelo Cancer Research Reino Unido (CRUK) Drug Discovery, Imaging and Medicinal Chemistry programas de Formação (C240 /A15751 e C29821 /A10348) EJH foi um Conselho de Investigação Médica (MRC) CASE Award Doutorando apoiada pela UCB Celltech, Slough, Reino Unido. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Todos os autores declaram não haver conflitos de interesse relevante para o conteúdo deste documento, com exceção de David R. Newell, que faz parte do conselho consultivo do WILEX AG Board. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS ONE sobre a partilha de dados e materiais Carta de Apresentação
Introdução
Numerosas pequenas moléculas inibidoras de vias de transdução de sinal específico foram desenvolvidos.; em particular, a via de PI3K, um grande percurso de sobrevivência, e a via de MAPK, uma importante via mitogénica, têm sido alvo de cancro. No entanto, a atividade clínica único agente com estes inibidores foram em geral modestas, e, portanto, combinações estão sendo avaliadas [1]. Muitas combinações de inibidores de PI3K e MAPK exibiram atividade promissora
in vitro
mas alguns dos resultados mais impressionantes foram vistos
in vivo
.
Como um único agente, o Pan inibidor de PI3K GDC-0941 tem pré-clínica modesta
in vivo
eficácia, com uma actividade dependente da dose através da gama de 25-150 mg /kg /dia no modelo de xenoenxerto de glioblastoma U87MG [2]. Subsequentemente, as doses de 75-150 mg /kg foram mostrados para resultar na inibição do crescimento do tumor numa gama de modelos de xenoenxerto de tumor humano, incluindo os tumores que são
PIK3CA
mutante,
PTEN
nula,
EGFR
tipo selvagem ou mutante, com uma redução associada em AKT e S6 fosforilação [2], [3], [4], [5], [6]. GDC-0941 exibida prometendo farmacocinética pré-clínicos com boa biodisponibilidade oral (78% em ratos), e com base nestes dados e a farmacocinética previstos em seres humanos [2], [7], é agora submetidos a Fase I e II dos ensaios clínicos como um monoterapia ou em combinação com agentes quimioterapêuticos [8], [9].
O PD inibidor alostérico MEK 0.325.901 também exibiu prometendo eficácia anti-câncer pré-clínica seletiva
in vivo
como um único agente, doses de 10-25 mg /kg, causando inibição significativa do crescimento do tumor e, em muitos casos de regressão, de uma gama de modelos murinos e de xenoenxerto de tumor humano, incluindo aqueles que foram
BRAF
ou
KRAS
tipo selvagem ou mutante [6], [10], [11], [12], [13], [14]. A inibição do crescimento alcançado com doses elevadas de PD 0325901 foi acompanhada por uma diminuição da fosforilação de ERK1 2 /, a qual foi mantida, mesmo quando foram usadas doses mais baixas de 1,5-3 mg /kg PD 0325901; No entanto, estas doses mais baixas apenas foram capazes de causar um retardamento do crescimento tumoral modesta [6], [10], [11], [12]. Oral e intravenosa doses de PD 0325901 mostraram ter biodisponibilidade comparável, eram não-tóxicos a 100 mg /kg, e resultou numa inibição dependente da dose de ERK1 /2 fosforilação em fígado de rato e os pulmões devido à inibição da MEK [15]. No entanto, os ensaios clínicos revelou que único agente PD 0325901 foi associada com ocular e toxicidade neurológica, como a oclusão da veia da retina [16], e os ensaios clínicos utilizando, portanto, único agente PD 0325901 foram encerrados [8].
Como o PD inibidor MEK 0325901 pareceu promissor como um agente único, mas mostraram toxicidade em ensaios clínicos, e inibição do crescimento do tumor foi modesto com o inibidor de PI3K GDC-0941, mesmo em doses elevadas, estes e outros inibidores de PI3K e MEK agora estão a ser investigados clinicamente em combinação estudos [8]. Para este fim, PD 0325901 está a ser estudado em combinação com o inibidor de PI3K /mTOR PF-04691502, e GDC-0941 é de um ensaio clínico em combinação com o inibidor de MEK GDC-0973 [8].
In vivo
estudos pré-clínicos demonstraram que as combinações de inibidores de PI3K e MEK consistentemente resultar em inibição do crescimento tumoral melhorado em comparação com qualquer dos agentes individuais, e em muitos casos, causar a regressão de uma variedade de xenoenxertos de tumor humano e modelos de tumor de rato com uma variedade de origens genéticas, incluindo aqueles com
KRAS
,
BRAF e /ou
PIK3CA
mutações, e /ou
PTEN
eliminações [6
], [12], [17], [18], [19]. Além disso, as respostas observadas com o tratamento de combinação eram frequentemente durável, apesar de doses relativamente baixas de ambos os inibidores a ser utilizado em muitos estudos. Combinação de inibidores de PI3K e MEK foram mostrados para diminuir a fosforilação de S6, AKT e ERK1 /2 [12], [19], e estudos de dosagem intermitentes revelaram efeitos prolongados sobre os marcadores a jusante de proliferação e apoptose, tais como uma diminuição sustentada em ciclina D1 e um aumento nos níveis de Bim, que pode ser responsável, em parte, para a melhor resposta observada com a terapia de combinação [6], [19].
biomarcadores farmacodinâmicas de MAPK e PI3K modulação via, tais como os acima mencionados, requerem biópsias invasivas utilizadas e, portanto, podem não ser clinicamente viável. Além disso, as mudanças no tamanho do tumor ou a estabilização da doença, medida por métodos de imagem volumétrica, como tomografia computadorizada e ressonância magnética, não pode revelar-se após muitas semanas de tratamento, o que pode atrasar a tomada de decisão clínica e potencialmente resultar em pacientes inadequadamente restante no ineficazes e tóxicos tratamentos para períodos prolongados de tempo. Para lidar com as limitações de imagem volumétrica convencional, tomografia por emissão de positrões (PET) está sendo usado em estudos pré-clínicos e clínicos como um biomarcador funcional substituto imaging resposta [13], [14].
O fluorine- análogo da timidina modificada, 3′-desoxi-3 ‘- [
18F] -fluorothymidine ([
18F] -FLT) é um radiofármaco PET, que é usado para detectar efeitos anti-proliferativas, como a acumulação nas células é determinada por a expressão e a actividade da enzima timidina-cinase 1 e os transportadores de nucleosídeos específicos, ambos os quais estão sob o controlo de reguladores do ciclo celular fase S [13], [14], [20], [21], [22], [ ,,,0],23]. Além disso, a absorção de [
18F] -FLT tem sido demonstrado que se correlacionam com marcadores de proliferação convencionais, tais como a de Ki67, TK1 e a absorção de BrdU [24], [25], [26], [27], [28] , [29]. Usando [
18F] -FLT PET, alterações na proliferação, em comparação com o valor basal foram demonstrados numa variedade de xenoenxertos de tumores humanos tão cedo como 18, 24 e 120 horas utilizando um único agente GDC-0941 ou PD 0325901 [13], [14], [30], [31]. Além disso, [
18F] -FLT PET já tem sido usado para prever a eficácia da quimioterapia e da radioterapia [32], [33], [34] e recentemente dois ensaios clínicos começaram com o inibidor de MEK AZD6244 como um único agente incorporando [
18F] -FLT PET [8], [35].
O objectivo dos estudos descritos neste relatório foi determinar se [
18F] -FLT PET pode ser utilizado como um biomarcador de resposta substituta para a terapia MEK e PI3K inibidor combinado, como um prelúdio para ensaios clínicos.
Métodos
Declaração de Ética
Todos os experimentos foram revistos e aprovados pela Universidade de Newcastle (UK) comissão de bem-estar animal, e foram realizados de acordo com as diretrizes para o bem-estar e uso de animais na pesquisa do câncer [36] e na legislação nacional, sob licença do projeto (PPL60 /4442), emitido pelo Home Office Governo do Reino Unido sob os animais ( procedimento científico) agir 1986.
Linhas Celulares Reagentes
células de cancro colorrectal humano HCT116 e HT29 foram obtidas da ATCC (American Type Culture Collection). Todas as linhas celulares foram cultivadas em meio RPMI-1640 (suplementado com 10% (v /soro fetal de bovino v), 1% (v /v), penicilina (50 U /ml) – estreptomicina (50 mg /ml) e 2 mM de L -glutamina) e foram confirmadas livre de contaminação por micoplasma por testes regulares com Mycoalert (Cambrex, Iowa, EUA).
inibidores
O PD inibidor MEK 0325901 foi gentilmente fornecido pela UCB Celltech, Slough, Berkshire, Reino Unido. O GDC-0941 inibidor de PI3K ou foi sintetizada em casa [37] ou comprado de Stratech Scientific Ltd, Newmarket, Suffolk, Reino Unido. Todos os lotes de GDC-0941 foram totalmente caracterizados utilizando química convencional análises, mostrou ser 99% puro, e gerou resultados biológicos consistentes com a autenticidade do composto. Ambos os fármacos foram suspensos em 0,5% de hidroxipropil-metilcelulose (w /v) e 0,2% de Tween 80 (v /v) em água destilada estéril (MCT).
Animais
Os estudos em animais foram todos realizada utilizando atímicos camundongos nus CD1 do sexo feminino (Charles River, Kent, Reino Unido), implantados com HCT116 ou HT29 xenotransplantes (1 × 10
7 células em 50 mídia ul injetado subcutaneamente no flanco direito), mantidos e tratados em isoladores sob condições específicas isentos de agentes patogénicos.
farmacocinéticas (PK) e farmacodinâmicas (PD) Estudos
Os ratinhos portadores HCT116 xenotransplantes de tumores humanos foram tratados com 1 mg /kg PD 0325901, 100 mg /kg GDC -0941 ou a combinação de 1 mg /kg PD 0325901 e 100 mg /kg GDC-0941, e foram sangrados por punção cardíaca sob anestesia terminal no tempo seleccionado aponta pós-tratamento (0.25-24 horas, 3 ratos /ponto de tempo). O sangue foi recolhido em tubos heparinizados e o plasma foi separado e armazenado a -20 ° C até serem analisadas. Os tumores foram removidos, congelados em azoto líquido e armazenado a -80 ° C antes da análise PK e PD, como descrito abaixo.
Para as análises de PK, droga foi extraída de 60 mL alíquotas de amostras por precipitação da proteína com 9 volumes de acetonitrilo (MeCN). As amostras foram centrifugadas a 3000 g durante 5 minutos a 4 ° C, e 500 uL do sobrenadante evaporado até à secura sob atmosfera de azoto a 30 ° C utilizando um Zymark Evaporador (Caliper Life Sciences Limited, Cheshire, Reino Unido). As amostras foram reconstituídas em fase móvel de 100 ul de HPLC consistindo em 40% de acetonitrilo e 60% (v /v) pH 0,1% de ácido fórmico a 4,0 (v /v), e 50 ul do sobrenadante aplicado a uma 10 centímetros Xterra Waters 186000436 C18 3,5 coluna m (Waters, Hertfordshire, UK) equipado com um filtro de linha. Os compostos foram eluídos com a fase móvel acima em 1 mL /min usando um sistema Waters Millennium cromatografia (Waters, Hertfordshire, Reino Unido). Os analitos foram detectados por absorvância de UV a 275 e 315 nm, a tempos de retenção de 6,8-7,3 e 3,9-4,3 minutos para PD 0325901 e GDC-0941, respectivamente. Para a análise de droga no tecido do tumor, os tumores foram homogeneizados em 3 volumes de PBS (w /v) e 50 mL alíquotas extraiu-se com 9 volumes de MeCN, e centrifugou-se, evaporou-se e analisado como descrito acima. Total (livre e ligado às proteínas) concentrações de droga foram determinadas usando curvas padrão (0,1-10 ug /ml, r
2 0,98 em todos os casos) gerado pela extração de compostos a partir da matriz adequada, a eficiência de extração sendo 97% para todas as matrizes. Testes t pareados foram utilizados para comparar os diferentes grupos de tratamento e as diferenças com valor de p . 0,05 foram considerados estatisticamente significativos
Para PD análises, tumores (2 a 4~2.5 mm
3 peças) foram desagregados em 1 ml PhosphoSafe ™ reagente de extracção (Merck Chemicals Ltd, Nottingham, Nottinghamshire, Reino Unido), contendo um cocktail inibidor de protease (Pierce, Thermo Scientific, Rockford, Illinois, EUA) a uma diluição recomendada pelo fabricante utilizando uma Medimachine ™ (BD Biosciences, Oxford, Reino Unido), centrifugado, e o sobrenadante foi removido e analisado por Western blotting. As proteínas foram resolvidos em Novex® 4-12% (w /w) géis de Tris-glicina (Invitrogen Ltd, Renfrew, Paisley, UK) e electrotransferidas para uma membrana de nitrocelulose Hybond C (GE Healthcare Life Sciences, Hatfield, Hertfordshire, Reino Unido). As membranas foram incubadas com fosfo-4EBP1 (Thr37 /46) (# 2855), fosfo-p44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) (# 4370), fosfo-Akt (Ser473) (# 4060) ou da proteína ribossómica de fosfo-S6 ( Ser235 /236) (# 4858) anticorpos monoclonais obtidos a partir de Cell Signaling Tecnologia (New England BioLabs (Reino Unido) Ltd, Hitchin, Hertfordshire, Reino Unido). A ligação do anticorpo foi detectada por incubação com um anticorpo policlonal de cabra anti-coelho conjugado com HRP (Dako, Glastrop, Dinamarca). As manchas foram desenvolvidos usando Pierce ECL (quimiluminescência aumentada) substrato western blot (Thermo Scientific, Rockford, Illinois, EUA), ou SuperSignal® Oeste Dura substrato duração estendida (Thermo Scientific, Rockford, Illinois, EUA), e filme Kodak de raios-X ( Investigação genética Instrumentação Ltd, Braintree, Essex, UK) em um colaborador da película MediPhot 937 (Colenta, Weiner Neustadt, Áustria), então digitalizados.
Determinação do Anti-tumor Atividade
Mice rolamento HCT116 ou de tumor humano HT29 xenoenxertos foram distribuídos aleatoriamente em grupos de tratamento para evitar qualquer distorção e assegurar a consistência entre os grupos, e depois tratou-se por meio de sonda oral com quer o veículo MCT (10 ml /kg), 1 mg /kg PD 0325901, 100 mg /kg GDC-0941 ou a combinação de 1 mg /kg PD 0325901 e 100 mg /kg GDC-0941 uma vez por dia durante 14 dias. o volume do tumor foi monitorizado pela medição pinça usando a equação
a
2 ×
b
/2, onde
a
é a menor medição e
b
o maior. Os dados são apresentados como os volumes medianos do tumor relativo (RTV), em que o volume de tumor em cada ratinho no dia inicial de tratamento (dia 0) é atribuído um valor de RTV 1. O tempo para RTV3 e RTV4 para cada tumor individual foi calculada baseada em um ponto padrão de ponto da curva com 1000 segmentos utilizando o software GraphPad Prism (CA, EUA). testes de Mann Whitney U foram utilizados para comparar os diferentes grupos, ou seja, o controle
contra
cada grupo de tratamento, os agentes únicos
contra
o outro, e cada agente
contra
sua combinação. Diferenças com valor de p 0,05. Foram considerados estatisticamente significantes
[
18F] -FLT PET Estudos
Antes do tratamento e após 2 dias de tratamento, como descrito acima, os ratos rolamento humano HCT116 foram anestesiados xenoenxertos de tumor (7-9 ratinhos /grupo), canulados
via
sua veia da cauda e colocado em decúbito ventral sobre uma cama aquecida feito por encomenda, que realizou três ratos de uma vez, dentro de um scanner PET MOSAICO (Philips, Eindhoven, NL). [
18F] -FLT foi obtido a partir de PETNET (PETNET, Nottingham, Reino Unido), e os níveis de radioactividade foram medidos utilizando um contador bem Capintec (Capintec, NJ, EUA). Cerca de 10 MBq de [
18F] -FLT foi administrado por via intravenosa e uma varredura PET dinâmica uma hora foi realizada, composto por dez 1 minuto, seis de 5 minutos e dois intervalos de tempo de 10 minutos. Os ratinhos foram recuperados após a digitalização e continuaram a receber tratamento para o resto do estudo. Os dados foram analisados utilizando o software Imalytics (Philips, Aachen, Alemanha); 3D uma região de interesse foi desenhada em torno do tumor e o valor de absorção padronizado (SUV) foi calculada dividindo a concentração do tecido (MBq /mL) por dose injectada (MBq) /g de peso corporal. Os valores médios de SUV foram então representados graficamente contra o tempo, e a área sob a curva (AUC) e a alteração da percentagem na área sob a curva relativa ao exame inicial foi calculada. Testes t pareados foram utilizados para comparar o dia 2
contra
os valores da AUC basal SUV para cada rato individual dentro de cada grupo de tratamento e as diferenças com valor de p 0,05 foram considerados estatisticamente significativos
Resultados.
farmacocinética e farmacodinâmica dos inibidores de PI3K e MEK, como agentes únicos ou em combinação, em HCT116 xenotransplantes de tumores humanos
Um estudo dose única PK /PD foi realizada utilizando o inibidor PI3K GDC-0941 e o inibidor da MEK PD 0325901, como agentes simples e em combinação, em ratinhos portadores de xenoenxertos de tumor humano HCT-116, ao longo de um curso de tempo de 0.25-24 horas. As concentrações das drogas no plasma e no tecido do tumor foram medidos usando HPLC (Figura 1 e Tabela 1). As concentrações de GDC-0941 e PD 0325901 no plasma diminuiu mais de 24 horas após uma única dose de inibidor (Figura 1). Um aumento de 10 vezes na dose de GDC-0941, isto é, 100
relação
10 mg /kg, os valores de AUC do plasma que foram obtidos sete vezes maior. No caso de PD 0325901, um aumento da dose comparáveis, ou seja, 10
relação
1 mg /kg, resultou em um aumento de 15 vezes na AUC do plasma (Tabela 1). As concentrações de GDC-0941 e PD 0325901 no tumor foram mais variáveis e níveis de PD 0325901 foram indetectáveis no plasma às 24 horas (limite de detecção: 100 nM) após o tratamento com 1 mg /kg e no tecido do tumor em todos os pontos de tempo (limite de detecção: 0,4 nmol /g de material de tumor ou 100 nm de homogeneizado de tumor diluída quatro vezes). Os valores de AUC do tumor GDC-0941 (Tabela 1), indicam que houve um aumento de 15 vezes na AUC após um aumento de 10 vezes na dose.
concentrações tumorais de o inibidor de PI3K GDC-0941 no plasma e (GDC ) (a) e o inibidor de MEK PD 0325901 (DP) (B), medida por HPLC em amostras a partir de murganhos portadores de xenoenxertos de tumores HCT116 nos pontos de tempo indicados após uma única po dose de 100 mg /kg GDC-0941 sozinhos, 1 mg /kg PD 0325901 isoladamente ou a combinação de 1 mg /kg PD 0325901 e 100 mg /kg GDC-0941. Os dados são apresentados como a concentração média de 3 ratos em cada grupo ± o erro padrão. A linha pontilhada horizontal indica o
in vitro
GI
50 concentração (previamente determinado em [38]).
Curiosamente, os dados AUC plasma sugere que há pode ser um modesto aumento nas concentrações de PD 0325901 no plasma após a administração concomitante com GDC-0941 (Tabela 1), e, embora esta diferença era limitado (2-3 vezes), não havia uma diferença consistente e estatisticamente significativa entre a AUC de PD 0325901 quando administrado isoladamente a 1 ou 10 mg /kg PD 0325901, ou concomitantemente com 100 mg /kg GDC-0941 (p 0,01). administração GDC-0941 também parece ter um efeito sobre a retenção tumor de PD 0325901, onde ele poderia ser medida (ou seja, após 10 mg /kg PD 0.325.901), como houve novamente uma diferença estatisticamente significativa entre a AUC do tumor após a dose com 10 mg /kg PD 0325901 sozinho ou concomitantemente com 100 mg /kg GDC-0941 (p = 0,01). No entanto, em contraste com os dados de plasma, as concentrações seguintes de tratamento de tumor combinação de ambos PD 0325901 e GDC-0941 foram inferiores às observadas após tratamento com agente único, quando se observou uma diferença significativa. Assim, a actividade anti-tumoral melhorada observada com a combinação dos inibidores da MEK e PI3K (ver abaixo) não foi devido a uma interacção farmacocinética resultando num aumento dos níveis de droga do tumor. No geral, os dados farmacocinéticos demonstram que não houve interação farmacocinética marcada (ou seja, mudança de 3 vezes na AUC). Quando GDC-0941 e PD 0.325.901 foram dadas em combinação
Depois de uma dose única de 100 mg /kg GDC-0941, sozinho ou em combinação com 1 mg /kg PD 0325901, as concentrações de GDC-0941 no plasma e no tecido do tumor consistente excedeu a do
in vitro
GI
50 valor de 1081 nM (previamente determinado em [38]) ao longo de 6 horas (Figura 1A). De igual modo, depois de uma dose única de 1 mg /kg PD 0325901, sozinho ou em combinação com 100 mg /kg GDC-0941, as concentrações de PD 0325901 no plasma consistentemente superior ao da a
In vitro
GI
50 valor de 21 nM [38] ao longo dos primeiros seis horas; No entanto, os níveis eram indetectáveis no plasma às 24 horas e no tecido do tumor em todos os pontos de tempo (Figura 1B). No entanto, como o limite de detecção para PD 0325901 no plasma ( 100 nM) e tecido tumoral ( 0,4 nmol /g) foi maior do que o
in vitro
GI
50 valores (21 nM), os dados de PK não indicam necessariamente que as concentrações de drogas farmacologicamente activas não foram alcançados
Apesar de, a seguir 1 mg /kg PD 0325901, concentrações estavam abaixo do limite de detecção no tumor (. 0,4 nmol /g), esta dose foi capaz de reduzir (1 hora) e completamente ablação (3 e 6 horas) a fosforilação de ERK1 /2, com muito pouca recuperação de 24 horas. Como esperado, não houve efeito significativo da PD 0325901 em AKT, S6 ou fosforilação 4EBP1 (Figura 2A). GDC-0941 a 100 mg /kg foi suficiente para causar uma redução na fosforilação de AKT, S6 e 4EBP1 sobre o curso de tempo estudados, embora a redução estava incompleta e a extensão da inibição foi variável dentro dos grupos (Figura 2B). Curiosamente, havia também uma redução da fosforilação de ERK1 /2, na sequência de uma dose de 100 mg /kg GDC-0941. A combinação de 1 mg /kg PD 0325901 e 100 mg /kg GDC-0941 causou inibição anteriormente completa de ERK1 2 fosforilação /, em comparação com o tratamento com o único agente inibidor da MEK, e uma maior inibição de S6 e 4EBP1 fosforilação em comparação com o tratamento com o inibidor agente PI3K única (Figura 2C). No entanto, não houve diferença significativa entre a inibição de fosforilação de AKT com a combinação em comparação com o tratamento com inibidor de PI3K único agente.
Efeitos sobre os MAPK e PI3K /AKT vias de transdução de sinal após a ratinhos portadores de xenoenxertos tumorais HCT116 foram tratadas com uma única po dose de 1 mg /kg do PD MEK inibidor 0325901 sozinho (A), 100 mg /kg do inibidor de PI3K GDC-0941 sozinho (B) ou a combinação de 1 mg /kg do PD inibidor MEK 0325901 e 100 mg /kg do inibidor de PI3K GDC-0941 (C). Após 0.25-24 horas, os tumores foram removidos e os lisados submetidos a electroforese, seguido por Western blotting usando o anticorpo específico de fosfo indicado. As manchas foram então retirados e re-sondada com o anticorpo de proteína total correspondente a confirmar carga igual de proteína. A-C representa amostras dos três ratos em cada grupo de tratamento.
A eficácia dos inibidores da PI3K e MEK, como agentes únicos ou em combinação, em HCT116 e HT29 humano xenotransplantes tumorais
com base nos resultados do estudo de PK /PD, a eficácia de 100 mg /kg do inibidor de PI3K GDC-0941 e 1 mg /kg do PD inibidor MEK 0325901 administrado por via oral, como agentes simples e em combinação, foi avaliada em HCT116 e de tumor humano HT29-xenoenxerto de murganhos portadores (Figura 3). As doses individuais dos inibidores de PI3K e MEK foram escolhidos para ser equi-activa, de forma a espelhar os
in vitro
condições em que a sinergia havia sido demonstrado anteriormente nestas linhas de células [38]. Neste estudo, os ratos foram tratados diariamente durante 14 dias e os volumes dos tumores foram medidos três vezes por semana. As Figuras 3A e 3B demonstram que o tratamento com 100 mg /kg GDC-0941 e 1 mg /kg PD 0325901, sozinho e em combinação, causou o atraso no crescimento do tumor em comparação com tumores de controlo tratados com veículo, e que o atraso de crescimento foi maior com a combinação. Além disso, o peso corporal foi monitorizado diariamente para avaliar a tolerabilidade da terapia, e os tratamentos tanto de agente simples ou combinadas foram encontrados como sendo não-tóxicos, isto é, peso corporal não caia abaixo de 90% do peso inicial (Figuras 3C e 3D).
HCT116 (a, C, e) e HT29 (B, D, F) xenoenxertos de tumores foram tratados com veículo de controlo, de 1 mg /kg do inibidor de MEK PD 0325901 e 100 mg /kg do PI3K inibidor GDC-0941 sozinhos, ou 1 mg /kg do inibidor de MEK PD 0325901 e 100 mg /kg do inibidor de PI3K GDC-0941 em combinação, po uma vez por dia durante 14 dias. [A-B] curvas de crescimento do tumor: Os dados são apresentados como o volume de tumor relativo médio (RTV), em que o crescimento é calculada para cada tumor em relação ao seu tamanho no dia 0. Os pontos representam a média dos 10 ratinhos em cada grupo. A linha a tracejado mostra o ponto em que os tumores atingiram quatro vezes o volume inicial (RTV4). [C-D] efeitos no peso corporal: Os dados são apresentados como uma percentagem do peso corporal inicial. Os pontos representam a média dos 10 ratinhos em cada grupo ± o erro padrão. [E-F] Tempo decorrido para xenoenxertos para chegar a quatro vezes o volume inicial (tempo para RTV4): Os dados são apresentados como o tempo gasto por cada tumor individual em cada grupo de quadruplicar em tamanho, e linhas para representar a média dos murganhos em cada grupo ± o erro padrão. Os valores de P são dadas onde a combinação é significativamente diferente de um ou outro agente sozinho (p≤0,05).
Foi calculado o tempo para os tumores para quadruplicar de tamanho (tempo para RTV4) (Figuras 3E e 3F e na Tabela 2), e as análises estatísticas utilizando um teste de Mann-Whitney mostrou que houve uma diferença significativa entre os tumores tratados com o veículo de controlo e o grupo de combinação (p 0,01), e entre o inibidor de agente único e os grupos de combinação (p≤ 0,01), em ambos os modelos de xenoenxerto de tumor HCT-116 e HT29. Além disso, não havia uma diferença significativa entre os tumores tratados com o veículo de controlo e os inibidores de agente único em xenoenxertos tumorais HCT116 (p 0,01), mas não nos xenoenxertos de tumor HT29 ao nível de 5% (p = 0,06)
.
[
18F] digitalização -FLT PET no dia 2 como um biomarcador de resposta substituta de PI3K e MEK eficácia inibidor como agentes isolados e em combinação na HCT116 xenotransplantes de tumores humanos
tem sido proposto que [
18F] -FLT PET pode ser utilizado como um biomarcador substituto da resposta do tumor à terapia, e exames PET dinâmicas foram, portanto, realizadas após dois dias de tratamento, momento em que não havia diferenças significativas no volume do tumor entre o controlo ou qualquer um dos grupos tratados. Infelizmente, [
18F] -FLT captação pelo tumor HT29 foi baixa e este tumor não pode ser utilizado para [
18F] -FLT estudos de PET. Em contraste, tumores HCT116 foram [
18F] -FLT ávido e As Figuras 4A-C mostram que não houve diferenças após 2 dias em [
18F] -FLT absorção do tumor após o tratamento com o veículo de controlo, 1 mg /kg PD 0325901 sozinho ou 100 mg /kg GDC-0941 sozinho, em comparação com o valor basal. No entanto, houve uma diminuição significativa na [
18F] captação tumoral -FLT HCT116 após 2 dias de PI3K /MEK inibidor tratamento combinado (Figura 4D).
[A-D] tumor HCT116 xenotransplante [
absorção 18F] -FLT durante o exame PET dinâmica 1 hora à linha de base e após o tratamento com qualquer um de controlo com veículo (a), 100 mg /kg do inibidor de PI3K GDC-0941 sozinho (B), de 1 mg /kg do inibidor de MEK PD 0325901 sozinho (C), ou a combinação de 1 mg /kg do inibidor de MEK PD 0325901 e 100 mg /kg do inibidor de PI3K GDC-0941 (D), PO uma vez por dia durante 2 dias. Os dados são apresentados como o valor médio padronizado captação (SUV), em que a concentração no tecido é calculada em relação a dose injectada e o peso corporal. Os pontos representam a média de 5-7 ratinhos de cada grupo ± desvio padrão. [E] xenoenxerto tumoral HCT116 Variação percentual [
18F] -FLT absorção de 1 hora antes e depois do tratamento com qualquer um de controlo com veículo ou a combinação de 1 mg /kg PD 0325901 e 100 mg /kg GDC-0941, p.o. uma vez por dia durante 2 dias. Os dados são apresentados como a variação percentual na área sob a curva (AUC) em relação à linha de base AUC correspondente, derivado a partir das Figuras A-D, e as barras representam a média da 5-7 ratinhos em cada grupo ± o erro padrão. * Indica que o [
18F] -FLT SUV AUC no grupo tratado com combinação foram significativamente diferentes depois de 2 dias de tratamento em relação à linha de base (p 0,01).
Com base nos dados nas Figuras 4A-D, a variação percentual da área sob a [
18F] -FLT SUV
contra
curva de tempo (AUC) em tumores HCT116 foi calculada para cada rato individual. Figura 4E mostra que não houve diferença significativa (p = 0,95) entre [
18F] captação -FLT no início e após 2 dias de tratamento no controle ou agente único PD 0325901- ou GDC-0941 tratados com camundongos. Em contraste, houve uma diminuição estatisticamente significativa de 18% no tumor [
18F] -FLT absorção após 2 dias em ratinhos tratados combinação inibidor de PI3K /MEK (p 0,005). Estes dados demonstram que as alterações em [
18F] -FLT preceder captação efeitos sobre o volume do tumor, e que [
18F] -FLT PET é um biomarcador substituto precoce válido resposta para detectar a eficácia melhorada do inibidor de PI3K e MEK combinada tratamento.
Discussão
Com algumas notáveis excepções, por exemplo, imatinib no tratamento da leucemia mielóide crónica e vemurafenib
BRAF
melanoma -mutant, atividade clínica único agente com terapias alvo é modesto, presumivelmente devido à presença de lesões genéticas motorista múltiplas e o rápido desenvolvimento de mecanismos de resistência. Combinações de terapias-alvo são, portanto, sendo amplamente investigado. No entanto, no desenvolvimento de combinações ideais, convencional metodologia de ensaio clínico tem limitações significativas como o grande número de drogas, o número de pacientes necessários eo tempo necessário para terminais de resposta e sobrevivência a serem alcançadas se opõe à avaliação atempada de todas as combinações possíveis.