Sumário
modelos de dor câncer ósseo pré-clínicos que imitam a condição humana são necessários para responder às realidades clínicas. pacientes de mama ou câncer de próstata que lidam com metástases ósseas sentir dor intratável, o que afeta sua qualidade de vida. monitoramento avançado é, portanto, necessários para esclarecer os mecanismos da dor de câncer ósseo e aperfeiçoar tratamentos. No nosso modelo de carcinoma mamário femoral implante de células de rato MRMT-1, o início da dor e o crescimento do tumor foram monitorizados durante 21 dias. O procedimento cirúrgico realizado sem artrotomia permitiu a gravação de dor incidental em ratos em movimento livre. Junto com o desenvolvimento gradual de alodinia mecânica e hiperalgesia, sinais comportamentais de dor ambulatorial foram detectados no dia 14, utilizando um aparelho de suporte de peso dinâmico. Osteopenia foi revelado a partir do dia 14 concomitantemente com a desorganização da arquitetura trabecular (μCT). metástases ósseas foram visualizados tão cedo quanto o dia 8 por MRI (T
1-Gd-DTPA) antes de detecção de dor. PET (Na
18F) co-registo revelou atividade intra-óssea, conforme determinado pela superposição anatômica mais de ressonância magnética de acordo com hiperatividade osteoclástica (coloração TRAP). Dor e destruição óssea foram agravados com o tempo. A remodelação óssea foi acompanhada por c-Fos (espinhal) e ATF3 (DRG) activação neuronal, sustentada por astrócitos (GFAP) e microglia reactividade (Iba1) na medula espinhal lombar. Nosso modelo animal demonstra a importância de gravar, simultaneamente progressão da dor e do tumor e nos permitirá caracterizar melhor as estratégias terapêuticas no futuro
Citation:. Doré-Savard L, Otis V, Belleville K, Lemire M, Archambault M , Tremblay L, et ai. (2010) Comportamental, Medical Imaging e histopatológicos de um novo modelo de rato de câncer ósseo Pain. PLoS ONE 5 (10): e13774. doi: 10.1371 /journal.pone.0013774
editor: Pedro R. Lowenstein, Cedars-Sinai Medical Center e da Universidade da Califórnia em Los Angeles, Estados Unidos da América
Recebido: 05 de fevereiro de 2010 ; Aceito: 11 de outubro de 2010; Publicação: 29 de outubro de 2010
Direitos de autor: © 2010 Doré-Savard et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho é apoiada por doações da Sociedade de pesquisa do Câncer (PS) e do CIHR /Rx D programa de pesquisa colaborativa em parceria com o Canadian Pain Society, AstraZeneca Inc., CIHR Institute of Aging, CIHR Instituto de Musculoskeletal Saúde e Artrite, Instituto CIHR de Neurociências, Saúde Mental e Dependência (PS) e O Quebec Bio-Imaging Network. L.D.-S. detém CIHR Frederick Banting e Charles Best, FRSQ, Canadian Arthritis Rede e bolsas de estudo RSBO. P. S. é um CIHR novo investigador. L.G. é um FRSQ Júnior 1- novo investigador. P. S., M. L., L.G. e R.L. são membros da FRSQ-financiado Centre de Recherche Clinique Etienne-Le Bel. P. S. e L.G. são membros da Rede de Investigação Quebec Pain, M. L. e R.L. são membros do Quebec Bio-Imaging Network. M. L. é a Research Chair Canadá em Imagem por Ressonância Magnética. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Astra-Zeneca Inc. forneceu fundos através de um programa canadense Pain Society. Os experimentos não envolveu qualquer produto Astra-Zeneca ou composto nem Astra-Zeneca desempenhar um papel na escolha dos premiados. Nenhum dos autores são funcionários ou proprietários de Astra-Zeneca. Consequentemente, este financiador comercial não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas sobre a partilha de dados e materiais, conforme detalhado em linha pelo guia para os autores.
Introdução
Entre os cancros com um prognóstico pobre , aqueles que originam da mama, pulmão e próstata comumente metastizar para o esqueleto [1], [2]. Enquanto cânceres ósseos primários são raros, mais de 70% das pessoas lidar com a mama ou câncer de próstata avançado irá desenvolver metástases ósseas [3]. O principal fator responsável pela diminuição da qualidade de vida em metástases ósseas de suporte de pacientes é a dor [4].
dor do câncer de osso origina de compressão nervosa, isquemia e liberação de substâncias pró-inflamatórias pelo tumor e as células do ambiente de osso [5]. Assim, as células cancerosas líticas afetar a homeostase óssea através da liberação de citocinas que promovem a reabsorção patológica por osteoclastos [6], [7]. Além de destruição óssea [8], osteoclastos hiperatividade cria um ambiente ácido responsável pelo alojamento da dor [9]. Compensative e formação óssea anárquica por osteoblastos comprime as terminações nervosas terminais livres espalhadas na medula óssea, matriz e periósteo [10], levando à gênese e manutenção da dor. A associação desses fenômenos produz um início mecânica e neuroquímica única que vai além da combinação de dor neuropática e inflamatória [11].
características únicas da dor do câncer de osso torná-lo terapeuticamente intratável [11]. eficiência alívio Com efeito, as abordagens típicos, incluindo fármacos anti-inflamatórios e os opiáceos têm limitado [12]. Devido à sua natureza progressiva, doses crescentes são necessárias para aliviar adequadamente a dor do câncer ósseo [13], levando a efeitos colaterais e, finalmente, para o cumprimento abortivo [4], [14]. Além disso, a morfina foi recentemente comprovada para acelerar a perda óssea induzida por câncer em cancros osteolíticas [15], [16]. Do mesmo modo, as terapias anti-reabsorção de bisfosfonato promissores [17], [18], [19], [20], [21], demonstrou retardar a progressão do cancro e indirectamente aliviar a dor, os quais foram sombreados por osteonecrose comórbida [22]. dor do câncer ósseo permanece, assim, uma preocupação, destacando a necessidade de acentuar a nossa compreensão de seus mecanismos neurobiológicos, a fim de desenvolver estratégias mais eficazes.
Os modelos animais foram elaborados para imitar a condição humana em uma tentativa de compreender a dor do câncer ósseo . modelos do rato do cancro do calcâneo e úmero [23], ou modelos de ratos de câncer tíbia com mamária MRMT-1 [24], 4T.1 [25] e Walker 256 [26], ou da próstata AT-3.1 foram desenvolvidos [27] células para caracterizar as alterações locais ou plasticidade neural das estruturas da coluna vertebral projetando para o osso. Do ponto de vista clínico, o fêmur, no entanto, representa o osso longo mais acometido [28]. Rato modelos femorais, envolvendo implantes intramedular de linhas celulares de cancro de fibroblastos para induzir dor são relatados (por exemplo fibrosarcoma [29], [30]). No entanto, estes modelos são baseados em imitando cancros ósseos primários. A maioria dos cânceres ósseos secundários originam de mama ou próstata, conhecido por suas propriedades de metástases ósseas [31]. No entanto, para os modelos que envolvem esses tipos de células, a indução é, quer intravenosa (levando a múltiplas metástases Site [32], [33]) ou segue um procedimento cirúrgico em que uma arthrotomia patelar e alteração parcial da articulação do joelho são susceptíveis a locomoção diminuída , que por sua vez influencia a avaliação do comportamento relacionado com a dor. Com efeito, a invasividade e procedimentos cirúrgicos precisam permanecer mínima, a fim de avaliar a dor irruptiva sem interferência. Esta última manifestação dolorosa é a condição mais refratário a superar para indivíduos que lidam com a dor oncológica crónica e entre os mais difíceis de avaliar em modelos animais.
Além de avaliação da dor, os meios para detectar e vigiar patologias ósseas têm evoluído para incorporar computadorizada por raios X micro-tomografia computorizada (μCT) e cintilografia óssea [34]. No entanto, a determinação preventiva de assentamento e progressão tumoral tem o potencial para melhorar a posologias analgésicas e para limitar a remodelação óssea. Avançado não-invasivo e de baixo imagiologia médica radiação, como a tomografia por emissão de positrões (PET) e ressonância magnética (MRI) ou a combinação de ambos, seria desejável para permitir exames eficientes e repetidas para ajustes de terapia analgésica precisos e rigorosos [35] .
O rato permanece as espécies mais estudadas nos paradigmas de dor [36]. Por isso, selecionou uma linha de células de carcinoma mamário de rato por suas propriedades de forma espontânea metástase e transplante. A capacidade de MRMT-1 para metastizar em órgãos remotos é intrínseco a essas células singeneicas [37]. No presente estudo, nós descrevemos uma intervenção no fémur de ratos Sprague-Dawley implantar células de tumor da mama utilizando um procedimento cirúrgico de luz em um esforço para imitar dor clínica. Utilizamos uma combinação de abordagens de imagem comportamentais e médicas inovadoras, suportadas por observações de imuno-histoquímica e patológicas, para caracterizar o modelo. O estudo visa melhorar relevância clínica no que diz respeito ao modelo e ferramentas utilizadas para rastrear novos compostos de chumbo, a fim de caracterizar a progressão do tumor ósseo, bem como para elucidar os mecanismos subjacentes à gênese e manutenção da dor do câncer ósseo.
Métodos
cultura celular
tumor metástase rato mamária (MRMT-1) células (carcinoma) foram gentilmente fornecidos pelo celular Resource Center for Biomedical Research Institute do Desenvolvimento, Envelhecimento e Câncer (Universidade de Tohoku 4-1, Seiryo, Aoba-ku, Sendai, Japão) e colhidas em meio RPMI 1640 (Gibco, Montreal, Quebec, Canadá) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (inactivado pelo calor) e 2% de penicilina /estreptavidina (Gibco, Montreal, QC, Canadá). As células foram separadas por uma breve exposição a 0,25% w /v de tripsina-EDTA (Gibco, Montreal, QC, Canadá) e preparados para injecções. Resumidamente, as células foram sedimentadas por centrifugação, lavadas com 1 ml de solução salina equilibrada de Hank isenta de cálcio, de magnésio ou de fenol (HBSS; Gibco, Montreal, QC, Canadá) (3 min a 200 x g.) E centrifugado adicionalmente na mesma condições. O pelete foi re-suspenso em 1 ml de HBSS, e as células foram contadas com um hemocitómetro. As células foram diluídas para obter uma concentração final para injecção de 30000 células em 20 ul e mantidas em gelo antes da cirurgia
Animais
machos adultos de ratos Sprague-Dawley (200-225 g;. Charles river Laboratories, St.-Constant, Quebec, Canadá) foram mantidas em um 12 h ciclo claro /escuro com acesso a comida e água
ad libitum
. procedimentos relacionados com animais foram aprovados pela Comissão de Ética para Experimentação Animal Care e da Université de Sherbrooke e realizada de acordo com os regulamentos do Canadian Council on Animal Care (CCAC). Os ratos foram aclimatizados durante 4 dias para a instalação para animais e durante 2 dias para manipulações e dispositivos anteriores para estudos comportamentais. Note-se que os animais testados para a dor e utilizados para análises de imuno-histoquímica foram diferentes daqueles que está sendo exibido por ressonância magnética ou MRI-PET, uma vez que a anestesia prolongada pode afetar as respostas comportamentais.
Cirurgia
anestesia Depois completo com 5 % de isoflurano (Abbott Laboratories, Montreal, Quebec, Canadá), os ratos foram colocados em decúbito dorsal e as patas direitas foram raspada e desinfectados com 70% v /v etanol. A anestesia foi mantida com 2,5% de isoflurano e os olhos de ratos foram protegidos com um gel líquido oftálmica (Tear-gel, Novartis, Mississauga, ON). A incisão cutânea mínima (8-10 mm) expostos
quadríceps femoral
. O
vasto lateral
foi objecto de uma incisão (5-8 mm de comprimento) para expor o epicôndilo femoral, enquanto o ligamento patelar permaneceu intocado e danos mínimos foi infligido aos músculos e vasos sanguíneos ao redor. Usando um 0.8 A broca estereotáxica (Foredom, Bethel, CT, EUA) conectado a uma rebarba de aço carboneto de 1,75 mm (Stoelting Co., wooddale, IL, EUA), uma cavidade pequena e superficial foi burred entre o epicôndilo medial eo tubérculo adutor (aproximadamente 1 mm de profundidade). Nesse cavidade, uma agulha de calibre 25 foi inserida em um ângulo de 45 °, permitindo-lhe alcançar o canal intramedular do fémur. A agulha foi substituído com um blunt-end agulha de calibre 25 ligada a uma seringa Hamilton de 50 ul contendo 20 ul da (grupo de cancro) A suspensão de células ou de HBSS (sham). A seringa foi deixado no local durante 1 min para permitir a dispersão de células na medula óssea. A agulha foi então removido e a cavidade foi selada com amálgama dental (Prodigy A3, Kerr, Orange, CA) e polimerizado com uma luz de cura (QHL75, Dentsply, Milford, DE). O local foi cuidadosamente lavado com água desionizada estéril. O músculo eo tecido conjuntivo foram fechadas com uma sutura descontínuo feita com suturas absorvíveis sintéticas (monocryl, Ethicon, Sommerville, NJ), ea pele foi fechada com uma sutura contínua de sutura cirúrgica não absorvível (Prolene, Ethicon, Sommerville, NJ ). A ferida foi finalmente lavado com 3% v /v de peróxido e pulverizadas com uma solução amarga (saúde Aventix Animal, Flamborough, ON).
Estudos comportamentais
alodinia mecânica
foi avaliada utilizando um estesiômetro plantar dinâmica (Ugo Basile, Stoelting, IL, EUA), uma versão automatizada do cabelo de von Frey. Os animais foram colocados em compartimentos em uma malha de arame elevada e respostas para pontuada estimulação mecânica foram avaliados usando o estesiômetro. Um filamento de metal reta (diâmetro 0,5 mm) foi orientada debaixo da almofada até tocar a superfície plantar da pata traseira e começou a exercer uma força para cima. A força necessária para eliciar uma resposta de retirada foi medida em gramas e registado automaticamente quando a pata foi retirada ou o pré-ajuste de corte foi atingido (50 g). Cinco valores foram tomadas alternadamente em ambos os ipsilaterais (lado operado) e contralateral patas traseiras em intervalos de 15 s.
respostas de retirada nociceptiva mecânicos
foram medidas com um analgesiameter (Ugo Basile, Stoelting, IL , EUA) que se aplica uma pressão aumentando linearmente (16 g /s), através de uma caneta acrílico. A caneta foi colocado sobre o dorso medial da pata traseira, entre a 1ª e 2ª articulações tarsometatársicas ea média de quatro medidas consecutivas que começam com a pata traseira esquerda ou para a direita, alternadamente, foi registrado como o limiar de retirada em gramas. O ponto de corte foi definido para 200 g. Comparação para cada dia de teste foi realizada subtraindo o peso ipsilateral (g) a partir do valor de peso contralateral (g) para determinar o limiar de retirada da pata diferença (PWT).
peso estático tendo
estava medido utilizando o medidor de Incapacitance (IITC Life Science, Woodland Hills, CA, EUA). O animal foi posicionado com os membros posteriores em repouso nas duas almofadas plataforma peso de média. A unidade registrou o peso médio colocar em cada bloco durante o período de 2 s. A medida foi repetida 3 vezes. Os resultados obtidos com o medidor incapacitance foram usadas como um controlo para um segundo teste de sustentação de peso, o teste Dynamic Bearing Peso (Bioseb, Boulogne, França). O dispositivo consistia de um gabinete de Plexiglas sem fundo (25 × 25 × 24 cm
3) e um sensor (1936 captores individuais). O sensor foi colocada no pavimento da câmara, cobrindo toda a sua superfície. O rato foi autorizado a circular livremente no interior do aparelho durante 5 minutos e as informações de suporte de peso foi transmitido ao vivo para um computador portátil através de uma interface USB. Os dados brutos foram analisados com o software 1.1.0.6 DWB (Bioseb). A pata foi detectado quando um captor gravado um peso de pelo menos 4 g, e um mínimo de 2 captores adjacentes gravado um peso de, pelo menos, 1 g. A pata tinha que ser estável por um período mínimo de 0,5 s para ser incluído. Usando um vídeo-gravação sincronizada do teste e o mapa em escala das zonas detectadas, cada pata presumida foi validado por um observador e identificado como uma esquerda ou direita e frente ou pata traseira. Outras zonas detectadas, representando a cauda ou outra parte do corpo, também foram incluídos na análise.
O efeito da morfina subcutânea
foi avaliada nos dias 11, 14, 18 e 21 em nosso modelo . A morfina-sulfato de solução-mãe (50 mg /mL) foi diluída em solução salina estéril para alcançar concentração de injecção (3 mg /ml). Os ratos foram então injectados s.c. com 3 mg /kg (1 mL /g) e devolvido à sua gaiola. Os testes comportamentais foram realizadas 30 minutos depois da injecção tal como descrito anteriormente.
A imuno-histoquímica
Os ratos foram profundamente anestesiados com 5% de isoflurano e perfundidos transcardialmente com 4% de paraformaldeído (PFA) em tampão de fosfato (0,1 M , pH 7,4). A espinal medula e gânglios da raiz dorsal (DRG) foram pós-fixados durante 30 minutos em paraformaldeído a 4% e, em seguida, transferidos para sacarose a 30% (48 h) para crioprotecção. seções da medula série congelados da coluna vertebral, de 35 mm de espessura, foram cortadas usando um micrótomo deslizante, recolhidos em PBS e processadas como secções de flutuação livre. Congelado DRG foram embebidos em OCT Tissue-Tek, cortadas num criostato com uma espessura de 12 um, recolhido e processado em lâminas.
As secções de tecido foram incubadas durante 60 min à temperatura ambiente numa solução de bloqueio de 5% soro normal de cabra em PBS com 0,5% de Triton X-100 e 2% de albumina e, em seguida, incubadas durante 30 minutos em solução de 0,1 M de glicina para reduzir autofluorescência. As secções foram então incubadas com o anti-soro primário durante a noite a 4 ° C. secções da espinal medula foram imunocoradas com anticorpos contra marcadores da microglia, ligação do cálcio ionizado molécula de adaptador 1 (Iba1, anticorpo policlonal de coelho anti-Iba1, 1:1000, Wako, Richmond, VA, EUA), os astrócitos, proteína ácida fibrilar glial (GFAP, monoclonal clone GA5 de ratinho anti-GFAP, 1:500, Sigma, Oakville, Ontário, Canadá) e a proteína c-Fos (c-Fos, policlonal de coelho anti-Fos, 01:20 000, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, EUA) e em DRG contra o factor de activação de transcrição 3 (ATF-3 (C-19), anticorpo policlonal de coelho anti-ATF-3, 1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, EUA). Após a incubação, as secções de tecido foram lavadas duas vezes durante 10 min em PBS e incubadas na solução de anticorpo secundário durante 2 h a temperatura ambiente. Os anticorpos secundários conjugados com marcadores fluorescentes Alexa Fluor® 488 e Alexa Fluor 647® foram usadas em 1:500 (Invitrogen Molecular Probes, Eugene, OR, EUA). As secções foram então montadas com Aquamount. A ausência de reactividade cruzada entre os anticorpos secundários foi verificada por omitindo o anticorpo primário durante a incubação durante a noite.
proteínas Fos e factor de ATF-3 foi também detectado por imuno-histoquímica, utilizando o método de avidina-biotina-peroxidase. As lâminas de DRG e secções da espinal medula foram tratados com peróxido de hidrogénio a 0,5% durante 30 minutos para inibir a actividade da peroxidase endógena e incubadas durante 30 min numa solução de bloqueio de soro de cabra normal a 5%, 2% de albumina e 0,5% de Triton X-100 em PBS. As secções foram então incubadas durante a noite a 4 ° C na anticorpos ATF-3 (DRG) primário c-Fos (espinal medula) e, que foram diluídos em 1% de NGS com 0,1% de Triton X-100. Após a incubação, as secções foram lavadas e bloqueadas com 3% NGS durante 15 minutos e incubou-se durante 2 h em que o anticorpo secundário, IgG de cabra biotinilado anti-coelho (de cabra anti-coelho H + L, 1:500, Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA), seguido por estreptavidina-peroxidase de rábano com o método de avidina-biotina, durante 1 h (peroxidase de rábano estreptavidina, PK-6100, Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA), à temperatura ambiente. As secções foram depois incubadas durante 3 min com 0,02% de diaminobenzidina com 0,01% de peróxido de hidrogénio, então desidratada e lamínulas com Permount® meios de montagem (SP15-500, Fisher Scientific, Nova Iorque, EUA).
Quantificação
Usando um microscópio confocal Olympus Imaging and software Olympus Fluoview FV1000, seções da medula espinhal lombar foram tiradas com parâmetros idênticos aquisição (ganho, tempo de exposição) e analisados por microscopia confocal para caracterizar imunofluorescência (IF). Epifluorescência e brilhante em campo fotos foram tiradas por um microscópio Leica DM4000 equipado com uma Leica DFC350FX e uma câmara InfinityX por imunofluorescência.
núcleos Fos-imunorreactivas foram contadas ao ter pequena, arredondada ou ovóide, coloração escura, em comparação controlar. delimitação lâminas foi realizada com um modelo de cabo de histo-arquitectura espinhal de rato [38], em conformidade com o segmento lombar L1 /L2 /L3 da secção. No presente estudo, as células de c-Fos-imunorreactivas foram contadas como lâminas combinado I-II, III-IV, V-VI, VII e VIII, respectivamente. Oito secções da espinal medula de 35 ^ m sobre a /L2 segmento L1 /L3 de cada animal (n = 3) foram escolhidas aleatoriamente por animal e por condições de determinar o número total de c-Fos.
A quantificação de ATF-3 neurónios DRG positivas em secções de 12 um de espessura foi realizada por contagem do número de neurónios com ATF-3 núcleos imunorreactivos com ampliação de 20x, utilizando um microscópio Leica DFC350FX. DRGs correspondentes aos níveis da medula espinhal lombar L1 /L2 /L3 foram selecionados como os principais locais de projecção de fibras aferentes primários inervam o fêmur [39], [40]. Contagem de ATF-3 células positivas foi realizada uma vez em três séries, todos os 36