Abstract

Matrix metaloproteinase 7 (MMP7), um metallohydrolase envolvido no desenvolvimento de vários tipos de câncer, é regulada negativamente na

Apc

modelo do rato Min /+

câncer de cólon após o tratamento sulindac. Para determinar se este efeito é relevante para a condição humana, HT-29 células cancerígenas do cólon humano foram tratadas com sulindac e seus metabólitos, e comparados com os resultados obtidos a partir de

In vivo

estudos com ratos. A expressão de

MMP7

foi monitorado. Os resultados demonstraram que sulindac sulfureto eficazmente reprimidos ambos

MMP7

expressão e atividade. Além disso, a proteómica à base de actividade demonstraram que o sulindac sulfureto diminuiu drasticamente a actividade de leucotrieno A4 hidrolase em células HT-29 tal como reflectido por uma diminuição no nível do seu produto, leucotrieno B4. Este estudo demonstra que o efeito do tratamento sulindac num modelo de ratinho de cancro do cólon pode ser relevante para a contraparte humana e destaca o efeito do tratamento sulindac na metallohydrolases

Citation:. Guillen-Ahlers H, Tan J, Castellino FJ, Ploplis VA (2011) Efeito do sulindaco sulfeto de Metallohydrolases na linha de células cancerígenas do cólon humano HT-29. PLoS ONE 6 (10): e25725. doi: 10.1371 /journal.pone.0025725

editor: Matthew Bogyo, Universidade de Stanford, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de fevereiro de 2011; Aceito: 9 de setembro de 2011; Publicação: 03 de outubro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Guillen-Ahlers et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (National Heart, Lung, and Blood Institute) PO1HL07375 concessão (a FJC). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

não-esteróides anti-inflamatórios (NSAIDs), tais como sulindac, são reagentes de quimio-preventiva em relação cancros colorrectais [1], [2], [3]. Este efeito é consistente com observações

in vitro

em células cancerígenas do cólon humano [4], bem como

in vivo

no

Apc

Min /+

rato modelo, onde é observada uma grande diminuição na carga tumoral [5]. As complicações gastrointestinais que se desenvolvem em utilizadores de NSAID são bem documentadas [6], e representam um obstáculo na utilização destas drogas, como agentes de quimio-preventiva. Os efeitos pleiotrópicos de sulindac sobre a prevenção do cancro do cólon ainda não estão claros e dificultar o desenvolvimento de tratamentos mais específicos com efeitos colaterais diminuídos. Relativamente a esta questão, foi demonstrado que o tratamento sulindac provoca mudanças em eventos remodelamento da matriz extracelular, incluindo a regulação negativa da metaloproteinase matriz 7 (

MMP7

) em adenomas intestinais de

Apc

Min /+

ratinhos [7].

MMP7 pertence a um grupo de proteases dependentes de iões metálicos. De acordo com a base de dados MEROPS (www.merops.sanger.uk), metaloproteases de matriz (MMPs), que consiste de 24 membros, incluem a subfamília M10 da família MA do clã metallohydrolases M. MMPs têm sido fortemente implicado no desenvolvimento de muitos cancros. Supressão de

MMP2

e

MMP9

em camundongos foram mostrados para reduzir a tumorigênese pancreática, reduzindo a angiogênese [8]. Pertinentes a este estudo,

MMP7

deleção em

Apc

Min /+

camundongos foi mostrado para reduzir fortemente a carga tumoral intestinal [9]. Estas observações implicam MMP7 como um alvo viável para o desenvolvimento de novos regimes de tratamento.

O estudo determinou o efeito do tratamento sobre o sulindac MMP7 na linha celular de cancro do cólon humano, HT-29, e utilizou uma abordagem global para detectar atividades alterados de outros metallohydrolases. Os resultados destas investigações são aqui descritas.

Materiais e Métodos

cultura celular

células HT-29 (American Type Culture Collection, Manassas, VA) foram mantidas em meio de McCoy meio 5A (Gibco, Grand Island, NY), com soro bovino fetal a 10% a 37 ° C numa atmosfera de 95% ar /5% de CO

2. Sulindac, sulfureto de sulindac, sulindac sulfona e foram adquiridos a partir de Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Estas drogas foram diluídas em sulf óxido de dimetilo (DMSO). DMSO foi adicionado ao meio numa concentração final de 1% e as células foram cultivadas em placas de 6 poços. Uma vez que as células eram 80% confluentes, foram tratados com várias concentrações de sulindac e os seus metabolitos. Após 24 h, as células foram tripsinizadas e contadas as células viáveis ​​utilizando o método do azul de tripano.

A expressão de genes

células HT-29, no momento da colheita, foram tripsinizadas, centrifugadas, e o sedimento de células usadas para extrair ARN seguindo o protocolo da Qiagen. A concentração e a qualidade das amostras foi avaliada utilizando o perfil espectral obtida a partir da NanoDrop-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE). Em tempo real reacção em cadeia com transcrição reversa da polimerase (RT-PCR) foi realizada como previamente descrito [7]. Primers e sondas destinadas à alimentação humana

MMP7

,

MMP25

,

Trypsin1

, e

RPL-19 Quais são apresentados na Tabela 1.

para estudos de RT-PCR, o ARN total foi extraído a partir de células HT-29, tratados com DMSO ou 100 uM de sulfureto de sulindac, durante 24 h, utilizando o protocolo da Qiagen. RT-PCR de reacção incluído 2,5 × Hotmaster mistura (5 Primer Inc., Gaithersburg, MD), Inibidor de RNase, enzima RT MultiScribe, passiva ROX corante de referência, e SYBR Green. O ARN total (25 ng) foi Revere-transcritas em 30 ul de mistura de reacção a 48 ° C durante 30 min. Foram usadas as seguintes condições para amplificação: pré-desnaturação durante 5 min a 95 ° C, 30 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 20 seg, emparelhamento a 59 ° C durante 20 seg e extensão a 72 ° C durante 25 seg. Os produtos de PCR foram separados por electroforese num gel de agarose a 3% contendo brometo de etídio. Uma escada de ADN de 50 pb (Promega, Madison, WI) foi utilizado como o marcador de peso molecular.

Western blotting

proteomas foram extraídos a partir de células HT-29 e, em seguida, tratada com sulfureto de sulindac (100 ^ M) durante 24 horas a 80% de confluência. As células foram tripsinizadas, centrifugadas, e, em seguida, lavou-se em PBS. Os sedimentos celulares foram então homogeneizados Dounce e sonicado. O proteoma foi centrifugado a 100.000 ×

g

para separar as fracções citosólicas e de membrana. A fração secretada foi obtido por centrifugação dos meios de comunicação celular em 100.000 ×

g

. O proteoma foi precipitado pela adição de sulfato de amónio. As amostras foram passadas sobre um PD-10 coluna de dessalinização (GE Healthcare, Piscataway, NJ) e as concentrações de proteína foram determinadas usando o NanoDrop-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE). As amostras foram de carga sobre um gel de poliacrilamida a 10%, a electroforese, e em seguida, transferido para uma membrana de PVDF. As membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpo policlonal MMP7 coelho-anti-humano (Abcam, Cambridge, MA), e policlonal MMP7 activa de coelho-anti-humano (Abcam) a 1 ug /ml em tampão de bloqueio (PBS, 3% de leite em pó magro , 0,1% de Tween 20). Para MMP25 e α-tubulina, MMP25 coelho anti-humano (Abcam) e de ratinho anti-humano α-tubulina (Tecnologia de Santa Cruz), respectivamente, foi usado. Conjugado com HRP de IgG de anticorpo anti-coelho conjugado com HRP ou anti-IgG de murganho (Cell Signaling Technology, Boston MA) em tampão de bloqueio foi usado como o anticorpo secundário. As manchas foram desenvolvidos utilizando os reagentes LumiGLO (Protein Research Products, Gaithersburg, MA) ou a ocidental relâmpago ECL Substrato (Perkin Elmer Inc., Waltham, MA).

proteômica baseada em actividades para a identificação de metallohydrolases ativados

proteomas foram ajustadas a uma concentração de 1 mg /ml em PBS. Um cocktail de sondas alcino visando o sítio ativo da metallohydrolases foi uma oferta generosa de Benjamin F Cravatt (Instituto de Pesquisa Scripps, La Jolla, CA). Marcação foi realizada como previamente descrito [10]. Resumidamente, as sondas foram adicionadas a uma concentração final de 1 uM e incubaram-se à luz UV, durante 1 h. Rodamina azida foi então ligado às sondas que utilizam clique química [11]. As amostras foram submetidas a electroforese num gel de poliacrilamida a 10% e digitalizados usando um scanner de mesa Hitachi FMBio IIe (MiraBio, Alameda, CA) ou o KODAK In-Vivo Multispectral Sistema FX (Carestream Health, Rochester, NY).

identificação de proteínas marcadas com base em actividade

de tamanho real de verificação gel de impressões foram usadas como um modelo para extrair as bandas desejadas e depois digitalizado para assegurar o corte correcta do gel. Cada camada de gel foi reduzido com ditiotreitol 10 mM em bicarbonato de amónio e alquiladas com iodoacetamida 55 mM. As amostras foram digeridas com 0,1 ug de tripsina (Promega, Madison, WI) em 100 ul de bicarbonato de amónio 10 mM e incubadas durante a noite a 37 ° C. peptídeos trípticos foram extraídos a partir de tampões de gel com 50% de acetonitrilo /49,9% H

ácido trifluoroacético 2O /0,1% seguido de 100% de acetonitrilo e finalmente com ácido trifluoroacético a 0,1%.

peptídeos trípticos foram cromatograf ados sobre uma 100 uM × 10 centímetros coluna C18 (tamanho de partículas: 5 um) e eluída utilizando um gradiente linear de 3-45% de acetonitrilo em H

2O ao longo de 70 min à temperatura ambiente, a uma taxa de fluxo de 500 nl /min. O eluente foi para o espectrómetro de massa de armadilha de quadrupolo ion linear (LTQ) (Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA) pulverizou-electro. SEQUEST e X! Tandem algoritmos foram usados ​​para pesquisar o banco de dados utilizando o índice de proteína internacional (IPI) de banco de dados do mouse.

Leucotrieno B4 ensaio imunoenzimático

A 80% de confluência, as células HT-29 foram incubadas ou com sulfureto de sulindac ou DMSO durante 24 horas. O proteoma segregado foi obtida e concentrou-se por centrifugação a vácuo. Proteomas foram ajustadas a 5 mg /ml e LTB4 quantificada com um kit enzimático de imunoensaio (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI).

Resultados

O metabolito reduzido de sulindac, sulindac sulfureto, aumenta selectivamente morte celular de células HT-29

células HT-29 foram tratados com sulindac, sulindac sulfureto e sulindac sulfona, em concentrações variando de 10 a 1000 um (Figura 1). A partir de 250 uM, sulindac sulfureto aumentou significativamente a morte celular, a morte celular atingindo 100% a 500? M. Em contraste, o sulindac e o sulindac sulfona não conseguiu aumentar significativamente a morte de células, mesmo quando as drogas que foram acrescentados em concentrações mM.

80% de confluência, as células foram tratadas com concentrações crescentes de sulindac (cinzento), sulfureto de sulindac ( branco), e sulindac sulfona (preto).

sulindaco sulfeto reduz

MMP7

no mRNA, proteínas e atividade níveis

foi relatado que dois dias do tratamento sulindac é suficiente para regular negativamente MMP7 em tumores de

Apc

Min /+

ratos [7]. A fim de determinar qual o metabolito reduzir efectivamente MMP7, células HT-29 foram tratadas com o sulindac e seus metabolitos a 100 | iM, uma concentração não tóxica para as células, como demonstrado na figura 1, durante 24 h. O perfil de

MMP7

expressão foi comparada com os resultados previamente obtidos em estudos com ratos (Figura 2A). Apenas o metabolito activo, sulfureto de sulindac, foi capaz de reduzir significativamente a expressão de

MMP7.

Uma curva de titulação utilizando diferentes concentrações de sulfureto de sulindac revelou que, mesmo a 50 | iM,

MMP7

mostrou um pequeno (14%), mas a regulação negativa estatisticamente significativo de expressão (p = 0,044) (Figura 2B). A 100 ^ M, foi observada uma diminuição de 65% (p = 0,000001). A diferença entre 100 uM e 200 uM foi menos dramático (11%), mas ainda era significativamente diferente entre estas duas concentrações (p = 0,017).

(A) em tempo real de RT-PCR de ARN de HT- 29 células após 24 horas de tratamento com DMSO, sulindac (S), sulindac sulfureto (SD) e sulindac sulfona (SN). Os resultados foram obtidos usando o método ΔΔCt com

hrpL-19

como o gene housekeeping. C

valores de T entre 20.10 e 20.56 em todas as amostras apresentam níveis constantes de

hrpL-19

expressão. (B) A expressão de

hMMP7

após 24 horas de tratamento sulindac. A regulação negativa da

hMMP7

foi significativa em todas as concentrações. Os resultados foram obtidos usando o método ΔΔCt com

hrpL-19

como o gene housekeeping. C

valores de T entre 23.22 e 23.56 em todas as amostras apresentam níveis constantes de

hrpL-19

expressão. (C) citosólico, e fracções de membrana, segregadas proteoma extraídos de DMSO e sulindac sulfureto-tratados células HT-29 foram sujeitos a análise de Western blot utilizando um anticorpo que não distingue entre MMP7 activa e inactiva (em cima), e um anticorpo que se reconhece apenas o local activo (parte inferior). A banda esperada para MMP7 aparece a 28 kDa, no entanto uma banda de 45 kDa é frequentemente relatados, possivelmente, um dímero. Cyto indica a fracção citosólica; Mem, fracção de membrana, secr, fracção segregada, e aMMP7, MMP7 activo.

Western blotting de MMP7, bem como o local activo de MMP7, foi realizada em citosólica, membrana, segregadas e de fracções HT-29 após 24 hr proteomas de tratamento sulfureto de sulindac em 100 uM (Figura 2C). Em ambos os casos, MMP7 foi apenas detectada nas fracções segregadas do proteoma. Sulindac sulfureto de tratamento mostraram uma redução clara do MMP7 secretado na fracção a uma concentração de 100 uM. A análise Western blot como alvo o local activo de MMP7 revelou desaparecimento completo de MMP7 activa detectável após tratamento com sulfureto de sulindac.

De modo a determinar se outras MMPs, outras classes de proteases, e o gene de manutenção, RPL-19, foram afectados por sulindac em células HT-29, RT-PCR (extractos de célula inteira) e Western blot (secretada, citosólica, e fracções) foi analisada. mRNA para MMP25, trypsin1, e RPL-19 não foram alterados após o tratamento sulindac sulfureto (Figura 3A, B). A análise por Western blot da fracção de membrana destas células confirmou os resultados de RT-PCR para MMP25 (Figura 3C).

(A) produto de PCR de RT-PCR de ARN a partir de células HT-29 após 24 horas de tratamento com DMSO ou sulfureto de sulindac. Pista 1, escada de ADN de 50 pb; pista 2,

MMP25

após o tratamento sulindac sulfureto; pista 3,

MMP25

após o tratamento DMSO; pista 4,

Trypsin1

após o tratamento sulindac sulfureto; pista 5,

Trypsin1

após o tratamento DMSO; pista 6,

MMP7

após o tratamento sulindac sulfureto; pista 7,

MMP7

após o tratamento DMSO; pista 8

RPL-19

após o tratamento sulindac sulfureto; pista 9,

RPL-19

após o tratamento DMSO. Os resultados demonstram que só

MMP7

expressão é afetada pelo tratamento de sulfureto de sulindac. (B) RT-PCR quantitativa de

MMP25

,

Trypsin1

, e

MMP7

após DMSO ou tratamento sulindac sulfureto. Os resultados foram obtidos usando o método ΔΔCt com

hrpL-19

como o gene housekeeping. Os resultados indicam diferenças quantitativas em

MMP7

expressão após o tratamento sulindac sulfureto em relação ao tratamento de DMSO. (C) Western blot da fração secretado de células HT-29, demonstrando que os níveis de proteína de MMP25 na fração de membrana são semelhantes entre sulfureto de sulindac e células tratadas DMSO.

perfis de proteína baseado em atividades visando metallohydrolases revela uma diminuição da actividade de LTA4H

proteomas extraídos de células HT-29 após 24 horas de tratamento com sulfureto de sulindac ou DMSO foram marcadas com um cocktail sonda alvo a superfamília metallohydrolase e corrido num gel 1D. Uma banda forte entre 60 e 65 kDa foi observada em células HT-29 tratadas com DMSO. células tratadas com sulfureto de sulindac mostrou um leve faixa de peso molecular semelhante. As bandas foram excisadas e analisadas por espectrometria de massa. As amostras foram testadas por quadrupolo linear MS /MS (Figura 4) e os resultados combinados com a base de dados MEROPS para metallohydrolases. Havia dois peptídeos (LTYTAEVSVPK e LVVDLTDIDPDVAYSSVPYEK) detectados no kDa banda de ~ 70 que combinava leucotrieno A4 hidrolase (LTA4H). O peso molecular previsto de 69 kDa é LTA4H. LTA4H foi previamente mostrado ser um alvo para este cocktail sonda metaloprotease (10).

proteomas rotulagem baseado em atividades Metallohydrolase de células HT-29 secretadas. padrões de MMP2 e MMP7 foram adicionados para proteomas de células (setas). A banda exibindo uma forte diminuição (*) após o tratamento com o sulindac sulfureto foi extraído e analisado por espectrometria de massa. Espectros MS /MS de ptidos LVVDLTDIDPDVAYSSVPYEK e LTYTAEVSVPK correspondeu aos aminoácidos 366-386 e 155-165, respectivamente, da proteína de LTA4H. O teor de proteína em todas as amostras foi ajustado a 1 mg /ml, e o equivalente a 15 ug do proteoma foi adicionado por pista. MW denota peso molecular; os níveis de doenças sexualmente transmissíveis, normas, Sd, sulindac sulfureto de tratados e D, DMSO-tratadas.

A fim de validar a redução da atividade de LTA4H, um imunoensaio enzimático foi utilizado para medir leucotrieno B4 (LTB4) após sulindac tratamento (Figura 5). células tratadas com sulfureto de sulindac mostraram níveis de LTB4 fortemente reduzida quando comparada com células tratadas com DMSO.

proteomas e segregada de células tratadas com sulfureto de sulindac foram analisadas para os níveis de LTB4 utilizando um imunoensaio enzimático tratados com DMSO.

Discussão

O presente estudo demonstrou que sulindac sulfureto é capaz de reduzir os níveis de RNA e proteína de MMP7, o que é consistente com o que foi observado em estudos com ratos [7]. Através de perfis de proteínas com base em actividades, demonstrou-se que o sulindac sulfureto reduz dramaticamente a actividade de LTA4H. Este resultado foi validado pela diminuição dos níveis de LTB4.

O envolvimento de metaloproteases no câncer de cólon foi previamente identificado, mas o desenvolvimento de estratégias terapêuticas visando estas enzimas sido vencida [12]. Um problema é a baixa especificidade dos inibidores de metaloproteases que fizeram aos ensaios clínicos. MMP7, no entanto, tem consistentemente sido encontrado para ser relevante no câncer de cólon e seus modelos animais [9], [13]. O presente estudo indicou que sulindac sulfureto é capaz de reduzir a expressão de

MMP7

na linha celular de cancro do cólon humano HT-29, que também foi observado,

in vivo

, no

Apc

Min /+

ratos [7]. A fim de determinar se outras MMPs ou outras classes de proteases foram também alterados, MMP25, MMP uma associada a membrana que é altamente expresso em células de cancro [14], e foram analisados ​​trypsin1 e mostrou ser afectado pelo tratamento sulindac sulfureto. Além disso, o gene housekeeping RPL-19 também não foi afetada por este NSAID. Nobiletin, um outro agente anticancro com propriedades, também foi mostrado para regular negativamente

MMP7

[15] em células HT-29. Vários mecanismos têm sido propostos pelo qual MMP7 promove o crescimento do tumor. Vários desses estudos ligam MMP7 com uma interrompido mediada por Fas resposta apoptótica [16], [17], [18], e facilitação relacionadas com a inflamação do crescimento do tumor tem sido proposta para ser causado por clivagem MMP7 do ligando Fas [19]. metalopeptidases

zinco composto por 12 membros e pertencem à família de metallohydrolases. Estas proteases têm sido implicados em vários cancros, incluindo aminopeptidase N em cancro do cólon [20], a aminopeptidase cistinilo cancro renal em [21], e de LTA4H em adenocarcinomas do pulmão e do cólon [22]. Este é o primeiro estudo que liga sulindac a regulamentar LTA4H. A regulação negativa da actividade de LTA4H, e diminuição da carga de tumor, após tratamento sulindac suporta estudos em que tem sido mostrado para ser regulada positivamente em cancro do cólon. Além disso, [6] -gingerol, um componente natural com propriedades anti-tumorigénica, tem sido encontrado para suprimir o crescimento de cancro através da inibição de LTA4H [23]. A diminuição da actividade de LTA4H foi validado pela observação de que os níveis mais baixos de LTB4 foram encontrados após tratamento sulindac. LTB4 é um eicosanóide bem conhecido com propriedades quimiotáticas e foi mostrado para estimular a proliferação,

in vitro

, de HT-29 células cancerígenas do cólon [24].

Tem havido nenhum outro relatório do envolvimento de sulindac, ou qualquer outro NSAID, em MMP7 ou expressão de LTA4H. No entanto, em estudos preliminares, temos mostrado que sulindac não é a única capaz de AINE de downregulating

MMP7

, ou seja, a aspirina (dados não mostrados), o que sugere que

MMP7

é regulada negativamente por um mecanismo de NSAID compartilhada [7], [25] e não uma propriedade única de sulindac.

em resumo, o presente estudo identificou dois candidatos, previamente relatados para ser altamente relevante no desenvolvimento do tumor, que são alterados após o tratamento sulindac . Novas modalidades de tratamento alvo seletivamente MMP7 e LTA4H, individualmente ou em combinação, oferecer novas abordagens terapêuticas que aproveitam os benefícios do tratamento sulindac, mas potencialmente sem os efeitos colaterais adversos desta droga.

Reconhecimentos

os autores agradecem Benjamin Cravatt (Instituto de Pesquisa Scripps, La Jolla CA) para sondas alcino visando o sítio ativo da metallohydrolases e Sherry Niessen e Eranthie Weerapana (Instituto de Pesquisa Scripps, La Jolla CA) para a assistência técnica com os experimentos de proteômica.