Sumário

A resposta glycolytic de células de hipóxia é mediado principalmente pela hipóxia alfa fator inducible (HIF-1α), mas, mesmo na presença de tumores de oxigênio abundantes tipicamente mostram altas taxas de glicólise. Níveis mais elevados de HIF-1α em tumores está associado com um prognóstico pior e a sobre-regulação de marcadores de transição epitelial mesenquimal (EMT) devido à sua acção de HIF-1α. Mostrámos recentemente que EMT ocorre dentro da fracção CD44

células estaminais alta cancro (CSC) e que epitelial e EMT CSCs são distinguidos por alta e baixa expressão ESA, respectivamente. Nós aqui mostram que a hipóxia induz uma mudança acentuada da fração CSC no sentido de EMT levando a morfologia celular alterada, uma proporção aumentada de CD44

alta /ESA

células de baixa, os padrões de expressão genética típica de EMT, e reforçada sphere- capacidade de formação. O tamanho das fracções EMT devolvido para controlar os níveis de normóxia indicam um processo reversível. Surpreendentemente, no entanto, mesmo sob condições de normóxia uma fracção de EMT CSCs estava presente e mantidos níveis elevados de HIF-1α, aparentemente devido à sua acção de citoquinas, tais como TNFa. Funcionalmente, este EMT fração CSC apresentaram diminuição mitocondrial potencial de massa e de membrana, consumiu muito menos oxigênio por célula, e produziram níveis significativamente reduzidos de espécies reativas de oxigênio (ROS). Estas diferenças nos padrões de metabolismo do oxigênio de sub-frações de células tumorais fornecer uma explicação para a resistência terapêutica geral da CSCs e para o ainda maior resistência da EMT CSCs. Eles também identificar potenciais mecanismos de manipulação dos CSCs

Citation:. Gammon L, Biddle A, Heywood HK, Johannessen AC, Mackenzie IC (2013) subconjuntos de células-tronco cancerosas diferem intrinsecamente nos seus padrões de metabolismo do oxigênio . PLoS ONE 8 (4): e62493. doi: 10.1371 /journal.pone.0062493

editor: Yao Liang Tang, da Universidade de Cincinnati, Estados Unidos da América

Recebido: 20 de outubro de 2012; Aceito: 22 de março de 2013; Publicação: 30 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Gammon et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações da Fundação Anemia de Fanconi Research, NC3Rs, Barts e The London Charity, e pelo Conselho de Pesquisa médica norueguês. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os tumores são altamente glicolítica, mesmo na presença de oxigénio abundante, o chamado “efeito Warburg” [1], [2]. Hipóxia fator inducible 1 alfa (HIF-1α) é o principal fator regulador respostas hipóxicos celulares [3]. Em níveis elevados de oxigénio, HIF-1α é ubiquitinada e direccionado para a degradação enquanto que a níveis mais baixos de oxigénio degradação é inibida e HIF-1α transloca-se para o núcleo onde se dimerises com hipóxia inducible factor 1 beta (HIF-1β) e liga-se a resposta de hipoxia elementos (HREs) de genes alvo que ajudam adaptação celular à hipoxia [4]. A sobre-expressão de HIF-1α ocorre em uma ampla gama de cancros primários e metastáticos [5], e é responsável por uma variedade de propriedades relacionadas com tumores, incluindo uma redução nas espécies reactivas de oxigénio [6], o aumento da rádio-resistência [7] – [ ,,,0],9], e proteção de células do induzida por drogas apoptose [10] e senescência [11].

tumor invasão e metástase tornaram-se cada vez mais associada com células-tronco cancerosas (CSCs), um sub-conjunto de células cancerosas que é capaz de auto-renovação, tem a capacidade de iniciação do tumor, e é resistente à terapia com [12], [13]. Ambos invasão local do tumor e metástases para locais distantes requerem habilidades migratórias adquirido através epitelial para mesenquimal (EMT) de CSCs [14] durante o qual as características epiteliais são perdidos e proteínas epiteliais tais como E-caderina é regulada para baixo e de proteínas mesenquimais, tais como vimentina e torcê-regulados [15]. Indução de EMT em linhas de células da mama resulta em células que adquirem o fenótipo marcador típico da CSCs de mama, maior motilidade, e a resistência aos agentes terapêuticos [16], [17].

HNSCC e vários outros carcinomas, sub- populações de CSCs têm uma expressão elevada de CD44 [18] – [21]. Mostrámos recentemente que em linhas celulares derivadas de carcinomas orais e da pele, EMT ocorre dentro do CD44

fracção elevada CSC resultando em dois fenótipos CSC, um que é epiteliais e apresenta uma elevada expressão do antigénio específico epitelial (ESA), e outra que tem características de EMT e baixa expressão da ESA [22]. CSCs pode alternar entre o epitélio e os fenótipos EMT e ambas as frações iniciar tumores após o

in vivo

transplante de murino [22]. Como vários estudos têm agora diretamente ligada hipóxia e alta HIF-1α para EMT [23] – [26], que desejava saber se existem diferenças metabólicas inatas relacionadas com a utilização de oxigênio entre o epitélio e fenótipos EMT CSC. Mostra-se que os níveis baixos de oxigénio reversível aumentar o tamanho das fracções EMT dentro de linhas de células de carcinoma epidermóide e que, em comparação com os CSCs epiteliais (Epi CSC), EMT CSCs têm níveis mais elevados da proteína de resposta do HIF-1α hipóxico, mesmo sob condições de normóxia. Existem também diferenças importantes no metabolismo desta subpopulação com os níveis mais elevados de expressão de HIF-1α em EMT CSCs correlacionando com a sobre-regulação de genes glicolíticos, uma marcada redução no consumo de oxigénio, diminuição mitocondrial potencial de massa e de membrana, e reduziu a produção de reactiva espécies de oxigênio (ROS).

Materiais e Métodos

Cultura de células e hipóxica indução

linhas de células de carcinoma epidermóide foram cultivadas como descrito anteriormente [19]. Com a excepção de H357 [27], todas as linhas de células (CA1, Luc4, CaLH2, CaLH3) e queratinócitos orais normais (NOK2 NOK3) foram obtidos no nosso laboratório. O tecido foi coletada com o consentimento informado por escrito seguindo um protocolo (Câncer Oral, 04 /Q0601 /53), aprovado pelo NE London A Comissão de Ética City. indução hipóxica envolveu a cultura de células em uma câmara InVivo1000 hipóxica (Ruskinn Ciências da Vida, País de Gales, Reino Unido) em 0,2% ou 2% O

2 com 5% de CO

2. estabilização de HIF-1α utilizado Dimethyloxalylglycine 1 mM (DMOG) (Sigma) e inibição de 3- (5′-hidroximetil-2′-furil) -1-benzylindazole (YC-1) (Sigma) a 10? M ou 50? M. Para o ensaio de formação de esferas, as placas foram revestidas com poliHEMA (Sigma) (12 mg /ml em 95% de etanol) para inibir a ligação das células plaqueadas a 1000 células /poço em meio de FAD, com a adição de 1% methlycellose (Sigma). células TNFa tratados foram cultivadas durante 6 ou 24 horas com 10 ng /ml TNF recombinante (R D Cat sistemas # 210-TA-010).

Western Blot

Western blot foi realizada como previamente descrito [28]. quantificação de proteína usada num ensaio de Bradford e anticorpos e as diluições foram como se segue; HIF-1α – Rato 1:1000 Cat # 610958 BD, HIF-2α – coelho -1:500 Cat # ab20654 Abcam, β-actina – rato do gato 1:10,000 # ab8226 Abcam, GAPDH – Cat 1:10,000 Coelho # ab9485 Abcam , PDK1- mouse 1:1000 Cat # ab110025 Abcam, SOD2- Coelho 1:5000 Cat # ab13533 Abcam, a BVS -. Coelho -1:1000 Cat # ab28434 Abcam, e TNFR1- Coelho -1:1000 Cat # ab19139

Tempo real Q-PCR

O ARN foi extraído como descrito anteriormente [22], transcrito de forma inversa em ADNc realizada utilizando Superscript III síntese da primeira cadeia Supermix (Invitrogen). ADNc foi normalizado contra o gene de referência 28S-ARN. QPCR foi executado em um sistema ABI7500 PCR em tempo real utilizando a energia SYBR mix verde (Applied Biosystems). Veja apoio arquivo de informações (Informações de Apoio S1) para condições e sequências iniciadoras completos.

citometria de fluxo

As células foram analisadas em um Beckton Dickinson (BD) LSR II e células activadas por fluorescência (FACS ) foi realizada num BD Facs Aria. As células cultivadas foram descoladas utilizando Accutase (PAA), re-suspensas em PBS a 1 × 10

6 células /ml e incubadas com os anticorpos contra CD44 (clone G44-26, BD Biosciences) e a ESA (clone HEA-125, Miltenyi Biotec) a 1:100 durante 15 minutos. As células foram lavadas uma vez antes de ressuspensão em PBS fresco com DAPI (Sigma) a 200 ng /ml para excluir as células mortas.

Medições de oxigénio e de ROS

O consumo de oxigénio de fracções linha celular foi medido em placas de 96 poços de biossensor de oxigénio (BD Biosciences, Oxford, Reino Unido Cat # 353830), utilizando o protocolo adaptado por Heywood et al [29], para medições quantitativas. ROS coloração foi realizada em fracções de células vivas classificados usando CellROX ™ (Invitrogen) a 5 mM em conjunto com Hoechst 33342 a 20 ug /ml durante 30 minutos, conforme as instruções do fabricante. A quantificação foi obtida por análise de citometria de fluxo de células triplos coradas para ESA, CD44 e CellROX ™.

lactato e glicose Ensaios

lactato foi determinado conforme relatado anteriormente, com 1 × 10

5 As células re-suspensas em 100 ul de meio (sem vermelho de fenol) e incubadas durante 8 horas. O lactato foi calculada por comparação com uma curva padrão para o lactato (Sigma L1750) variando de 0-10 mM. As concentrações de glucose foram determinados utilizando um estojo de ensaio colorimétrico de glucose (Abcam, ab65333). fracção de fermentação de lactato foi calculada por comparação de lactato expulsos com o máximo teórico calculado para a glicose utilizada.

mitocondriais Ensaios

massa mitocondrial foi avaliada utilizando MitoTracker Green ™ (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. As culturas foram cultivadas a partir de densidade clonal, separado do prato. e incubadas durante 15 minutos a 37 ° C com 50 nM MitoTracker (verde) antes de lavar e analisar. Para suspensões de células de membrana mitocondrial interna potencial (IMMP) foram carregadas com Dil

1C (40 nM) (Invitrogen) e incubou-se a 37 ° C durante 15 minutos antes da lavagem uma vez e re-suspensão em PBS fresco. Os valores médios das fracções EMT e não-EMT CSC foram expressos como frações dos valores para as populações parentais correspondentes.

celular Cycle Analysis

Para as análises do ciclo celular, as suspensões de células foram fixadas em 70 % de etanol, lavadas uma vez em PBS e incubadas em DAPI (1 ug /ml) (Sigma) durante 20 minutos em conjunto com anticorpos contra CD44 e SEC.

Análise estatística

Todas as experiências foram repetidas um mínimo de 3 vezes e as comparações entre os valores foram realizadas utilizando um teste t emparelhado de duas caudas, salvo indicação em contrário. As barras de erro são relatados como ± SEM.

Resultados

longo prazo hipóxia Promove um EMT Fenótipo e aumenta uma subpopulação Caracterizada pela diminuição da ESA

Para avaliar as respostas de hipóxia celulares ao reduzido As concentrações de oxigénio, as linhas celulares 3 HNSSC (Ca1, H357 e Luc4) foram cultivadas em qualquer normóxica (~ 20% de O

2) ou os níveis de oxigénio antes de preparar os lisados ​​de proteína para avaliar HIF-1α hipóxico (2% ou 0,2%) estabilização. Todas as linhas celulares respondeu à hipóxia com o aumento da proteína HIF-1α (Fig. 1). Para determinar os efeitos de hipóxia no tamanho de EMT subpopulações [22], as células foram cultivadas em condições de hipoxia durante até 21 dias e analisado para alterações morfológicas. culturas de longo prazo (14-21 dias) apresentaram uma diminuição acentuada do número de células que formam colónias coesivas e um aumento do número de células semelhantes a fibroblastos (Fig. 2A). Para determinar se esta mudança morfológica representada desenvolvimento de uma população EMT, as células foram analisadas por citometria de fluxo para o CD44

alta /ESA

fenótipo EMT baixo previamente identificados [22]. Para todas as linhas celulares, hipoxia longo prazo deu origem a um grande aumento em CD44

alta /SEC

fracções celulares baixas (Fig. 2B, Fig. 2C). Aumentos na EMT foram menos de 2% do que 0,2% de oxigénio. O inibidor prolylhydroxylase, DMOG, resultou na estabilização de HIF-1α, e também alguma estabilização de HIF-2α (Fig. 2D). Isto foi associado com um aumento das células com um EMT-like, aparência e o CD44

alta /ESA

baixo fenótipo (Fig. 2D). Para determinar a reversibilidade da EMT após a remoção de hipoxia, as células cultivadas em 0,2% de oxigénio durante 21 dias, foram devolvidos às condições de normóxia e avaliadas por citometria de fluxo em intervalos de 7 dias. Em todas as linhas, o tamanho do

alta /ESA

baixa fração EMT CD44 diminuiu ao longo do tempo e por 21 dias se voltou para os níveis de culturas de controlo (Fig. 2E).

Western blot de lisados ​​de proteína de Ca1, H357 e Luc4 linhas de células após cultura sob normoxia (N), 2% e 0,2% de oxigênio

A.; imagens de contraste de fase de Ca1, H357 e células Luc4 cultivadas sob condições de cultura norm�icas e 0,2% de hipóxia para 21 dias (inserir: maior ampliação de células EMT-like). B; citometria de análises indicando uma mudança na coloração para CD44 (eixo dos y) e a ESA (eixo X) das células resultantes de hipoxia. C; análise dos aumentos de EMT resultantes de hipoxia. D; o crescimento da linha de células Ca1 durante 21 dias com 1 DMOG mM resulta em alterações morfológicas (em cima), mudanças na CD44 e coloração ESA (meio), estabilização de HIF-1α, mas pouca mudança em HIF-2α correspondente (canto inferior esquerdo) e um aumento da fracção de EMT (canto inferior direito). E; diminuição dependente do tempo no tamanho das frações EMT induzida por hipoxia após o regresso a condições de normóxia.

hipóxia induz a uma população de células com padrões de expressão gênica relacionados com EMT e aumento da capacidade de formação

Sphere

para determinar se a alargada CD44

alta /ESA

baixa fração induzido por hipoxia tinha padrões de expressão genética típica de EMT, subpopulações de células CA1 foram separadas por FACS antes da extração de RNA. Em comparação com a ESA

alta /CD44

fração alta (Epi CSC), CD44

alta /ESA

frações baixas (EMT) mostrou, conforme relatado anteriormente [22], maior expressão da EMT- genes relacionados Torça e vimentina e a diminuição da expressão de e-caderina (Fig. 3A). Esfera de formação ensaios, que foram utilizados como ensaios de substituição para os CSCs [30], foram realizadas para determinar se o aumento em EMT induzida por hipoxia aumentou o número de células com essa característica de células-tronco. Para todas as linhas celulares, as populações não fraccionados de células mantidas em condições hipóxicas durante 21 dias formado um maior número de esferas do que as células cultivadas em condições de normóxia (Fig 3B . 3C). O inibidor da HIF-1α YC-1 reduziu os níveis basais de HIF-1α em condições de normóxia (Fig 3D.) E diminuição de formar esfera capacidade (Fig 3E).

A.; dobre mudança na expressão gênica de marcadores EMT para CD44

/ESA

células de baixa em relação ao CD44

alto /ESA

células de alta altos. B; amostras representativas de culturas formando esfera após 21 dias de crescimento em condições de normóxia e hipóxia. C; aumento na formação esfera seguinte cultura hipóxica. D; diminuição dos níveis basais de HIF-1α em culturas de normóxia de H357 após a adição de YC-1. E; diminuição da formação esfera normóxica seguinte adição de YC-1 (esquerda) e microscopia de fase (direita) de controle e YC-1 (10 mM) culturas esfera tratados.

EMT sub-frações aumentaram HIF -1α e Up-regulação dos genes Anaerobic metabólicas

em condições de normóxia, linhas celulares de cancro, como os seus tumores de origem, geralmente mostram um aumento da proporção de energia proveniente de processos glicolíticas juntamente com os níveis mais elevados de HIF-1α [ ,,,0],5]. Normoxic culturas de linhas de células de carcinoma epidermóide mostrou níveis basais mais elevados de HIF-1α de NOK (Fig. 4A). O novo aumento em células EMT induzidos pela hipóxia sugeriu que a expressão HIF-1α podem variar entre sub-frações CSC. fracções EMT e Epi CSC, por conseguinte, foram classificadas a partir das linhas de células CA1 e Luc4 para comparação com as suas populações não fraccionadas. Comparado com o Epi CSCs ou as populações progenitoras, células EMT mostraram níveis mais elevados de HIF-1α Considerando que o HIF-2α foi maior na fracção Epi CSC (Fig. 4B). À medida que os níveis mais elevados de HIF-1α em fracções EMT pode ser produzido por qualquer degradação reduzida ou um aumento da produção da proteína, avaliou-se a proteína de Von Hippel-Lindau (pvhl) que tem como alvo de HIF-1α para degradação proteossoma. No entanto, não foi encontrada diferença entre as frações para os níveis de proteína pVHL (Fig 4C). Examinando a produção de HIF-1α dentro da fração EMT nós achamos que a mensagem de HIF-1α foi elevada (Fig. 4D), sugerindo que o aumento da produção em vez de diminuir a degradação leva aos níveis elevados observados em células de EMT. Produção de HIF-1α sob condições de normóxia é aumentada em resposta ao TNF de citoquinas inflamatórias, [31] e esta citocina é também um potente indutor de EMT [32]. Para avaliar os efeitos do TNFa sobre a HIF-1α dentro das nossas linhas celulares de linhas sob condições de normóxia, as células foram cultivadas com TNFa durante 6 ou 24 horas. Em ambos os pontos de tempo, e em ambas as linhas testadas, níveis elevados de inibidores de HIF-1α foram observados (Fig. 4E). Em seguida, investigaram se as sub-frações EPI e EMT responderam diferencialmente ao TNFa e descobriu que os níveis basais mais elevados de HIF-1α presente em frações EMT foram levantadas ainda mais por TNF (Fig 4F). Nenhum efeito sobre a subpopulação Epi CSC foi observada indicando um efeito selectivamente sobre a fracção de EMT, talvez devido às maiores quantidades de receptor de TNF 1 (TNFR1) expresso por estas células

.; comparação por western blot de expressão normóxica de HIF-1α em linhas celulares NOK e CECP. B; HIF-1α e expressão de HIF-2α em ordenadas parentais EMT CSC e Epi CSC fracções das linhas celulares CA1 e Luc4 sob normoxia,. C; Western blot para níveis pVHL em fracções separadas de a linha de células de Ca1. D; avaliação de PCR de HIF-1α expressos como níveis de EMT CSC relativamente aos níveis Epi CSC para a linha celular de Ca1. E; resposta de níveis de HIF-1α de linhas CA1 e Luc4 ao tratamento com 10 ng /mL de TNFa durante 6 ou 24 horas, sob condições de normóxia. F; As transferências de Western para a HIF-1α e TNFR1 em sub fracções da linha de células após o tratamento Ca1 TNFa. L; avaliação PCR de genes alvos glicolíticas expressa em níveis EMT CSC relativas aos níveis de Epi CSC dentro da linha de células Ca1. H; imagens de fase representante microscópicas de Epi e células EMT (esquerda) e comparação de dispersão para a frente para as frações de EMT e Epi CSC (direita).

Para avaliar se os níveis de HIF-1α maiores presentes dentro das células EMT sob condições de normóxia correlacionados com aumento da expressão de HIF-1 genes a jusante, foram examinadas 3 alvos glicolíticas. Hexoquinase II (Hex2), piruvato desidrogenase cinase 1 (PDK1), e lactato-desidrogenase A (LDHA), foram todos encontrados para ser aumentada na fracção de EMT em comparação com a fracção Epi CSC (Fig. 4G). Como PDK1 é relatado para influenciar a proporção de glicose utilizados para a fermentação em lactato foi investigado se os aumentos observados em HIF-1α e seus genes alvo glicolíticas se correlacionam com alterações no metabolismo da glicose e a produção de lactato. (. Fig S1A) não foram observadas diferenças nos níveis de proteína PDK1 entre fracções e análise do consumo de glicose e produção de lactato revelou uma proporção semelhante de glicose por via anaeróbia metabolizado para cada fracção, independentemente de expressão HIF-1α (Fig S1B . C). No entanto procura total de energia pode estar relacionada ao tamanho da célula e EMT CSCs foram encontrados para ser menor do que o Epi CSCs, uma observação confirmada por análise de dispersão para a frente (Fig. 4H).

Consumo de Oxigênio é muito reduzida em células Normoxic EMT e está associada com o ciclo celular alterada, Redução de ROS, e mitocondriais Alterações

hipóxico-regulação de PDK1 por HIF1 afeta a função mitocondrial, metabolismo do oxigênio e produção de ROS [6], [33]. Para avaliar se os níveis aumentados de HIF-1α presente em fracções EMT normóxicas correlacionam-se com as funções de HIF-1α em fracções hipóxicas, classificados sub-fracções de culturas de normóxia foram ensaiadas para o consumo de oxigénio. Durante a primeira hora, e persistindo durante a duração do ensaio (Fig. 5A), o consumo de oxigénio pelas fracções EMT de ambas as linhas de células CA1 e Luc4 foi de aproximadamente 25% menos do que quer as fracções Epi CSC ou populações parentais.

A; o consumo de oxigénio em relação de fracções EMT e Epi CSC comparada com a de linha parental para a primeira hora (painéis superiores) e de Ca1 mais de 2 horas (a seguir). B; imagens de imunofluorescência, comparando os níveis de ROS na EMT e Epi CSCs contrastadas com Hoechst. C; citometria de fluxo análises dos níveis médios ROS de EMT e Epi CSCs em relação às células parentais. D; PCR dobrar diferenças para SOD2 entre EMT e Epi CSCs. E; Western blot para HIF-1α e SOD2 para os 3 sub-frações de linha de células Ca1. F; massa média mitocondrial de EMT e Epi CSCs em relação às células parentais. L; comparação de IMMP de EMT e Epi CSCs em relação às células parentais. H; perfis do ciclo celular para EMT e Epi CSC frações das linhas de células 3.

Para determinar se a redução do consumo de oxigênio correlacionada com os níveis reduzidos ROS de células de EMT, EMT ao vivo e células Epi CSC foram comparados usando o ROS marcador CellRox ™ Deep Red Reagente. Muito menos coloração para este marcador foi observada para células EMT (Fig. 5B) e quantificação de citometria de ROS em células triplos coradas para ESA, CD44 e CellRox ™ confirmou menos ROS na população EMT CSC (Fig. 5C). QPCR (Fig. 5D). Transferência de Western (Figura 5E) mostrou o ROS eliminador de superóxido dismutase 2 (SOD2) para ser altamente expresso dentro EMT CSCs.

A fosforilação oxidativa ocorre dentro da mitocôndria, previu-se que o consumo de oxigénio alteração pode ser relacionada com mitocondrial alterada estados dentro CSC sub-populações. Diferenças na massa mitocondrial total entre sub-populações de células foram, portanto, avaliada por triple-coloração para a ESA, CD44 e MitoTracker Verde ™. Para todas as linhas celulares, frações EMT mostrou massa significativamente menos mitocondrial (-10%) do que a população parental e uma redução notável de 40% em relação à população Epi CSC (Fig. 5F). Como um marcador de functon, potencial de membrana mitocondrial interna (IMMP) foi avaliada pelas células de carga equipadas com Dil

1C (5). Este mostrou uma IMMP inferior (-10%) para as frações EMT do que as populações parentais e um nível ainda mais baixo comparado com o Epi CSCs (Fig. 5G). Avaliação das diferenças do ciclo celular entre fracções de células indicou que Epi CSCs tendia a acumular-se em G2, como mostrado anteriormente [18], enquanto que a maioria das células EMT-se presentes em G1 (Fig. 5H).

Discussão

descrevemos recentemente heterogeneidade dentro da sub-população CSC [22] e que, enquanto a maioria dos CSCs têm um CD44

alta /ESA

alta celular fenótipo de superfície e expressam marcadores epiteliais, uma fração de tamanho variável de CSCs sofreu EMT. populações tanto o EPI e EMT CSC são auto-renovação

in vitro

e são tumor iniciar, se transplantadas

in vivo

(25). No entanto, EMT CSCs são resistentes a anoikis e ter maior capacidade para crescer em suspensão como esferas de tumor, uma propriedade que proporciona um ensaio substituto para esta população. Avaliada tanto morfologicamente ou como CD44

alta /SEC

células baixas, a pequena fracção de EMT tipicamente presente em linhas de células sob condições de normóxia aumenta grandemente em resposta a hipoxia ou após a estabilização da proteína HIF-1α, mudanças consistentes com relatórios anteriores [23] – [26]. Esta população alargada exibe um perfil de expressão do gene típico de EMT e melhorou a capacidade de formação de esfera. Depois da degradação acelerada de HIF-1α há uma redução na formação de esfera. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que o HIF-1α tem um papel funcional na indução e manutenção do fenótipo CSC EMT.

HIF-1α é reconhecido para dirigir células para um fenótipo metabólica com metabolismo oxidativo reduzida e aumento da produção de lactato, mediada em parte pela sobre-regulação de PDK-1 [6], [33]. Em condições de normóxia, encontramos uma taxa de aproximadamente 50% maior de síntese de HIF-1α dentro da fração EMT e que esta correlacionada com os níveis de proteína mais elevados. Níveis semelhantes de proteína pvhl sugeriram nenhuma alteração na taxa de degradação e que, por conseguinte, concluir que o nível mais elevado de HIF-1α dentro EMT é mantida por aumento da produção. EMT é relatado para ser induzida por TGF-β1, interleucinas e citoquinas inflamatórias, tais como TNF, que também tem sido relatado para aumentar a produção de HIF-1α [31]. Confirmámos as respostas similares de nossas linhas de células e também mostram que as células EMT responder selectivamente ao TNFa, aumentando o seu nível de HIF-1α. Isto implica importante efeitos da microbiota do tumor em deslocamento e a manutenção do fenótipo de EMT e, por conseguinte, a progressão e invasão de tumores.

HIF-1α produção também tem sido sugerida devido a um circuito de alimentação para a frente com PDK-1 [ ,,,0],34]. No entanto, embora, encontramos um aumento mensagem para PDK-1 dentro da sub-população EMT CSC encontramos nenhuma mudança nos níveis de proteína. Também não foi encontrada diferença entre as frações epiteliais e EMT na proporção de glicose metabolizada em lactato, que foi cerca de 60% para todas as subpopulações, percentual semelhante ao relatado por Warburg mais de 80 anos atrás [1]. No entanto, proporcional ao tamanho EMT CSCs, a quantidade de utilização de glucose seria maior e isto em conjunto com a acentuada redução no consumo de oxigénio, sugere uma reduzida dependência sobre a fosforilação oxidativa com células EMT sendo menos do que metabolicamente activa Epi CSCs. As alterações do ciclo celular encontrado também são sugestivos de um fenótipo de EMT mais quiescente como anteriormente mostrado para células EMT em linhas CECP [35].

De acordo com a hipoxia, HIF1 agindo através PDK1 [6] leva a uma redução mitocondrial consumo de oxigênio [33] e reduziu a produção de ROS. A sobre-expressão de PDK1 também se correlaciona com prognóstico pobre [36]. Os níveis de expressão mais elevados de HIF-1α e PDK1 foram encontrados dentro da população normóxica CSC EMT acompanhada por uma redução no consumo de oxigénio e níveis mais baixos de ROS, alterações semelhantes aos relatados para as células sob condições hipóxicas. Os níveis elevados de SOD2 em EMT CSCs também funcionar para inactivar tais como ROS pode ser produzido. Papandreou e colegas de trabalho [33], examinando populações tumorais não fraccionadas, detectado quaisquer alterações estruturais nas mitocôndrias. No entanto, analisando as diferenças entre as sub-frações CSC mostrou uma redução da massa mitocondrial em EMT CSCs juntamente com um IMMP relativa mais baixa que aponta para redução da função mitocondrial. Zhang et al [37] relataram ações repressivas de HIF1 na biogênese mitocondrial através da repressão da transcrição por C-Myc [38], [39] e temos relatado anteriormente down-regulação da C-Myc na EMT normóxica sub-população [ ,,,0],22]. As análises de PCR (dados não mostrados) indicam também a regulação por diminuição dos C-Myc nas fracções hipóxicas EMT alargada.

CSCs têm várias propriedades únicas que os distinguem da maior parte da população de células de diferenciação [12], [18 ], [30] e publicações recentes têm associado a aquisição de propriedades de células-tronco com EMT. Por exemplo, a indução de EMT em uma linha de células da mama não tumorigénico por tratamento com TGF-β1 conduz à aquisição do CD44

alta /CD24

fenótipo superficial baixa célula típica de CSCs de mama que têm de iniciação do tumor e do tumor -sphere habilidades que formam [16]. A terapia de radiação é amplamente utilizada para tratamento de carcinoma epidermóide e baixos níveis de oxigénio e de ROS celular, em conjunto com níveis mais elevados de antioxidantes, são mediadores críticos de morte celular reduzida por irradiação [12]. Os baixos níveis de oxigénio estão associados com a radioterapia falha [40] e é, portanto, de particular interesse clínico que a indução hipóxica da CSCs para o fenótipo de EMT iria aumentar ainda mais a resistência geral a várias modalidades terapêuticas mostrado por CSCs [17]. A presente dados estende esses resultados, em primeiro lugar, apoiando a presença, como relatado anteriormente [22], de dois fenótipos de células estaminais e, em segundo lugar, pelo que mostra várias propriedades adicionais do fenótipo de EMT CSC que são susceptíveis de ser associada com a resistência à terapêutica melhorada. As propriedades metabólicas da fracção EMT CSC, e o seu aumento de tamanho em hipóxia, são susceptíveis, por conseguinte, actuar para melhorar a resistência à radiação. Além disso, o ciclo celular mais lenta e redução mitocondrial em EMT CSCs também pode ter implicações para respostas apoptóticos para tanto a radiação e drogas anti-cancro. Parece que a eliminação terapêutica da população EMT menos metabolicamente ativa vai exigir um tratamento direcionado e que os modelos de indução de EMT, tanto por hipóxia e citocinas podem fornecer uma plataforma crucial para o desenvolvimento de tais terapias.

Informações de Apoio

Figura S1.

utilização Sub glucose fração. UMA; Western blot para níveis PDK1 de fracções sub. B; utilização de glucose (esquerda), lactato expulso (no centro) e por cento de glicose metabolizada para formar lactato (à direita) na linha celular de Ca1 e C; na linha de células Luc4

doi:. 10.1371 /journal.pone.0062493.s001

(TIF)

Informações de Apoio S1.

QPCR Condições e Primers

doi: 10.1371. /journal.pone.0062493.s002

(DOC)

Reconhecimentos

Agradecemos Dr. Gary Warnes por sua assistência técnica e Dr Daniela Elena Costea por sua entrada fundamental no desenho do estudo.