Abstract

terapia aumenta alvejado-VEGF tanto o livre de progressão (PFS) e no geral sobrevivência (OS) de pacientes com câncer de células renais metastático (CCRm). Identificação de fenótipos moleculares de RCC pode melhorar-estratificação do risco e a predição do curso clínico da doença. Nós investigamos se hipermetilação DNA específico do gene pode prever PFS e OS em pacientes submetidos a terapia baseada em anti-VEGF. tecidos tumorais primária de 18 pacientes que receberam terapia-alvo foram examinadas retrospectivamente usando análise de PCR específicos de metilação quantitativa de

CST6

,

LAd1

, hsa-

miR

-124-3, e hsa-

miR-

9-1 CpG ilhas. PFS e OS foram analisadas para de primeira linha e sequenciais terapias antiangiogênicas usando as estatísticas de log rank. Sensibilidade e especificidade foram determinados para predição do insucesso da terapêutica de primeira linha. Hipermetilação do

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e

LAd1

foi associada tanto com um PFS encurtado (log rank p = 0,009 e p = 0,004) e OS (p = 0,011 e p = 0,043). A PFS mediana observada para os grupos de alto e baixo de metilação de

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e

LAd1

foi de 2,0 vs.11.4 meses.

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metilação teve uma especificidade de 1,0 (IC 95% 0,65-1,0) e uma sensibilidade de 0,73 (IC 95% 0,43-,90) para a predição de terapia de primeira linha.

CST6

e

LAd1

metilação são candidatos biomarcadores epigenéticas que mostram associação sem precedentes com PFS e OS, bem como a especificidade para a predição da resposta à terapia. marcadores de metilação do DNA devem ser considerados para a avaliação prospectiva das maiores coortes de pacientes em estudos futuros

Citation:. Peters I, Dubrowinskaja N, Abbas M, Seidel C, Kogosov M, Scherer R, et al. (2014) de metilação do DNA Biomarkers Predict livre de progressão e sobrevida global de Câncer Metastático celular renal (CCRm) tratados com antiangiogênicas Therapies. PLoS ONE 9 (3): e91440. doi: 10.1371 /journal.pone.0091440

editor: Zhengdong Zhang, Nanjing Medical University, China

Recebido: 07 de outubro de 2013; Aceito: 11 de fevereiro de 2014; Publicação: 14 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Peters et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer de células renais (CCR) é uma das mais. dez principais causas de morte por câncer em países industriais [1]. Apesar de recentes melhorias na terapia-alvo resultaram em sobrevivência prolongada de pacientes com carcinoma de células renais metastático (CCRm), o resultado global ainda é pobre [2], [3].

Devido a diferentes compostos disponíveis e um número crescente de novos agentes que afetam estruturas molecularmente direcionados, como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) de sinalização [4] uma sequência ótima de terapias específicas podem existir para os pacientes, aumentando potencialmente a sobrevivência com o tratamento mRCC. Embora os modelos de prognóstico, como o MSKCC (Memorial Sloan Kettering Cancer Center) e Heng sistemas de pontuação, foram relatados para ser preditores independentes de desfecho clínico, [5] [6], a discriminação entre os resultados é ainda limitada. parâmetros de base biológica específicos de tumores têm sido sugeridas para melhorar estas questões [7].

A maioria dos CCRs têm células claras (ccRCC) histologia e exibem inativação funcional do Von Hippel-Lindau (

BVS

) gene devido a mutações ou silenciamento epigenético em aproximadamente 80% dos tumores [8], [9]. No entanto, a sobrevivência (PFS) livre de progressão e global (OS) de pacientes com CCRm são independentes da perda de

BVS

função [10]. Em contraste, a análise baseada em sangue de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) potencialmente afetam genes alvo sunitinib e ligantes identificados dois polimorfismos em

VEGFR3

que estão associados com o PFS, mas não OS, de pacientes submetidos à terapia-alvo [11 ]. A medição dos níveis de proteína de soro de anidrase carbônica IX (CA9) em pacientes ccRCC metastáticos revelou diminuiu significativamente OS entre os pacientes com concentrações séricas CA9 mais elevadas [12]. Uma vantagem individual de medições para tecidos ou à base de sangue para os pacientes submetidos a terapia é perceptível, mas a precisão, sensibilidade e especificidade destes métodos ainda não foram relatados ou validado [13].

Embora os grandes grupos de pacientes foram submetidos a exom-wide análises de mutações, apenas um número limitado de outros do que genes

BVS Comprar e polybromo 1 (

PBRM1

) foram identificados para ter mutações no CCR, ea maioria com baixa frequência [14]. Portanto, o número limitado de genes frequentemente mutados reduz a probabilidade de identificar preditores à base de mutação com sensibilidade e especificidade apropriada. metilação de ADN de ilhas CpG (CGI) em um grande número de genes supressores de tumor ou de regulação tem sido identificada como um substituto funcional de mutações e tem sido relatada como sendo um evento frequente em RCC [15]. Além disso, a perda funcional de

BVS

foi encontrado a associar com aparência mais larga, as alterações epigenética [16], e todas as segundas-frequentes mutações estão relacionados com a estabilização da cromatina alteradas /histona ou modificação, mecanismos ligados ao CGI metilação e expressão gênica [17]. Portanto, a detecção frequente de alterações epigenéticas em RCC diferencia RCC biologia do tumor e fornece candidatos a novos marcadores de diagnóstico, prognóstico ou previsão [18]. CGI metilação em vários genes já foram identificados como prognosticadores candidato independente a partir de parâmetros clínico [19] – [21]. No entanto, os biomarcadores epigenéticas prever a evolução clínica de pacientes MRCC submetido a terapia-alvo, têm, com o melhor de nosso conhecimento, não foram relatados.

Nossa hipótese é que a metilação CGI está relacionada com a resposta à terapêutica, bem como a sobrevivência dos pacientes submetidos a terapia antiangiogênica MRCC. Nós investigamos quatro genes candidatos, três dos quais, E cystatin /M (

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) e os genes de RNA micro

miR-9-1

e

miR-124-3,

foram identificadas recentemente com hipermetilação CGI específicos do tumor e uma possível associação com o prognóstico de pacientes com CCR [19], [21], [22]. O Ladinin 1 (

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) gene foi identificado recentemente pelo nosso grupo como um novo marcador de metilação candidato na RCC mostrando associação univariada com os parâmetros clínico adversos, tais como o grau do tumor, metástase ganglionar, estado de metástase distinta e doença avançada (dados não publicados).

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codifica uma proteína de filamentos de ancoragem, um componente da membrana basal que provavelmente contribui para a estabilidade da interacção epitelial-mesenquimal [23].

o presente estudo investigou se uma marca de metilação do DNA pode prever a resposta de terapia antiangiogênica alvo de pacientes MRCC e descreve a identificação de dois marcadores de metilação do DNA no

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e

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CGIs como candidatos preditores epigenéticas do PFS e oS de pacientes MRCC submetidas a terapia-alvo.

Materiais e Métodos

Declaração de ética

o consentimento informado foi obtido de cada paciente e da ética locais comissão (Comitê de Ética; Prof. HD Tröger, Hannover Medical School, Carl-Neuberg-Str. 1, Hannover, Alemanha; Study_No: 1213-2011) aprovado especificamente neste estudo. Os pacientes concordaram em uma forma escrita para a utilização de amostra de tecido para a pesquisa básica. Foi obtida uma declaração por escrito de nosso comitê de ética para este estudo.

características do paciente e regimes de tratamento

dados clínicopatológicos, tecidos correspondentes, e os dados de acompanhamento, incluindo a PFS e OS de pacientes com CCRm que foram tratados com terapia de primeira linha VEGF-alvo foram coletadas entre novembro de 2005 e outubro de 2011 na Clínica de Hematologia e do Departamento de Urologia e Oncologia Urologic em Hannover Medical School (Tabela 1). A pontuação MSKCC ou estado de desempenho ECOG não estavam disponíveis. Os pacientes receberam os seguintes regimes de tratamento na primeira linha de configuração: sunitinib (n = 12, 67%), sorafenib (n = 4, 22%), Axitinib (n = 1, 5,5%), e bevacizumab (n = 1, 5,5%).

PFS foi definido como o tempo desde o início do primeiro dia de terapia sistémica para a detecção de um evento progressiva de acordo com critérios RECIST 1.1 sobre uma tomografia computorizada (TC) [ ,,,0],24]. OS foi definida como o período a partir do primeiro dia de terapia sistémica até à morte do paciente ou censurados na última seguimento. O terminal “não avaliável” na Tabela 1 descreve pacientes com PFS 2 meses devido a uma cessação precoce da terapia causada pela toxicidade ou morte prematura antes do primeiro CT recomendado digitalizar após a terapia foi iniciada. A classificação TNM inicial de tumores primários foi avaliada de acordo com a União de Controle do Câncer Internacional 2002 de classificação [25]. O seguimento dos pacientes incluídos até três mudanças de sequência no regime de terapia.

Os termos’prognostic` e’predictivè foram utilizados de acordo com a definição pelo Instituto Nacional do Câncer [26].

tecido amostras, isolamento, e bissulfito Conversão de tumor DNA

o controle independente da histopatologia, o conteúdo da célula tumoral de espécimes patológicos de rotina, ea seleção de áreas de tecido para a extração de tecido foram determinados pelo patologista. Posteriormente, cilindros de 1,5 mm de comprimento e 2 mm de altura foram carimbados para fora dos fixados em formalina e embebidos em parafina blocos (FFPE) de tecido usando um Charrière selo 18 do núcleo e submetidos a isolamento de DNA. O ADN genómico foi extraído utilizando o sistema automatizado MagNA Pure LC 2.0 e Magna kit de isolamento de ADN Pure LC II – tecido (Roche Diagnostics Deutschland, Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha). A qualidade do ADN extraído foi avaliada utilizando espectrofotometria, electroforese em gel, e PCR quantitativa, que caracterizou o rendimento, pureza e grau de degradação de ADN isolado. conversão de bissulfito de ADN foi realizada utilizando o kit de ADN-ouro EZ metilação (Zymo Research Corporation, Irvine CA, EUA) e 1 ug de ADN isolado. Totalmente metilado e convertido de ADN, bem como controlos de ADN convertido pelo bissulfito não metilados, foram usadas como relatado anteriormente [21].

quantitativa metilação-específica em tempo real A análise de PCR

quantitativo em tempo real fluorimétrico 5 ‘exonuclease PCR ensaios (qMSP) foram realizados para quantificar os níveis de metilação CGI de

CST6, LAd1,

HSA

-miR-124-3,

e hsa-

miR- 9-1

. A análise de metilação de HSA

-miR-124-3

foi realizada como descrito anteriormente [21]. sistemas qMSP foram estabelecidos para

CST6, LAd1,

e hsa-

miR-9-1

usando software Designer Beacon (PREMIER Biosoft, Palo Alto CA, EUA). As posições de bases de sites CGI investigados para

CST6, LAd1,

HSA

-miR-124-3,

e hsa-

miR-9-1 Quais são apresentados na Tabela 2. as posições de base referem-se ao navegador USCS Genome [27]. Os sistemas qMSP foram caracterizados tal como descrito para a HSA

-miR-124-3

medições de metilação [21]. Duplicam-PCR em tempo real foram realizadas num ABI 7900HT (Life technologies, Foster City, EUA) em placas de 384 poços, tal como descrito anteriormente [21]. Os experimentadores foram cegos para o estado clínico e histológico das amostras. níveis de metilação relativos foram calculados como um análogo do método ΔΔCt através da normalização da diferença de metilação CGI determinada por detecção em tempo real e as medições de controlo interno independentes à diferença correspondente nas amostras de controlo de ADN totalmente metilado como descrito anteriormente [21], [28 ].

Análise estatística da sobrevivência

gráficos de Kaplan-Meier foram usados ​​para apresentar sobrevivência relativa na PFS e análises oS seguinte dicotomização de tumores em fenótipos de alta e baixa metilação. A sobrevivência mediana e correspondentes intervalos de confiança de 95% (IC) foram relatadas. Diferenças no PFS e OS foram testados usando estatísticas de log-rank e rácios médios de sobrevivência calculadas.

P

-Valores 0,05 foram considerados significativos. Para permitir uma comparação com a literatura, análises de regressão Cox univariadas foram realizadas para estimar as taxas de risco (HR). Para calcular a sensibilidade e especificidade para falha terapêutica, um valor de corte PFS de 6 meses foi utilizado para dicotomização [29] em respondedores de terapia e não-respondedores.

O mapa de calor e curva ROC foram construídas usando o heatmap2 e função ROCR no pacote R (versão 2.11.0.1) com um algoritmo de agrupamento padrão e um pacote gplot [30].

Resultados

distribuição bimodal dos níveis de metilação relativos na CGIs de genes candidatos

quantitativa metilação análises da CGIs de

CST6

,

LAd1

, hsa-

miR-124-3,

e hsa-

miR -9-1

revelou a presença de uma distribuição bimodal de metilação valores relativos (Figura 1A e D; dados não mostrados para hsa-

miR-124-3

e hsa-

miR-9 -1

). A aplicação de um único valor de corte de 0,02% (o que corresponde a -8,75 no LN-chave utilizada para a parcelas de densidade de Kernel na Figura 1A e D) para a metilação relativa, alta e baixa epigenotipos metilados foram uniformemente distinto de todos os genes analisados ​​e utilizados para dicotomização consistente em análise de sobrevivência.

a e D. ISTRIBUIÇÃO dos valores de metilação relativa de

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(a) e

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(D) em pacientes MRCC. Um valor de corte é apresentado para dicotomização. B e E. Kaplan-Meier da sobrevivência livre de progressão dos pacientes MRCC dicotomizada pela alta e baixa metilação do

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(B) e

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(E). C e F Kaplan-Meier da sobrevida global dos pacientes MRCC dicotomizada pela alta e baixa metilação do

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(C) e

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(F).

análise do PFS

Kaplan-Meier e log análise posto de PFS em tumores metilados altas e baixas demonstrou uma diferença significativa tanto para

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e

LAd1

. Alta metilação foi associada com uma sobrevida mediana de 2,0 meses, em comparação com 11,4 meses entre os pacientes com baixa metilação (p = 0,009 e p = 0,004, Tabela 3A). Em contraste, nem

miR-124-3

nem

miR-9-1

demonstrado uma relação estatística com PFS (p = 0,339 e p = 0,319).

análise de OS

Kaplan-Meier e log estatísticas rank revelaram que a alta metilação do

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e

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foi associada com OS prejudicada. A OS mediana de 22,9 e 3,4 meses (p = 0,011, Tabela 3B) foi obtida para baixa e alta

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metilação, respectivamente. A OS mediana de 16,4 e 3,4 meses (p = 0,043, Tabela 3B) foi obtida para baixa e alta

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metilação.

Análise de Sensibilidade e Especificidade

Para determinar a sensibilidade e especificidade de

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e

analisa LAd1

metilação para a previsão de falha terapêutica de primeira linha, os valores de metilação foram dicotomizadas em fenótipos de baixa e alta de metilação usando o mesmo valor de corte de 0,02%, conforme especificado acima. valores PFS foram dicotomizadas usando um corte de 6 meses, um parâmetro que foi previamente sugerido para melhor distinguir entre respondedores de terapia e não-respondedores [29]. Alta metilação do

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e

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era uma característica da terapia falhou (Figura 2A). No caso de

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todos os oito pacientes com alta metilação eram não-respondedores. A especificidade foi de (95% IC 0,65-1,0) 1.0 e sensibilidade de 0,73 (IC 95% 0,43-0,90) para a detecção de falha terapêutica utilizando

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metilação (Tabela 4), enquanto que a especificidade foi de 0,86 (95 % CI 0,49-,97) e sensibilidade de 0,82 (IC 95% 0,52-0,95) para o

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metilação (Tabela 4).

a. mapa de calor dos valores de metilação relativos normalizados (logaritmo natural) detectado no

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,

CST6

,

miR-9-1,

e

miR-124-3

CGIs para cada paciente. Baixa a valores elevados de metilação são codificados como violeta (baixo) a (alta) tons vermelhos. As linhas tracejadas e sólidas descrever os valores medianos de metilação e individuais, respectivamente. O número de doentes dada à esquerda correspondem à numeração apresentada na Tabela 1. A resposta à terapia (0) e o insucesso do tratamento (1) estão indicadas para cada paciente no lado direito. Notavelmente, todos os pacientes (n. 1-8) exibindo alta de metilação do

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e 9 de 10 pacientes (n. 1-9, 14) exibindo alta metilação (cor vermelha) do

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faziam parte da não-resposta (1) grupo. B. O receptor características operacionais (ROC) ilustrado a discriminação de medições de metilação e a área sob a curva (AUC) mostra que mesmo com a pequena amostra de pacientes, um resultado robusto para a exactidão de ambos os marcadores de metilação (AUC

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= 0,88 e AUC

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= 0,90) podem ser detectadas. A sensibilidade (true taxa positiva) é apresentada contra 1-especificidade (taxa de falsos positivos).

Discussão

Os resultados clínicos de pacientes com CCRm melhoraram desde VEGF terapias direcionadas e inibidores de mTOR foram disponibilizados [2], [3]. No entanto, a estratificação de pacientes utilizando biomarcadores pode permitir uma melhor compreensão da resistência à droga e identificar uma sequência específica para cada paciente optimizado das terapias anti-angiogénicas, melhorar a sobrevivência individual [7]. Além disso, os efeitos colaterais dos regimes anti-VEGF-base, tais como diarreia, prurido, síndroma da mão-pé, hipertensão, e astenia, que muitas vezes prejudicam gravemente a qualidade de vida durante o tratamento pode ser minimizada.

Encontrámos que hipermetilação DNA de

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e

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na RCC principal tecido do tumor é significativamente associada com o PFS dos pacientes que receberam a medicação à base de anti-VEGF como uma terapia de primeira linha e também o oS de pacientes tratados sequencialmente com anti-VEGF alvo drogas e inibidores de mTOR em terapia de segunda e terceira linha. Nossos marcadores de metilação previu falha terapêutica com elevada especificidade e boa sensibilidade.

Para o melhor de nosso conhecimento, estes resultados são sem precedentes em vários aspectos, como os estudos anteriores não foram baseadas tecido e prestados nenhuma associação significativa com a resposta terapêutica [12] ou relatados poder estatístico limitado apenas [11]. Enquanto as medições de soro de níveis CA9 não revelou diferenças significativas entre respondedores terapia e não-respondedores [12], a análise de variantes genéticas, possivelmente interagem com a via de sunitinib, identificados dois

VEGFR3

SNPs para ser associada a uma resposta terapêutica e PFS, mas não com OS [11]. Este estudo mostra que as variáveis ​​biológicas individuais podem afetar a resposta à terapia. Por outro lado, os nossos candidatos preditores-metilação com base excede a medição de variantes genéticas em diversos aspectos importantes. Em primeiro lugar, o potencial

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e

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ADN marcadores à base de metilação foram medidos em células tumorais, que exibem características directamente tumorais que podem representar os condutores de resistência e agressividade biológica. Hipermetilação do

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e

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apresentaram valor prognóstico e preditivo em nosso estudo e é um biomarcador putativo para a seleção dos pacientes. Com base nos resultados clínicos em nosso estudo, diferentes estratégias terapêuticas para tumores hypermethylated será necessária. Após a rede de alterações epigenéticas e comportamentos biológicos tem sido desembaraçados, novos alvos adicionais de intervenções terapêuticas podem ser identificados.

Se a diferença de tecido- epigenética e medições baseadas genéticas de sangue é responsável por ambos os marcadores epigenéticos estar relacionada com PFS e oS de pacientes MRCC é uma pergunta interessante. variantes genéticas só foram associados com PFS, um desfecho substituto para medições de sobrevivência em mRCC que tem possíveis limitações [31]. Para o melhor de nosso conhecimento, um marcador molecular à base de tecido não foi anteriormente associado com OS. De um ponto de vista estatístico, o nosso estudo epigenético entregues RHs mais elevados na análise de sobrevivência e forneceu uma classificação mais equilibrada em respondedores e não-respondedores do que o estudo de Garcia-Donas et al. [11] e, portanto, em conjunto contribuindo para um maior poder deste estudo. Considerando que uma coorte muito menor paciente estava disponível para as nossas medições, os nossos resultados indicam que um efeito possivelmente forte foi identificada. Além disso, tendo em conta que um número crescente de agentes pode ser utilizado para o tratamento de mRCC, futura identificação de um regime de terapia óptima pode ser facilitada por meio de marcadores epigenética que permitem uma boa separação dos pacientes em respondedores e não-respondedores.

Curiosamente, os níveis de metilação de todos os marcadores candidatos claramente deteriorado em grupos facilmente distinguíveis de alta e baixa metilação, eliminando a necessidade de definir arbitrariamente pontos de corte para dicotomização. Portanto, praticamente nenhuma sobreposição existia entre os respondedores e não-respondedores no presente estudo. Assim, a nossa

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e

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metilação análises rendeu altas especificidades de 1,0 e 0,86 para a detecção de falha terapêutica, sublinhando a possível relevância destes marcadores em mRCC.

Este estudo também pode responder se o DNA prognosticadores à base de metilação representam preditores adequados de doença. Ambos

miR-9-1

e

miR-124-3

[21], [22] falhou como preditores porque não foi encontrada associação com o PFS ou OS de pacientes submetidos à terapia. Este achado pode ser explicado pelo fato de que os pacientes MRCC geralmente enfrentam um prognóstico pobre, e muitos tumores apresentam alta metilação para a

miR

genes como esperado para prognosticadores candidatos.

A independência da clínica ou parâmetros laboratoriais não pôde ser determinado no presente estudo porque os números baixos de amostra impediu análise multivariada. Do mesmo modo, as questões relevantes se os marcadores podem ser combinados para otimizar o poder de previsão ou se os marcadores exibem informações redundantes só pode ser respondida em futuros estudos pelo uso de grupos de estudo alargada.

No entanto, os RHs observados para os parâmetros clínicos para a evolução dos doentes foram menores com precisão poder limitado /discriminatória. Nossos resultados necessitam de confirmação em um estudo de validação independente, incluindo a consideração de sistemas de pontuação clínicos como fatores de confusão.

Em conclusão, nosso estudo identificou

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e

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CGI metilação como dois marcadores epigenéticos que estão associados com o PFS e oS de pacientes MRCC submetidos a terapia antiangiogênica. Nós também demonstraram que o potencial para melhorar a predição molecular da resposta à terapia. Nossos resultados reforçam ainda mais a noção de que existe CCRs epigenetically alterados, e novas estratégias específicas podem ser necessários para tratar pacientes com tais tumores.

Reconhecimentos

Agradecemos Margrit Hepke e Christel Reese para assistência técnica.