Abstract

ensaios de biomarcadores Novos e ferramentas analíticas atualizados são urgentemente necessários para discriminar com precisão hipertrofia prostática benigna (BPH) de câncer de próstata (PAC). Para atender a essa necessidade clínica não satisfeita, relatamos um ensaio baseado em talão piezeoelectric /magnética para quantificar antígeno prostático específico (PSA, livre e total), fosfatase ácida prostática, anidrase carbônica 1 (CA1), osteonectina, receptor solúvel de IL-6 (IL -6sr), e 2-espondina. Utilizou-se o sensor para medir estes sete proteínas em amostras de soro de 120 pacientes hipertrofia benigna da próstata e 100 Gleason score 6 e 7 CAP usando amostras de soro coletadas anteriormente e inclinadas. Os resultados foram analisados ​​com o operador receptor análise da curva característica. Houve diferenças significativas entre BPH e os pacientes PAC no PSA, CA1, e ensaios espondina-2. A maior discriminação AUC foi conseguida com uma espondina-2 ou livre /PSA total operação de área sob a curva foi de 0,84 com um valor de p inferior a 10

-6. Alguns destes dados parecem contradizer relatos anteriores e destacar a importância da seleção da amostra e construção de ensaio adequado no desenvolvimento de sistemas de medição de biomarcadores. Este sistema baseado em grânulo oferece vantagens importantes na construção de ensaio, incluindo baixo custo, alta taxa de transferência e identificação rápida de um óptimo combinado par de anticorpos

Citation:. Jokerst JV, Chen Z, Xu L, Nolley R, Chang E , Mitchell B, et al. (2015) um sensor magnético Baseado-grânulo para a quantificação da próstata Cancro Biomarcadores múltipla. PLoS ONE 10 (9): e0139484. doi: 10.1371 /journal.pone.0139484

editor: Chandan Kumar-Sinha, da Universidade de Michigan, Estados Unidos

Recebido: 22 Janeiro, 2015; Aceito: 13 de setembro de 2015; Publicação: 30 de setembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Jokerst et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos EUA Instituto Nacional do Câncer Grant U01 CA152737, R25-T CA118681 e da Fundação Canárias. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PAC) é a segunda principal causa de morte por câncer em homens americanos, ferramentas de rastreio e de prognosticação mas eficazes permaneceram indescritíveis devido a ensaios e biomarcadores não-específicas [1]. Enquanto ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) é o padrão de ouro para medir a proteínas séricas, que sofre de longos períodos de desenvolvimento do ensaio para novos biomarcadores, volumes elevados de amostras, e requer muitos passos operacionais complexos. ELISA também podem sofrer de alta fundo e não-específicas interferências, porque ele usa um sistema de comunicação óptica baseada.

Para resolver isso, muitas tecnologias concorrentes foram propostos incluindo chemiluminescent-, microfluidic- [2], das nanotecnologias [3], e magnética baseados em [4] abordagens. No entanto, muitas dessas abordagens sofrem de custo elevado, baixa taxa de transferência, os tempos de construção ensaio longo, e a necessidade de um operador especializado. Assim, um poderoso mas simples plataforma de ensaio com utilidade universal para uma ampla variedade de proteínas biomarcadores ainda não foi relatado. Em particular, a comunidade biomarcador seria bem servido de ferramentas analíticas para os painéis de biomarcadores.

Na verdade, vários estudos recentes têm sugerido que os painéis de biomarcadores pode ser mais eficaz na identificação precoce de câncer e classificação da agressividade da doença que o antígeno específico da próstata [5] ou outros ensaios de ponto único [6, 7]. Com efeito, devido à complexidade biológica profunda de cancro, parece lógico que ensaiar a mais do que um biomarcador seria benéfica em prognosticar ou detecção de doença no maior número de pacientes com precisão. Estes painéis incluem proteínas transmembrana [8], metabolitos [9], auto-anticorpos [10], RNA não-codificante como

PCA3

[11], fusões de genes, incluindo

TMPRSS2-ERG

[12], as células tumorais [13, 14], padrões de metilação do DNA circulante [15], perfis gene [16], exossomos /prostasomes [17], e muitos outros [18].

Aqui, descrevemos uma abordagem baseada na membrana piezoeléctrica que utiliza interacções específicas com esferas magnéticas para quantificar biomarcadores de cancro da próstata com muitas vantagens para a construção de ensaio: 1) Esta abordagem é quase livre de matriz porque utiliza esquemas de quantificação magnéticos e com base piezo-em vez de óptica; 2) O sistema pode rapidamente ( 2 dias) identificar um par de anticorpos pareados por imunoensaio; 3) O sistema tem limites de detecção log ordens menor do que ELISA por causa da avidez do cordão tridimensional contra planar ELISA; e 4) O sistema é largamente independente do operador.

Nós usamos esta ferramenta para criar um painel de câncer de próstata biomarcador e avaliada a sua utilidade a partir de amostras de pacientes com PAC e pacientes com hipertrofia prostática benigna (BPH). Estamos focados em proteínas do soro devido a sua facilidade de amostragem, papel estabelecido na identificação e monitoramento de doenças, e ao grande número de amostras de soro inclinadas disponíveis para teste. Foram incluídos marcadores recentemente identificados, bem como ensaios com base no PSA estabelecidos. Sete proteínas foram incluídos neste painel baseado na compreensão corrente da literatura de CAP:

PSA [5] é uma glicoproteína enzimático produzido pela próstata com a função da motilidade do esperma [7]. Este painel inclui tanto PSA livre (fPSA) não complexada como acompanhante proteínas carboidratos e PSA total (tPSA) que inclui tanto complexados e não complexados isômeros [19, 20].

prostático fosfatase ácida (PAP) é uma glicoproteína kD 100 sintetizado na próstata que hidrolisa os ésteres de fosfato com pH ácido. PAP é documentado na literatura histórica e foi utilizado antes da identificação do PSA para detectar e monitorar PAC [21]. Painéis utilizando PAP demonstraram especificidade aumentada, mas sem aumento na sensibilidade [22].

anidrase carbónica 1 (CA1) é uma metaloenzima implicada na interconversão de CO dissolvido

2 e água em bicarbonato e é responsável para a regulação do pH. CA1 foi recentemente demonstrado que é sobre-regulada em doentes da tampa através de espectrometria de massa de perfis [23].

proteína secretada ácida e rica em cisteína (SPARC), também conhecido como osteonectina ou porão-membrana é uma proteína de 40 40 kD, a proteína implicada na migração de células de cancro da próstata [24] e o cancro da próstata metastático [25].

a interleucina-6 (IL-6) é uma citocina inflamatória. IL-6 e o ​​seu ligando de IL-6 solúvel do receptor (IL-6SR) são correlacionados com doença agressiva, incluindo maior classificação de Gleason, fase avançada, o desenvolvimento de metástases e diminuiu a sobrevivência [26, 27]. Os níveis circulantes de IL-6 e IL-6SR são pensados ​​para resultar a partir do tumor primário, em oposição aos depósitos metastáticos [7].

espondina-2 (SPON2) funciona com a via Wnt para activar e beta catenina podem facilitar a morfogénese [28]. SPON2 tem sido mostrado para ser sobre-expresso em meios de cultura de tecidos de linhas celulares de cancro do receptor de androgénio da próstata positivo [29, 30]. testes sorológicos SPON2 também foram mostrados para ser elevados em pacientes com PAC em relação aos controles saudáveis ​​[31].

Este sistema baseado em grânulo magnético correlaciona a concentração de biomarcador para mudanças na freqüência acústica de uma membrana piezoeléctrico [32]. A gama dinâmica linear do ensaio foi afinado para coincidir com a concentração relevante destes biomarcadores em soro diluído [33]. Nós identificado pela primeira vez pares combinados de anticorpos e, em seguida, caracterizou os ensaios para a reprodutibilidade, sensibilidade analítica, e interferências da matriz. Finalmente examinou a sensibilidade e especificidade clínica do painel com um ensaio retrospectivo de 240 depositado amostras de soro humano. Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro exemplo destas proteínas integrados em um único painel e o uso mais detalhada deste sistema de análise piezoelétrico à base de talão com importantes implicações em Cap triagem, monitoramento e tratamento.

Materiais e Métodos

Os anticorpos

a menos que indicado de outra forma, imunorreagentes foram funcionalizados em nosso laboratório e validado ou com um recombinante ou padrões de proteína purificada pelo paciente. pares ideais combinados incluindo anticorpo de captura (c.Ab) e anticorpo de detecção (d.Ab) foram obtidos a partir dos seguintes fornecedores:

tPSA: O c.Ab (Meridian p /n M66280M) a d.Ab (Meridian p /n M66276M) foram monoclonal IgG

fPSA:. o c.Ab (Meridian p /n M86806M) a d.Ab (Meridian p /n M66276M) foram IgG monoclonal mouse. Para ambos tPSA e de fPSA usamos PSA humano nativo preparados em nosso laboratório como o padrão [34]

PAP:. O c.Ab (CosmoBio p /n SIM-2ZHCMP2-EX; clone Hib-7432, descrito abaixo como cOS2) foi um monoclonal do rato, ea d.Ab (CosmoBio p /n SIM-2ZHCMP1-EX, descrito abaixo como COS1) foi um monoclonal mouse. Um padrão de proteína recombinante (Fitzgerald p /n 30C-CP1016x) validou o ensaio. Outros anticorpos avaliadas incluem um rato monoclonal IgG1 clone 690.017 de R D Systems (RDMo) e uma ovelha policlonal IgG p /n AF6249 de R D Systems (RDPo)

SPARC:. O c.Ab (Invitrogen ; p /n 33-5500 (On1-1)) foi um monoclonal do rato, ea d.Ab (R D Systems; p /n AF941) foi um policlonal objetivo. Um padrão de proteína recombinante (R D Systems p /n 941-SP-050) validou o ensaio

CA1:. O c.Ab (Abnova; p /n H00000759-M21) era um coelho de afinidade purificada policlonal, eo d.Ab (Abnova; p /n H00000759-D01P) foi monoclonal anti-CA1, IgG2b Kappa. Um padrão de proteína recombinante (Abnova p /n H00000759-P01) validou o ensaio

IL6-sr:. O c.Ab (R D Systems p /n AF227) foi um policlonal de cabra, ea d. AB (R D Systems p /n MAB227) foi um monoclonal mouse. Um padrão de proteína recombinante validado o ensaio

SPON2:. O c.Ab (R D Systems p /n AF2609) foi um policlonal de cabra, ea d.Ab (Abnova p /n H00010417-MO1J) foi um anticorpo monoclonal mouse. Um padrão de proteína recombinante (R D Systems) validou o ensaio

Ensaio Reagentes

esferas magnéticas e d.Abs foram preparados como descrito anteriormente [35].. Resumidamente, contas (1 mg, Bioscale, Inc.) foram armazenados em dimetilformamida anidra e foram recolhidas por centrifugação e lavadas com PBS. Após a última lavagem, adicionou-se PBS, 146? L de sulfato de amónio 4,1 M, e 5-20 ug de anticorpo. A quantidade de PBS foi ajustada de tal modo que o volume total foi de 300 ul. A solução foi incubada durante a noite num rotor tubo girando a 4 rpm. No dia seguinte, a solução foi lavada quatro vezes com 0,1% de Tween em PBS (PBST) e finalmente armazenadas em PBS com 1% de BSA e 0,01% de azida de sódio. As esferas foram estáveis ​​durante mais de 4 meses.

Os d.Abs foram marcadas com um reagente f luoresceina-NHS (Pierce). O corante foi adicionado a uma razão molar de 20 vezes e incubou-se à temperatura ambiente em PBS à temperatura ambiente enquanto se protegia da luz. O conjugado foi purificado com colunas de spin e caracterizados com espectroscopia de absorção para determinar a concentração e rotulagem da eficiência final.

Analyzer e condições de ensaio

Foi utilizado um analisador de piezo-elétrico disponível no mercado para as medições de proteínas (VIBE, Bioscale, Inc .; ver S1 video). Este sistema consiste de um analisador de bancada e cartucho de reagente descartável capaz de analisar 288 amostras e padrões por corrida. O analisador tem incorporado manuseio de fluidos, eliminação de resíduos, e capacidades de manipulação de dados [33, 35]. O sinal é reportado em unidades relativas por meio de software embutido e é proporcional ao número de esferas imobilizados na membrana e, assim, a concentração do analito. controle de hardware e análise de dados foi realizada com software comercial Bioscale (Vibe versão 0.7.3).

Este sistema é composto por um cartucho de 8 canais descartável ligada à robótica de manipulação de fluidos e um ímã eletricamente controlada. As amostras e padrões foram preparados em 1: 10-1: 1000 factor de diluição e plaqueadas em placas de 96 poços juntamente com os grânulos e anticorpo fluorescente. As amostras foram preparadas por mistura de 80 ul de amostra ou padrão com 20 uL de pérolas revestidas com c.Ab (900.000 esferas /ml) e 20 ul de d.Ab marcado com fluoresceína (1200 ng /mL). Estes reagentes formar um imunocomplexo sanduíche na presença do antigénio biomarcador (Fig 1A).

. O táxi. é ligado covalentemente a um cordão magnético que é incubado com a amostra e marcaram-fluoresceína d.Ab. Esta amostra é introduzida numa célula de fluxo tapado com uma membrana de piezo-eléctrico revestido com um anticorpo anti-f luoresceina. Um electroíman acima da membrana é controlada com o software incorporado. B. Após a perturbação magnética, todas as esferas (círculos pretos) avançar para a membrana (Bi), e contas com um imunocomplexo concluída (círculos pretos revestidas com pontos vermelhos) se ligam ao anticorpo anti-fluoresceína (Bii). Depois que o campo é removido e o fluxo restaurado, apenas a contas com um imunocomplexo concluídos permanecem vinculados (BIII). Estes grânulos de alterar a oscilação da membrana (representada como curva sinusoidal de laranja), que é interpretado como sinal em unidades arbitrárias [36]. Veja S1 Vídeo. Em B, a linha azul sólido Pos marcado refere-se a esferas na presença do antigénio, e a linha vermelha marcada pontilhada Neg refere-se a grânulos na ausência de antigénio.

Até 100 ul desta mistura de foi necessário para triagem e análise magnético. Esta mistura foi incubada com agitação durante 4 horas. A solução em cada coluna da placa (todos os 8 poços) foi então automaticamente pipetados para canais de escoamento individuais no interior do cartucho de 8 canais. Depois a solução foi carregada para dentro da câmara, um campo magnético foi aplicado e todas as esférulas foram atraídas para a membrana piezoeléctrica anti-fluoresceína IgG-revestidos na frente do campo magnético. Fluxo e factores de diluição foram ajustados de tal modo que o número de grânulos foi imobilizadas entre 2000-3000.

Como estas contas de entrar em contacto com a membrana piezoeléctrica, a frequência de oscilação é alterada e registada (Figura 1B). O campo magnético foi mantido para permitir interacções entre os grânulos com os imunocomplexos completos e a membrana-tag fluoresceína na d.Ab facilitada ligação do imunocomplexo a uma IgG anti-fluoresceína na membrana piezoeléctrica. O campo foi então interrompida e retomada fluxo para remover grânulos não especificamente ligada. A alteração na frequência de piezo foi então registada como uma medida do número de contas ligadas e, assim, a concentração de antigénio que completa o imunocomplexo (Fig 1B).

Amostras

depositado amostras de soro tinham sido recolhidos ao longo 20 anos, com o consentimento informado pelo Departamento de Urologia da Universidade de Stanford. Utilizou-se soro porque tem factores de coagulação removido, o que pode produzir o sinal e o fundo não específica em ensaios de proteína de plasma. O diagnóstico foi confirmado com biópsias de 10 ou 12 núcleos no momento da coleta da amostra. O Conselho da Universidade de Stanford Revisão Interna aprovou este estudo e a concepção do consentimento informado. Todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito no momento da coleta da amostra, e formulários de consentimento dos participantes foram curadoria juntamente com os espécimes do Departamento de Urologia Stanford. Estas amostras foram descongeladas, DE-identificados, diluído em PBS, e aliquotas para teste. Foram estudadas 240 amostras seleccionadas aleatoriamente a partir de um banco de ~ 2.200 espécimes com curadoria de Stanford Radiologia. A idade média dos controles BPH foi de 65,9 ± 9,2 (30-87), ea idade média dos pacientes com PAC foi de 62,6 ± 6,4 (46-77); houve uma diferença de idade estatisticamente significativa entre os dois grupos (p = 0,002). Nós incluímos essa informação no texto. Havia 120 amostras BPH e 100 casos de câncer de próstata confirmado selecionada; todas as amostras tinham valores de PSA entre 2-20 ng /mL. Das amostras PAC, 32 foram o escore Gleason 6 e 68 foram Gleason score 7. Como controle, houve também 20 amostras de homens com CaP recolhidos após a prostatectomia radical. factores de diluição foram optimizadas empiricamente para dar uma recuperação de pico de 100% ± 10%. soro feminina normal reunido foi comprado de Atlanta Biologicals

Interpretação de Dados e Estatística

unidades do sinal das incógnitas foram convertidos em unidades de concentração usando uma curva sigmoidal padrão com software Bioscale (versão Vibe 0.7.3. ). A faixa de detecção foi definido como esses pontos de calibração que podem ser discriminados de seus próximos pontos de calibração mais próximos. Os valores de referência foram obtidos a partir directrizes clínicas ou na literatura dependendo do estado dos biomarcadores. Fizemos um teste t de Student 2 caudas para comparar os resultados de BPH e amostras PAC no Excel 2010. As curvas AUC e ROC e estatísticas associadas foram preparadas com GraphPad Prism 6.04.

Resultados

identificação de pares combinados

o primeiro tinha para identificar um par de anticorpos óptima, e a secção seguinte descreve esta abordagem utilizando PAP como um exemplo-resultados para outros ensaios são apresentados na Tabela 1. a Figura 2 mostra os dados representativos de quão isto foi conseguido para o biomarcador PAP com um assim chamado “ensaio de tabuleiro de xadrez”. Aqui, quatro anticorpos PAP diferentes, bem como um controlo de isotipo foram usadas tanto como o c.Ab e d.Ab. Todos os quatro anticorpos e um controlo de isotipo foi usada em concentrações de antigénio de 0 e 1 ng /mL. Fig 2A traça a diferença de sinal entre estas duas concentrações. Para PAP o sinal maior foi com o COS1 d.Ab e COS2 c.Ab com um sinal de 0,65 u.a. (Figura 2A). Invertendo a ordem, ou seja, COS2 d.Ab e COS1 c.Ab tinha um valor de 0,43 u.a. O par de R D Systems tinha sinal mais baixo, e o anticorpo de controlo de sinal teve isótopo 0,01 A.U. Assim, COS1 e cos2 foram usadas para o restante das experiências.

) Pares de anticorpos óptimas

A foram identificadas com um ensaio de “tabuleiro de xadrez”, que avaliou diferentes pares de anticorpos, bem como controlos de isotipo. Metric plotados aqui é diferença de sinal entre o controle negativo e 1 ng PAP recombinante /mL. Os diferentes anticorpos são definidos na secção de Materiais e Métodos. B) A curva de calibração completa ilustra as diferentes sensibilidades dos diferentes pares de anticorpos para PAP. Par 1: COS2 c.Ab .; COS1 d.Ab. Par 2: RDPo c.Ab .; RDMo. d.Ab. As barras de erro vermelhas representam o desvio padrão de pelo menos três medições repetidas. C) Reprodutibilidade do dia a dia é 8%. D) A abordagem baseada em piezo mostra 3 ordens de log melhoria na sensibilidade analítica contra ELISA direto quando pares de anticorpos idênticos são usados ​​(COS1 /COS2).

O par melhor-combinado com uma gama dinâmica resultante, de referência gama, factores de diluição e são mostrados para os ensaios de biomarcadores 7, bem como os valores de variação intra-ensaio representativo.

é claro que mudar o par anticorpo muda a sensibilidade da curva. Figura 2B ilustra que, alterando o c.Ab para RDPo e o d.Ab para RDMo, a gama de sensibilidade alterada 0,01-1,0 ng /ml para 1 a 100 ng /mL. Finalmente, foram comparadas as curvas de resposta de PAP através do sistema à base de grânulo com a ELISA utilizando o mesmo par COS1 /cos2 (Figura 2D). Nós mostramos uma melhoria fim de 3 log na sensibilidade analítica utilizando a abordagem baseada no talão que destaca a sensibilidade analítica reforçada devido à avidez do cordão versus a planar ELISA substrato.

A quantidade de c.Ab e d. Ab por ensaio foi também investigado (Fig S1). O fabricante recomenda-se uma concentração de trabalho do grânulo de 150.000 esferas /ml e 200 ng /mL d.Ab. Testamos valores d.Ab de 100 e /mL, bem como 10,000-300,000 contas /mL a 400 ng, mas não encontrou qualquer acessório na curva dose-dependente 10,0-0,015 ng /mL. A 1 ng /ml de PAP recombinante padrão, o sinal mais elevada foi obtida com esferas 10.000 /mL e 100 ng /mL de d.Ab. No entanto, estas condições também resultou num maior sinal de fundo a concentrações mais baixas (S1 FIG). Assim, 150.000 esferas /ml e 200 ng /mL d.Ab foram utilizados para todos os ensaios subsequentes.

Ensaio Caracterização

A seguir, examinou tanto intra-ensaio (entre os poços executados no mesmo dia ao mesmo tempo) e a variância de inter-ensaio (diferença entre a média de execuções em dias diferentes; Fig 2C). Para o PAP, a variação intra-ensaio variou de desvio padrão relativo de 0,05% [37] em 6 ng /mL a 5,47% a 0,02 ng /mL. A variação inter-ensaio em três dias diferentes foi de 7,1% RSD. Todos os outros ensaios tiveram 7% variância para intra-ensaio variância e 10% para variação inter-ensaio. Ao fazer comparações do dia-a-dia, foi de importância crítica que as curvas de calibração, ser dispostas nas placas de 96 poços da mesma maneira em cada dia subsequente. Como cada linha na placa de 96 poços leva ~ 5 minutos para analisar, alterar a localização dos grânulos permite tempos de incubação mais longos, o que pode resultar em maior grânulo /acumulação imunocomplexo e sinal assim maior.

Com um optimizado combinado par de anticorpos na mão, nós próxima descoberto e corrigido quaisquer interferências da matriz novamente ilustrando com PAP. Usamos pool de soro fêmea normal, que não deve conter PAP. Soro em fatores de diluição de 1: 2-1: 256 foi preparado e analisado. Outro lote de amostras diluídas foram adicionadas com 0,5 ng /ml de PAP. As amostras foram analisadas e a percentagem de recuperação representados graficamente na Figura 3A, bem como dados de recuperação de pico para SPARC spiking a 125 ng /mL e CA1 spiking a 10 ng /mL. Os resultados mostraram que a recuperação de 100% foi conseguida com factores de diluição de 16 vezes para estes analitos. valores de recuperação pico diminuído e aumento são devido à ligação não específica de outras proteínas do soro aos anticorpos. Os outros cinco biomarcadores foram otimizados de forma semelhante.

A) a percentagem de recuperação de três biomarcadores representativas. Os efeitos da matriz podem amortecer sinal (CA1, PAP) ou inflar sinal (SPARC). factores de diluição ideais foram dependentes da sensibilidade do ensaio e de referência a gama de biomarcador (Tabela 1). Preto linha tracejada indica 100% de recuperação pico. B) Bland-Altman [38] validar a integridade da amostra de um subconjunto (N = 35) das amostras clínicas com altos volumes de amostra. Linha tracejada vermelha indica intervalo de confiança de 95%.

amostras clínicas

O primeiro passo foi validar a estabilidade da amostra. Para fazer isso, nós reanalisados ​​os valores de PSA de um subconjunto (n = 35) das amostras que tinham altos volumes de soro utilizando um acesso analisador clínico Beckman (Hybritech) no Centro Médico da Universidade de Stanford e comparou isso aos valores inicialmente mensurados pelo no momento da coleta. Nós criamos um gráfico de Bland-Altman e mostrou que 92% das amostras estavam dentro do intervalo de confiança de 95% (Fig 3B). Esta validação utilizado somente aquelas amostras que tinham um volume suficiente para o sistema clínico e ensaio baseado em grânulo. Os resultados indicaram que a integridade PSA foi mantida durante o armazenamento.

Em seguida, mediram os níveis de biomarcadores de todos os analitos no soro diluído para as concentrações apresentadas na Tabela 1. Os dados para a BPH, boné, e pós-cirurgia CaP amostras são mostrados na Fig 4. o valor médio a partir de amostras de doentes com tampa são 1.5-, 1.6-, 0.83-, 0.94-, 0,79, e 1,03 vezes maior do que para a BPH CA1, PSA, IL6-SR, PAP, e ensaios SPARC, respectivamente. Testes com uma diferença significativa entre BPH e CAP foram PSA (p 0,0001), CA1 (p = 0,03), SPARC (p = 0,049), e SPON2. (P 0,10

-6)

valores brutos com meios para BPH, boné, e as amostras de pós-operatório (PS). Os biomarcadores incluem tPSA (A), fPSA (B), CA1 (C), PAP (D), IL6-SR (E), SPARC (F), e SPON2 (L). As linhas horizontais indicam valores médios.

Nós criamos curvas ROC e mediu o AUC para todos os biomarcadores usando o diagnóstico confirmado por biópsia e os valores medidos (Fig 5). O PAP AUC foi de 0,51; 95% intervalo de confiança 0,43-0,58 com p 0,50. O SPARC AUC foi de 0,51; 95% intervalo de confiança 0,43-0,59 com p 0,50. O CA1 AUC foi de 0,55; 95% intervalo de confiança 0,47-0,63 com p = 0,17. A AUC IL-6SR foi de 0,57; 95% intervalo de confiança 0,50-0,65 com p = 0,06. O SPON2 AUC foi de 0,76; 95% intervalo de confiança 0,69-0,82 com p . 0,0001

A) Os valores médios com desvio padrão para os sete biomarcadores com HBP, CaP, e pós-operatório [39] amostras. As unidades são ng /mL. O valor p relatado aqui é a significância entre as amostras BPH e CAP. os valores da AUC também são dadas e relatar discriminação entre PAC e BPH. painel inferior apresenta curvas ROC para a PSA, SPON2 e PSA OU SPON2. O operador OR aumenta a AUC para 0,84 de 0,80 por si só PSA.

O valor de AUC para PSA é típico de valores da literatura [40-42]. Em uma meta-análise utilizando PSA livre e total, o agregado de 41 estudos com 19,643 participantes foi uma AUC de 0,70 [41]. Infelizmente, outros biomarcadores não melhorou a AUC com a excepção de SPON2. Esse marcador tinha um valor de AUC de 0,76 em comparação com o PSA AUC de 0,80. Quando os dois foram usados ​​em uma operação OR, a AUC aumentou ligeiramente 0,84. Não há outras operações ou outras combinações de biomarcadores aumentou a curva AUC.

Também estudamos se quaisquer biomarcadores poderia discriminar entre Gleason 6 e Gleason 7 pacientes (S1 tabela). Nenhuma das novas proteínas mostrou um valor de p 0,05. Embora este conjunto de dados mostrou uma diferença muito significativa para o tPSA ( 0,01), isto é provavelmente devido à presença de alguns valores discrepantes-o valor de p foi 0,06 quando foram utilizados os valores de PSA clínicos originais. Nós também fizemos a análise ROC para diferentes pontuações Gleason contra BPH e observou significância com IL-6SR. Na comparação Gleason 7 pacientes versus BPH com IL-6sR encontramos um valor de AUC de 0,66; o intervalo de confiança de 95% foi 0,57-0,76 com p = 0,005. Segregando pelo escore de Gleason não melhorou os valores de AUC para outros biomarcadores.

Discussão

Existem muitas abordagens para medir novos biomarcadores da PAC após ELISA tradicional. Um dos gargalos fundamentais na maioria dos regimes de desenvolvimento do ensaio é a identificação de um par de anticorpos combinado adequado. Isto é talvez mais importante vantagem da abordagem baseada grânulo usado no trabalho da corrente de identificação de um par de anticorpos combinados geralmente demora menos de 2 dias após a síntese dos reagentes para a selecção final do par óptima. Este sistema tem boa reprodutibilidade intra-ensaio e inter-(CV 10%) e pode minimizar interferências rapidamente da matriz. Outras vantagens incluem os limites de detecção mais baixos por causa da avidez no projeto do grânulo, bem como de baixo limiar para treinamento do usuário. Limitações do sistema incluem os requisitos de volume relativamente alto de amostra por causa de multiplexação restrito. Para resolver isso, estamos desenvolvendo ferramentas analíticas adicionais em nossos laboratórios, como a magneto-nanosensor para multiplexado análises com faixas largas e dinâmicas e baixo volume de amostra (40 ul) requisitos críticos para amostras preciosas [4].

é importante que a verificação biomarcador ser permitido falhar rapidamente, antes que investimentos significativos são feitos no desenvolvimento de teste ou uso de amostras clínicas preciosas. Este esquema baseado talão permite a verificação rápida do potencial biomarcador. Nossos dados mostram que muitos dos biomarcadores de proteína reportados anteriormente para discriminar entre PAC e doentes com HBP falhou com nossas amostras de pacientes específicos. Talvez o mais surpreendente foi CA1. Em trabalhos anteriores utilizando 54 amostras PAC e 60 controles saudáveis ​​[23], esta proteína tinha um valor de AUC de 0,64 e um valor de AUC de 0,76 quando combinado com PSA. Uma diferença importante é que em estudo restringiu as suas amostras de pacientes no assim chamado “zona cinzenta” de valores de teste-PSA de PSA entre 4 e 10 ng /mL. IL-6SR, também tem sido demonstrado que se correlacionam com a progressão [27] e metástases ósseas [26] e foi plausível que a expressão diferencial teria sido medida em HBP contra amostras de pacientes com PAC, no entanto, observou nenhuma diferença significativa entre estas duas populações de pacientes.

Nosso trabalho com SPON2 mostra que ele tem alguma utilidade em testes de PAC. Uma característica curiosa a partir deste estudo é que os níveis em doentes com HBP (126,5 ng /mL) foi realmente mais elevada do que os pacientes tampa (73,0 ng /mL). Esta diferença foi muito significativa a p = 10

-6. Em um trabalho anterior [31], os níveis SPON2 em pacientes com PAC (77,5 ng /ml) foram superiores em pacientes com “nenhuma evidência de malignidade” (23,6 ng /mL). Embora as diferenças de valores absolutos são provavelmente atribuíveis a diferenças na seleção padrão e anticorpos, a tendência é um pouco confuso. Uma possível explicação é nas diferenças de seleção de pacientes. Esses controles normais e saudáveis ​​são um grupo de pacientes muito diferente do que o grupo BPH utilizado para comparação em nosso estudo. Na verdade, é possível que os níveis de SPON2 aumentar durante BPH acima dos valores observados tanto em indivíduos normais ou boné. O trabalho futuro terá que estudar mais SPON2 níveis em vários grupos de doentes e de controlo com elevado número de pacientes para entender melhor essas discrepâncias.

Outro estudo sugeriu que SPON2 só é aplicável a pacientes com valores de PSA abaixo de 10 ng /mL [30]. Restringindo nossas amostras para estes pacientes deram um valor médio BPH de 119,9 ± 65,9, um valor médio da PAC de 82,6 ± 50,36 (p = 0,004) e AUC de 0,72. Assim, restringindo nossos dados para estes pacientes não melhorou a AUC.

A análise do pós-operatório pacientes mostrou que as mudanças mais dramáticas nos níveis de biomarcadores ocorreu em testes baseados em PSA. A PSA em pacientes pós-prostatectomia diminuiu de 18 vezes contra BPH e de 30 vezes para os pacientes com PAC. os níveis de PAP em pacientes pós-prostatectomia era 2 a 3 vezes mais baixa. Outros biomarcadores não apresentaram significativa, a mudança (P & gt 0,05)

Conclusão

Apresentamos um sensor baseado em talão piezoelétrico para medir as proteínas do soro, com potencial para discriminar entre BPH e Cap.. Este estudo confirmou a utilização de PSA para discriminar entre BPH e boné, mas os valores AUC foram sub-ótima para o rastreio de toda a população. Também mostrou que o uso de SPON2 em conjunto com a PSA através de uma operação OR pode aumentar a AUC 0,80-,84. Esta abordagem tem utilidade para uma variedade de biomarcadores e trabalhos futuros circulando irá avaliar biomarcadores mais promissores, bem como biomarcadores à base de urina, como o TMPRSS2:. Fusão ERG

Informações de Apoio

S1 Fig. Optimização da Concentração do grânulo e d.Ab.

Variações na concentração d.Ab duas vezes acima e abaixo do valor recomendado 200 ng /ml foram usadas em adição a concentrações crescentes de grânulos (inset). As curvas de calibração em cada um desses pontos ilustram que a resposta é estável ± 15%, apesar dessas variações

doi:. 10.1371 /journal.pone.0139484.s001

(PDF)

Tabela S1. . Biomarcadores Concentrações como uma função da Gleason Pontuação

PSA mostrou as diferenças mais significativas entre pacientes com escores de Gleason de 6 e 7.

doi: 10.1371 /journal.pone.0139484.s002

(PDF)

S1 Vídeo.