Abstract
Alto grau de câncer de ovário seroso (HGSOC) é o tipo histológico mais agressivo de câncer epitelial de ovário, que é caracterizado por uma elevada frequência de somáticas
TP53
mutações. Foram realizadas análises exome de tumores e tecidos normais correspondentes de 34 pacientes japoneses com HGSOC e observaram um número substancial de pacientes sem
TP53
mutação (24%, 8/34). Combinado com os resultados das análises de variação do número de cópia, que subdivide os 34 pacientes com HGSOC em subtipos designados ST1 e ST2. ST1 mostrou via p53 intacta e foi caracterizado por menos mutações somáticas e alterações no número de cópias. Em contraste, a via de p53 foi prejudicada em ST2, a qual é caracterizada por mutações somáticas abundantes e alterações no número de cópias. perfis de expressão de genes combinados com análises usando o recurso Gene Ontology indicam o envolvimento de processos biológicos específicos (mitose e helicase do ADN) que são relevantes para a estabilidade genômica e etiologia do câncer. Em particular, demonstrar a presença de um novo subtipo de pacientes com HGSOC que é caracterizada por uma via p53 intacta, com alterações genómicas limitada e os perfis de expressão de genes específicos
citação:. Hayano T, Yokota Y, Hosomichi K, Nakaoka H, Yoshihara K, S Adachi, et ai. (2014) Caracterização Molecular de um subtipo p53 Pathway intacto em alto grau câncer de ovário seroso. PLoS ONE 9 (12): e114491. doi: 10.1371 /journal.pone.0114491
Autor: Michael Baudis, da Universidade de Zurique, Instituto Suíço de Bioinformática, Suíça |
Recebido: 16 de maio de 2014; Aceito: 10 de novembro de 2014; Publicação: 02 de dezembro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Hayano et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que, por razões aprovadas, algumas restrições de acesso aplicam-se aos dados subjacentes às conclusões. De dados contêm informações de identificação e não pode ser disponibilizada. Um conjunto de dados identificou-de mínima está disponível em Figshare: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1235612. Estão disponíveis dados adicionais, a pedido de Prof. Ituro Inoue ([email protected])
Financiamento: Este trabalho foi financiado em parte por uma Grant-in-Aid para Jovens Cientistas (B) (Grant Não . 23791816) da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (https://www.jsps.go.jp/) (KY). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
As taxas de idade ajustada de câncer uterino anexos do ovário e outros em 2002 foram 10,6 por 100.000, e 5,2 por 100.000 pessoas-ano nos EUA e no Japão, respectivamente [1]. câncer epitelial de ovário é uma entidade heterogênea que compreende vários tipos histológicos, tais como, células de alto grau de baixo grau serosa, seroso claro, endometrioid, e os cancros mucinoso [2], [3]. cancros do ovário são divididos em Tipo I e Tipo II tumores [2], [4]; Tipo I tumores incluem endometrioid baixo grau de baixo grau serosa, de células claras, e carcinomas mucinosos. Estes tumores pouco respondem a terapia à base de platina, abrigar uma frequência elevada de mutações em genes que codificam os componentes da via de sinalização RAS, e são relativamente estáveis na estrutura genómica. Tipo tumores II incluem carcinomas endometrióides de grau elevado serosa e de alta qualidade e são altamente agressivo. Um estudo em grande escala de câncer de ovário seroso de alto grau (HGSOC) pelo grupo Cancer Genome Atlas (TCGA) caracterizado HGSOC como
TP53
-mutation enriquecido (96%) com aberrações de cópias do gene somática do genoma números. Este estudo identificou vias normalmente alteradas tais como RB1, PI3K /RAS, o entalhe, a recombinação homóloga, e vias FOXM1 [5]. O estado de mutação do
TP53
está associado a estágios, padrões de expressão gênica, ea sobrevivência de pacientes com câncer de ovário seroso [6].
Temos uma tentativa de estabelecer um sistema de classificação de risco de ovário seroso cancro utilizando perfis de expressão de genes adquiridos utilizando dados de microarray [7], [8]. Foram identificados 88 genes relacionados com a sobrevivência livre de progressão em 110 pacientes japoneses com estágio avançado de câncer de ovário seroso [7], bem como 126 genes relacionados à sobrevida global em 260 pacientes japoneses com HGSOC em estágio avançado [8]. Para proporcionar uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na patogénese destes cancros e de desenvolver um sistema de classificação de riscos, realizamos perfis das mutações somáticas presentes nestes tumores.
compilado informação genómica para pacientes com HGSOC utilizando sequenciamento exome ea variação do número de cópias (CNV) analisa. De acordo com os perfis das variantes somáticas de nucleotídeo único (SNVS), pequenas inserções e deleções (Indels), e CNVs, classificamos HGSOC em subtipos designados ST1 e ST2 que são caracterizadas por vias de sinalização p53 intactas ou com deficiência, respectivamente. Foram caracterizados mais os dois subtipos comparando os seus perfis de expressão de gene. ontologia Gene (GO) análise mostrou que os genes diferencialmente expressos foram significativamente enriquecida nos grupos helicase GO e mitose de ADN que podem estar envolvidos em instabilidade genómica e tumorigénese de HGSOC. Estes resultados fornecem novos insights sobre as características moleculares e de novos processos biológicos que contribuem para a patogênese da HGSOC, particularmente em pacientes com uma via p53 intacta.
Materiais e Métodos
Ética declaração
as comissões de ética da Universidade de Niigata (IRB No. 239, 428 e 455) e do Instituto Nacional de Genética (IRB No. 23-11) aprovou os protocolos de estudo, e cada participante forneceu consentimento informado por escrito para a recolha de amostras e análises subsequentes.
amostras clínicas
amostras fresco congelado foram obtidos a partir de tecidos de tumor primário antes da administração de quimioterapia. Dois patologistas avaliadas as características histológicas de secções fixadas em formol e hematoxilínicos embebido em parafina e eosina. Porque caracterização histológica definitiva foi um componente crítico do estudo, uma revisão patológica central foi realizado por dois patologistas independentes ginecológicas (HT e TM) sem o conhecimento do estado clínico dos pacientes. tipos histológicos e grau de diferenciação histológica foram determinados de acordo com a classificação da OMS de tumores do ovário e classificação Silverberg, respectivamente [8]. Os dados clínicos (PT- e FIGO-fase) são mostrados na Tabela S1. Utilizou-se sangue periférico como o tecido normal correspondente.
exome sequenciação
O ADN genómico foi isolado a partir de tecidos tumorais, utilizando um método de fenol-clorofórmio e de sangue periférico usando o Kit de DNA QIAamp sangue Maxi (QIAGEN ) [8]. O DNA genômico foi hibridizada com SureSelect Humano Todos Exon Kits (Agilent) para preparar bibliotecas de sequenciamento, e as bibliotecas foram sequenciados utilizando o Illumina HiSeq 2000 (Illumina) com 90 ou 100 módulos finais emparelhado-base. Sequência lê foram alinhadas com um genoma de referência (UCSC hg19) usando BWA [9] e SAMtools [10]. Picard (https://picard.sourceforge.net) foi usado para a remoção duplicado lê. realinhamento local de leituras indels torno conhecidos e recalibração da qualidade da base foram realizadas utilizando GATK [11]. O autor da chamada mutação somática heurística, VarScan 2 [12], foi utilizado para somática chamada mutação. critérios de limite para a detecção de mutações somáticas foram os seguintes: frequência variante normal de 0% eo valor exato de Fisher teste p 0,00001. informações funcionais de mutações somáticas foi anotada usando ANNOVAR [13] e Oncotator (https://www.broadinstitute.org/oncotator/).
previsão dos impactos funcionais de missense único nucleotídeo variantes
efeitos funcionais das mutações somáticas missense identificados foram avaliados usando MutationAssessor 2 [14], no qual se prevê o efeito de substituições de aminoácidos de acordo com um padrão de conservação evolutiva baseado em múltiplos alinhamentos de sequência de uma família de proteínas. Mutações com uma pontuação de impacto funcional (FIS) de 2,0 foram definidos como deletéria
Detecção de câncer de genes motorista
Para detectar possíveis genes motorista câncer com base nas mutações somáticas identificadas, nós. usados OncodriveFM [15], que avalia a acumulação de mutações com alto impacto funcional dentro de um gene, partindo do princípio de que os genes do cancro do controlador são altamente mutados e exercer impacto substanciais funcionais. No entanto, as conseqüências de mutações em genes de passageiros são na sua maioria benignos. OncodriveFM deriva FIS do MutationAssessor 2 para avaliar se genes mutantes são condutores ou passageiros.
Análises de CNV e tumor pureza
polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) experiências de matriz usando Genome-Wide SNP Human 6.0 (Affymetrix) foram previamente realizada para 30 de 34 amostras HGSOC [8], [16]. Por causa das dificuldades técnicas e quantidades de DNA limitados, não foi possível obter dados de matriz SNP para os restantes quatro amostras. arquivos Affymetrix CEL de SNP experimentos matriz usando 30 amostras foram processadas utilizando o pacote de software de detecção de CNV PennCNV [17]. CNVs foram chamados usando um modelo oculto de Markov de acordo com cálculos da relação log R e valores de frequência B de alelo. A frequência CNV entre tumor e amostras normais foi avaliada para cada SNP utilizando o teste exato de Fisher no algoritmo ParseCNV [18]. critérios de limite para recorrentes regiões CNV (CNVRs) foram os seguintes: valor exato de Fisher teste p 0,0005 e nenhuma sobreposição com variações estruturais em amostras de indivíduos saudáveis [19]. Além disso, os ficheiros CEL foram utilizados para estimar a pureza do tumor. Utilizou-se o ASCAT (alelo-específico Análise Copiar número de Tumores) algoritmo [20] na versão do número de cópias NEXUS software 6.0 (BioDiscovery) [21] para estimar a extensão da contaminação de células normais em amostras de tumor. Os dados da matriz Miame-conformes SNP foram depositados ao Gene Expression Omnibus repositório de dados (número de acesso GSE61237).
microarrays experimentos e processamento de dados
A extração de RNA, rotulagem Cy3, hibridação microarray, sinal digitalização e extração de características foram realizadas em estudos anteriores [7], [8]. A normalização de dados foi realizada utilizando a configuração GeneSpringGX11 (Agilent) do limiar de sinal bruto de 1,0 e normalização ao 75
percentil.
A expressão gênica análise
A significância das diferenças na expressão genética entre os dois subtipos foi avaliada utilizando o
t
-teste. Após a avaliação, o teste de múltipla foi corrigido pela taxa de descoberta de falsas (FDR), utilizando o procedimento Benjamini-Hochberg [FDR (BH)]. Nós estabelecemos FDR (BH) a 0,1 como o limiar significativo. Estas análises foram realizadas utilizando o módulo ComparativeMarkerSelection de GenePattern [22].
GO análise
GO análise foi realizada utilizando a ferramenta de anotação Clustering Funcional incluídos no recurso bioinformática DAVID [23]. Esta ferramenta avalia a semelhança dos termos de anotação usando estatística kappa e grupos de forças para compartilhar perfis de anotação semelhantes usando uma partição de várias ligação heurística difusa [24]. Configurações foram os seguintes: oito categorias de anotação (OMIM_Disease, COG_Ontology, SP_PIR_Keywords, GOterm_BP_FAT, GOterm_MF_FAT, BBID, BioCarta e KEGG_Pathway), sobreposição semelhança prazo de ≧ 3 limiar estatística kappa de 1, associação de grupo de ≧ 3, ea difusa múltipla limiar partição -linkage de 1, respectivamente. pontuações de enriquecimento foram calculados usando a média geométrica dos valores de p teste exato de Fisher modificado (escala -log) para o enriquecimento gene de cada termo GO em cada grupo GO e uma pontuação de enriquecimento de 1,3 é considerado significativo [23]
.
A visualização de dados
Os dados mutação somática foram exibidos usando Gitools (versão 1.8.4) [25]. dados de número de cópias foram exibidos usando Integrative Genomics Viewer (IGV, versão 2.3.25) [26]. Enxame da abelha e caixa parcelas foram criados usando o pacote beeswarm no repositório CRAN (https://cran.r-project.org/). visualizações de mapas de calor de dados de expressão gênica foram exibidos usando o módulo HeatMapViewer em GenePattern [22].
Resultados
Genomic alteração de perfil
As mutações somáticas identificadas em amostras adquiridas de 34 Japanese pacientes com HGSOC foram catalogados de acordo com a análise dos dados exome sequenciamento. A profundidade média de leitura foi de 91 × e 84 × para amostras de tumor e normal, respectivamente. Cobertura de ≧ × 10 foi conseguida por 89% e 88% de codificação de bases de amostras tumorais e normais, respectivamente (Tabela S2). Foram identificados 1.399 nonsynonymous (missense e sem sentido) e da emenda mutações no local somáticas (41 mutações por amostra) usando VarScan 2 [12] com os critérios pré-definidos descritos na secção Materiais e Métodos. Destas variantes somáticas, 158 foram escolhidos aleatoriamente e submetidos a sequenciação de Sanger, e 143 variantes foram validados com sucesso (143/158, 91%). Todos
TP53
somáticas mutações no local nonsynonymous e da emenda foram chamados e validado usando VarScan 2 e seqüenciamento Sanger, respectivamente. Durante nove pacientes sem
TP53
somáticas mutações no local nonsynonymous e da emenda, foi realizada ainda seqüenciamento Sanger para todos os dez
TP53
codificação exons porque falso negativo pode ser esperado devido à baixa profundidade existente lê . Detectamos uma deleção frame-deslocamento no exão 3 para S022 (Tabela S3). SNVS somáticas e indels foram anotados para 1.405 em 1.159 genes.
TP53
foi o mais frequentemente mutado (76%, 26/34) (Figura 1A), no entanto, a frequência de mutação foi menor do que relatórios anteriores [5], [27]. Havia 24 distinta e diversificada
TP53
mutações (Tabela S4). Dois pacientes (S066 e S271) compartilhou a mesma variante missense (R273H) e os outros dois pacientes (S009 e S017) compartilhou a mesma variante absurdo (R196 *). Dos 22
TP53
variantes restantes, cinco foram eliminações frame-shift (A86fs para S020, P27fs para S022, F113fs para S119, S241fs para S006 e E286fs para S118), um era uma variante absurdo (Q52 * para S015), dois eram variantes de processamento de sites (Y126splice para S188 e S261splice para S008), e 14 foram missense restante (Tabela S4). FIS para os 15
TP53
variantes missense foi 2.0 de acordo com MutationAssessor 2 [14] análise e foram designados como deletéria (Tabela S4)
(A) paisagem mutacional somática de 34 pacientes. com HGSOC. Mutações somáticas identificados em mais do que ou igual a três pacientes são exibidos. Os pacientes com mutações do mesmo gene são mostrados em vermelho. paisagem (B) Cópia número de alteração de 30 pacientes com HGSOC. número de cópias alterações (NC) são indicados como segue: CN = 0, azul escuro; CN = 1, azul claro; CN = 3, rosa; e CN ≧ 4, vermelho). linha azul na pista de Supressão e linha vermelha na frequência número show de cópia alteração faixa de amplificação. linhas cinzentas nas faixas de exclusão e amplificação mostram os exatos valores de p -log transformada de Fisher teste de 0,0005.
O segundo genes mais frequentemente mutados foram
BCLAF1
,
CLCNKA
, e
MAGEC1
(29%, 10/34 para cada gene). De acordo com a FIS determinada usando MutationAssessor 2, todas as mutações, exceto K911fs de
BCLAF1
foram avaliados como benigno e foram consideradas mutações de passageiros. Noventa e dois por cento (1,063 /1,159) dos genes foram mutados em um paciente. Para explorar ainda mais genes de cancro do controlador candidatos mutados em pelo menos dois pacientes, OncodriveFM foi aplicado tal como descrito na secção Materiais e Métodos. Só
TP53
foi detectado como um gene controlador do cancro com elevada acumulação de mutações deletérias na HGSOC nossas amostras (dados não mostrados).
CNV perfil para as amostras 30 de HGSOC 34 é mostrado na figura 1B e ficheiro S1. Os números de cópias do genoma de 30 amostras HGSOC foram alterados. ParseCNV identificados nove repetidamente excluída CNVRs (1p36.11, 4q24, 5q13.1, 5q13.2, 6q22.33-23.1, 15q24.2-24.3, 17q12, 18q21.31 e 22q12.3) e quatro amplificado CNVRs (1p34 0,1-33, 3q27.2, 6p24.2, e 10p12.31-12.2) com genes identificados, respectivamente (Tabelas S5 e S6).
Exclusão de pacientes com deficiência via p53 de nonmutated TP53 HGSOC
O
TP53
frequência de mutação foi significativamente menor nas amostras em comparação com os relatados em estudos anteriores como segue: 26/34 vs. 301/316; valor do teste p exato de Fisher de 0,0060 [5] e 26/34 vs. 118/126; valor do teste p exato de Fisher de 0,0069 [27]. Entre as oito amostras com nonmutated
TP53
(Figura 2A), análise de CNV mostrou heterozigotos perda de número de cópias de
TP53 Compra de amostra S004 (Figura 2B). MDM2 é uma ligase proteína ubiquitina E3 que tem como alvo p53 para a degradação proteossómica e é considerado um efector negativo do p53 [28]. Existe uma associação entre a amplificação do
MDM2
e perda da função p53 em certos tumores [27]. Para as oito amostras com intacta
TP53
, nenhum
foi observada MDM2
amplificação do número de cópias (Figura 2A). Para investigar se um mecanismo alternativo é responsável por disfunção p53, foi avaliada uma lista de genes alvo p53 direta (Tabela S7) obtidos a partir do banco de dados Caminho Interaction (PID) [29]. Identificamos um
IRF5
(fator de regulação 5 Interferon) mutação de recomposição (W181splice) de amostra S018. No geral, foram identificados seis pacientes intactos p53 via dos oito pacientes com HGSOC com nonmutated
TP53
(Figura 2A). Nós atribuído seis pacientes para ST1 e os restantes para ST2.
(A) Resumo de pacientes com
TP53
mutações são mostradas na cor rosa no
TP53
trilha _mut.
TP53
número de cópias heterozigotos supressões são mostrados em azul no
TP53
_Del pista.
MDM2
amplificação do número de cópias é mostrado em vermelho no
MDM2
trilha _amp. Mutações em genes que são alvos directos de p53 são apresentados na verde na faixa p53_Target_mut. (B) Dot representação das razões log R (LRR) de Chr17 para amostra S004. Os pontos azuis indicam valores LRR. A posição de linha de LRR = 0 é indicada como 0 à direita de cada gráfico.
TP53
(17p13.1) é indicado pelo asterisco azul na linha vertical.
alterações genômicas em ST1 e ST2
Nós não detectar mutações em genes específicos para o tipo seroso de baixo grau, tais como
BRAF
,
CTNNB1
,
KRAS
, e
PIK3CA
[27], entre os 1.159 genes mutados nas amostras HGSOC 34 (dados não mostrados).
Para caracterizar diferenças de alterações genómicas entre ST1 e ST2, comparou-se o número de mutações de splice e local nonsynonymous somáticas e o número de mutações somáticas foi ST1 significativamente menor em comparação com ST2 (Wilcoxon rank sum valor do teste p de 0,00070) (Figura 3A).
(a) comparação do número de mutações no local nonsynonymous e da emenda somáticas. (B) Comparação do número de segmentos de CNV (painel superior) e os perfis de CNV (painel de baixo) sobre os cromossomas 17 e 12 entre ST1 e ST2. alterações no número de cópias são os seguintes: CN = 0, azul escuro; CN = 1, azul claro; CN = 3, rosa; e CN ≧ 4, vermelho). ST1 é delimitada pelo retângulo verde. (C) purezas tumoral de ST1 e ST2.
Além disso, comparou-ST1 e ST2 no que diz respeito aos números de segmentos de CNV identificados por PennCNV [17] em cada cromossoma autossómica (Tabela S8). Os resultados do teste de Wilcoxon rank sum e correcção de testes múltiplos de 22 cromossomos autossômicos de acordo com a taxa de descoberta de falsas (FDR) [30] mostraram significativamente menos segmentos CNV nos cromossomos 17 e 12 (valor q FDR de 0,040 e 0,047, respectivamente) para ST1 (Figura 3B). Estes resultados indicam que ST1 manteve o cariótipo normal e ST2 abrigou alterações no número de cópias do genoma particularmente enriquecido em cromossomos 17 e 12 (Figura 3B).
Para excluir a possibilidade de que o baixo número de mutações e alguns segmentos da CNV de ST1 foram causa de um elevado grau de contaminação com células normais, a pureza do tumor foi avaliada tal como descrito na secção Materiais e Métodos. As purezas médios dos tumores eram 79% e 73% para ST1 e ST2, respectivamente, e não houve diferença significativa na pureza do tumor entre os subtipos (Wilcoxon Rank Sum test valor p de 0,48) (Figura 3C e Tabela S9).
análise de expressão gênica para caracterizar funcionalmente ST1 e ST2
Os perfis de expressão gênica de ST1 e ST2 foram determinados utilizando um microarray mRNA [7], [8]. Oitenta e nove sondas que representam 70 genes revelaram diferenças nos níveis de expressão entre ST1 e ST2 a um FDR (BH) de 0,1 (Tabelas S10 e S11). Os níveis de 33 e 37 genes de expressão foram maiores (Tabela S10) e inferior (Tabela S11), respectivamente, para ST1 comparado com o ST2. Os 70 genes mostraram expressões relativamente homogêneos e heterogêneos em ST1 e ST2, respectivamente (Figura 4)
Setenta genes (89 sondas) que apresentam diferenças no FDR (BH) de . 0.1 são exibidos. ST1 é delimitada pelo retângulo verde. High and Low indicam níveis de ST1 expressão comparação com ST2.
Para avaliar as consequências biológicas e funcionais da expressão destes 70 genes, GO análise foi aplicada usando DAVID. Trinta e cinco genes foram classificados em 18 grupos divida termos GO semelhantes (Tabela S12). Dois dos 18 grupos GO (mitose e helicase do ADN) mostrou o enriquecimento significativo de genes (pontuação Enriquecimento de 1,3) (Figura 5 e Tabela S12).
Nek1
e
NEK9
no grupo mitose foram regulada e
ASPM
,
BIRC5,
CDCA2
, e
SKA3
foram reprimidos em ST1 comparada com a ST2.
BLM
,
PIF1
, e
RecQL4
, que codificam helicases de ADN, foram expressos em níveis relativamente baixos em ST1. As diferenças na expressão destes genes mitose e helicase DNA foram avaliados usando o teste de Kolmogorov-Smirnov, teste F, e
t
-teste com R versão 3.0.2 (Figura 6 e Tabela S13).
vista Heat-mapa de grupos (GO) ontologia gene. Dois grupos GO (mitose e helicase DNA) com enriquecimento gene significativa são indicados como grupos GO 1 e 2, respectivamente. ST1 é delimitada pelo retângulo verde.
enxame e caixa de abelha parcelas exibir o padrão dos pacientes ST1 e ST2 expressão do gene. eixo Y indica sinais de expressão de genes transformados normalizados por GeneSpring. Os asteriscos (*) ou sinais de adição (+) indicam
t
-test valores p como se segue: * p 0,05, ** p 0,01, *** e
(+++) p 0,001.
Discussão
As análises de mutações somáticas de HGSOC mostrou enriquecimento do
TP53
mutações (Figura 1A). A análise revelou um perfil de CNV alterada do número de cópias do genoma (Figura 1B). Estes resultados são consistentes com os de um estudo anterior [5]. No entanto, foi detectada uma diferença significativa na frequência de
TP53
mutações em comparação com o relatado em relatórios anteriores [5], [27]. Especificamente, oito amostras HGSOC não abrigava
TP53
mutações, e mutação de um gene alvo p53
IRF5
foi identificada em uma amostra. Além disso, um tinha
TP53
copiar o número de eliminação. Tomados em conjunto, nós atribuído seis amostras HGSOC como ST1 e os restantes 28 amostras como ST2.
Todos os pacientes com HGSOC neste estudo foram japonês, enquanto os pacientes nos estudos anteriores [5], [27] estavam principalmente vêm de populações Europeia-descendentes. A discrepância de
TP53
frequências de mutação podem ser provenientes de diferenças populacionais como observada no caso de receptor do factor de crescimento epidérmico (
EGFR)
mutações para os cancros do pulmão de células não pequenas, [31], [ ,,,0],32].
EGFR
taxas de mutação foram os seguintes: 11% e 32% em pacientes da Europa Ocidental e do Leste Asiático, respectivamente [31], e 2% e 26% dos pacientes nos EUA e no Japão, respectivamente [32] . Os baixos números de pacientes no estudo atual, em comparação com os dados TCGA definidos [5] pode não o suficiente para fornecer conclusão sólida do
TP53
frequência de mutação. Evidentemente, são necessários estudo muito maior escala incluindo pacientes asiáticos japoneses e outros com HGSOC. A outra possibilidade é a existência de pequena fração do
TP53
mutado células tumorais devido à heterogeneidade do tumor em
TP53
pacientes nonmutated. É amplamente aceito que as mutações motorista somáticos, tais como mutações do
TP53
ocorrem em um evento precoce do câncer, em seguida, devem ser observados relativamente alta frequência da mutação. No estudo atual, nós fato observado pelo menos 20% das frequências variantes tumorais para
TP53
. Portanto, presumivelmente, não têm vista para mutações motorista do
TP53
pelo sequenciamento exome (Figura 1).
O baixo número de mutações somáticas e segmentos da CNV observados em ST1 provavelmente refletem uma p53 funcionalmente intacta via. ST2 foi enriquecida para
TP53
mutações, e perfis no número de cópias do genoma foram semelhantes aos dos tumores de tipo II. Em contraste,
TP53
foi nonmutated em ST1 e exibiu um cariótipo normal semelhante ao do Tipo I, tal como proposto tumores em um comentário anterior [2]. No entanto, não se detectou mutações em genes que codificam os componentes da via de sinalização RAS no ST1 (dados não mostrados). No maior conjunto de dados do TCGA [5], 15 de 316 amostras de pacientes com HGSOC abrigava nonmutated
TP53
. Quando procurou
TP53
eliminações,
MDM2
amplificação, ou mutações de genes-alvo p53 nas 15 amostras, apenas um (TCGA-25-1328) foi classificada como ST1 (Figura S1) . agrupamento hierárquico usando 45 sobrepostas genes entre os 70 genes diferencialmente expressos atribuídos TCGA-25-1328 para ST1 (Figura S1, em baixo). Estes resultados implicam que ST1 é um novo subtipo HGSOC com base em perfis de mutação e da CNV.
Para caracterizar ainda mais as características funcionais do ST1 e ST2, comparou-se os seus perfis de expressão de gene (Figura 4). Utilizando um limite de significância [FDR (BH) 0,1], foram identificados 70 genes que foram expressos de forma homogénea no microarray ST1 e heterogeneamente expressas no microarray ST2 (Figura 4). A expressão do gene heterogéneo de ST2 pode indicar diversificação dos subtipos moleculares como eventos secundários, como proposto na revisão já citado [2], e expressão gênica homogênea de ST1 pode refletir um evento precoce da oncogênese antes de ocorrer instabilidade cromatina.
análise GO identificados 18 grupos GO que compartilham termos biológicos altamente semelhantes, e dois grupos foram significativamente enriquecido para genes envolvidos na mitose e aqueles que codificam helicases de ADN (Figuras 5 e 6). Defeitos na mitose levar a números de cromossomos anormais que está associado com a oncogênese [33]. Dois genes que codificam as cinases mitóticas Nek1 e NEK9 foram altamente expresso em ST1, e supra-regulação destas cinases está relacionado com a estabilidade genómica e tumorigénese [34] – [37]. Além disso, outros genes de mitose (
ASPM
,
BIRC5
,
CDCA2
, e
SKA3
) foram altamente expressa em ST2, e activação aberrante da expressão destes genes está associada com a oncogénese [5], [38] – [42]
helicases de ADN manter a estabilidade do genoma através da reparação de ADN, a recombinação, e replicação.. As helicases de ADN, BML e RecQL4, são inativados em câncer doenças genéticas propensas como Bloom e síndromes Rothmund-Thomson [43], [44]. A sobre-regulação da expressão do ADN da helicase normalmente ocorre em vários tipos de cancro (por exemplo, hematopoiético, da próstata, e hepatocelulares) [43] – [48]. elevada expressão dos genes DNA helicase
BLM,
PIF1
, e
RecQL4
que é geralmente observada em cancros podem explicar uma função de recuperação da instabilidade cromatina em ST2. Em contraste, a diminuição da expressão de genes que codificam as helicases de ADN que caracterizaram ST1 indica que a instabilidade da cromatina não ocorre no ST1. Novos estudos são necessários para esclarecer a relação entre a expressão destes genes e patogênese da HGSOC.
Não detectamos diferenças na sobrevida global ou livre de progressão dos pacientes classificados como quer ST1 ou ST2 (Figura S2). Todas as amostras foram diagnosticados como câncer de alto grau por patologistas, e as amostras classificadas como ST1 foram examinados retrospectivamente; no entanto, eles não tinham características patológicas únicas. ST1 foi caracterizada por uma via de p53 intacta; no entanto, não houve diferenças nos achados patológicos dos pacientes ou consequências clínicas. Estes resultados sugerem a presença de processos biológicos envolvidos não identificados no fenótipo ST1, indicando que uma terapia mais eficaz tem de ser desenvolvida para estes pacientes.
Em resumo, descrevemos a identificação de um subtipo intacta via p53 novo em japonês pacientes com HGSOC. Nossas descobertas prometem melhorar a nossa compreensão dos mecanismos moleculares de oncogênese e deve permitir o desenvolvimento de estratégias terapêuticas que visam nonmutated
TP53
em pacientes com HGSOC.
Informações de Apoio
Figura S1.
ST1 nos dados TCGA. (Painel superior) Resumo de mutações para
TP53 Comprar e da via p53 genes para 15
TP53
pacientes nonmutated com HGSOC nos dados TCGA.
TP53
deleção homozigótica é mostrado em azul e heterozigotos escuras supressões no número de cópias são mostrados em azul claro no
TP53
_Del pista.
MDM2
amplificação do número de cópias é mostrado em vermelho no
MDM2
trilha _amp. Mutações em genes que são alvos directos de p53 são apresentados na verde na faixa p53_Target_mut. (Painel inferior) de agrupamento hierárquico de TCGA-25-1328 e 33 HGSOC usando 45 genes que se sobrepõem entre os 70 genes diferencialmente expressos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0114491.s001
(PDF)
Figura S2. análise
Survival. (Painel esquerdo) curvas de sobrevida global para ST1 e ST2. (Painel direito) curvas de sobrevida livre de progressão para ST1 e ST2. Estas curvas de sobrevivência foram retratados pelo método de Kaplan-Meier. valores de p correspondem à prova Logrank comparando as curvas de sobrevivência
doi:. 10.1371 /journal.pone.0114491.s002
(PDF)
Tabela S1.
dados clínicos. pT- e FIGO-estágios. Dois subtipos (ST1 e ST2) são mostrados na coluna subtipo
doi:. 10.1371 /journal.pone.0114491.s003
(XLSX)
Tabela S2.
profundidade e abrangência do sequenciamento exome. Profundidade e cobertura foram calculadas usando o módulo DepthOfCoverage de GATK
doi:. 10.1371 /journal.pone.0114491.s004
(XLS)
Tabela S3.
profundidade de codificação de exons de
TP53
profundidade de dez exons codificantes do
TP53
(NM_001126112.2) foram calculados utilizando SAMtools
doi:.. 10.1371 /journal.pone. 0114491.s005
(XLSX)
Tabela S4.
Somatic
TP53
mutações. impactos funcionais de variantes de um único nucleotídeo missense que foram avaliadas usando MutationAssessor 2 são mostrados na coluna FIS
doi:. 10.1371 /journal.pone.0114491.s006
(XLS)
Tabela S5. número
Copiar regiões excluídas. regiões deletadas número de cópias recorrente são mostrados na coluna CNVR (hg18). coluna Gene mostra genes que estão localizados nestes CNVRs
doi:. 10.1371 /journal.pone.0114491.s007
(PDF)
Tabela S6. número
Copiar regiões amplificado. regiões amplificadas número de cópias recorrente são mostrados na coluna CNVR (hg18). coluna Gene mostra genes que estão localizados nestes CNVRs
doi:. 10.1371 /journal.pone.0114491.s008
(PDF)
Tabela S7. : Lista de p53 genes alvos diretos. Uma lista de p53 genes alvo diretos foram obtidos a partir da base de dados Caminho Interaction (PID)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0114491.s009
(XLSX)
Tabela S8. segmentos
CNV.