Abstract

fundo e Aim

hipermetilação aberrante de genes relacionados ao câncer surgiu como uma estratégia promissora para o desenvolvimento de biomarcadores diagnósticos, prognósticos e preditivos em câncer humano, incluindo o cancro colorectal ( CRC). O objetivo deste estudo foi realizar uma análise sistemática e abrangente de um painel de genes específicos do CRC como potenciais biomarcadores diagnósticos, prognósticos e preditivos em um grande, CRC coorte de base populacional.

Pacientes e Métodos

Padrão de metilação dos genes

SEPT9, TWIST1, IGFBP3, GAS7, ALX4 e miR137

foi estudada por bissulfito quantitativa pyrosequencing em uma coorte de base populacional de 425 pacientes com CCR.

resultados

os níveis de metilação de todos os genes analisados ​​eram significativamente mais elevados em tecidos de tumor em comparação com a mucosa normal (p 0,0001); no entanto, foi observada com maior frequência hipermetilação associado a um cancro em

miR137

(86,7%) e

IGFBP3

(83%) em pacientes com CCR. a análise de metilação usando a combinação destes dois genes demonstraram maior precisão para a identificação de tumores do cólon (sensibilidade de 95,5% e a especificidade 90,5%). Os baixos níveis de

IGFBP3

metilação do promotor emergiu como um fator de risco independente para predizer pior sobrevida livre de doença em estágio II e III pacientes de CRC (HR = CI 0,49, 95%: 0,28-,85, p = 0,01). Os nossos resultados também sugerem que a fase II pacientes III CRC com altos níveis de

IGFBP3

metilação não beneficiam de quimioterapia à base de 5-FU adjuvante.

Conclusão

Ao analisar um grande, de base populacional CRC coorte, demonstrar a importância clínica potencial da

miR137

e

IGFBP3

hipermetilação como biomarcadores de diagnóstico promissores no CRC. Nossos dados também revelaram que

IGFBP3 hiper

metilação pode servir como um biomarcador prognóstico e preditivo independente em estágios II e III pacientes CRC

Citation:. Perez-Carbonell L, Balaguer F, Toiyama Y, Egoavil C, Rojas E, Guarinos C, et ai. (2014)

IGFBP3

metilação é um diagnóstico e previsão de Biomarcadores Novel no câncer colorretal. PLoS ONE 9 (8): e104285. doi: 10.1371 /journal.pone.0104285

editor: Hassan Ashktorab, Howard University, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de abril de 2014; Aceito: 07 de julho de 2014; Publicação: 15 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Perez-Carbonell et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. O presente trabalho foi apoiado pela concessão R01 CA72851 e CA181572 do National Cancer Institute, National Institutes of Health e os fundos do Instituto de Investigação Baylor. Lucia Perez-Carbonell é um receptor de um 2012 bolsa de pós-doutoramento da Fundação Alfonso Martín Escudero. Francesc Balaguer é um beneficiário de uma doação do Instituto de Salud Carlos III (PI10 /00384). CIBEREHD é financiado pelo Instituto de Salud Carlos III. Carla Guarinos é um beneficiário de uma bolsa da Generalitat Valenciana (Vali + D ACIF /2010/018). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Ajay Goel é um PLOS ONE Editorial Board Member. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas e critérios editoriais.

Introdução

O câncer colorretal (CRC) é um dos cancros mais comuns nos países ocidentais, e é a segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer em adultos [1]. Acumulando as evidências indicam que as alterações epigenética desempenham um papel essencial na patogénese da CRC. metilação anormal do DNA representa uma da alteração epigenética mais estudado, e é bem entendido que os genes supressores de tumores são frequentemente silenciado por metilação das ilhas de CpG que normalmente residem nas regiões 5 ‘de cerca de metade de todos os genes humanos [2], [3 ], [4]. O silenciamento transcricional de genes supressores de tumores tem emergido como um passo importante no processo passo a passo de carcinogénese colorectal. alterações Epigenetic, particularmente a hipermetilação do ADN, pode ser utilizado para a detecção precoce de lesões pré-malignas, incluindo pólipos adenomatosos do cólon, e está presente nos tecidos não-neoplásicas adjacentes aos pólipos adenomatosos e cancros no cólon [5], [6] . Além de seu uso como biomarcadores de diagnóstico, mudanças epigenéticas mostram a promessa como determinantes do prognóstico do câncer, bem como biomarcadores para resposta a quimioterapias específicas [7], [8].

Em CRC, abordagens sistemáticas do genoma identificaram vários genes que mostram hipermetilação promotor específico de tumores que podem potencialmente ser desenvolvido em biomarcadores diagnósticos, prognósticos e preditivos clinicamente relevantes. No contexto da CRC, vários desses biomarcadores têm recentemente sido descritos como biomarcadores de diagnóstico potencialmente promissoras, incluindo:

SEPT9

(Septin 9), um membro da família de septina envolvidos na citocinese e controlo do ciclo celular [9], [10], [11];

ALX4

(proteína homeobox aristaless-like 4), um fator de transcrição envolvido no crânio e desenvolvimento dos membros [12], [13];

TWIST1

(torção homólogo 1), um fator de transcrição anti-apoptótica e pró-metastático [14], [15];

IGFBP3

, um membro da família do fator de crescimento proteína de ligação semelhante à insulina (proteína 3 de ligação do factor crescido Insulin-like) [16];

GAS7

(crescimento específico prisão-7), que desempenha um papel putativo no desenvolvimento neuronal [17], [18]; e

miR137

, um microRNA não codificadora que é incorporado numa ilha CpG [17], [19], [20], [21]. No entanto, até à data, nenhum destes marcadores de metilação tenham sido submetidos a uma validação sistemática em um grande grupo de pacientes de CRC para determinar o seu potencial como biomarcadores de diagnóstico, prognóstico ou preditivos clinicamente úteis. Por esta razão, nós destinada a explorar o valor diagnóstico, prognóstico e preditivo de

SEPT9, TWIST1, ALX4, IGFBP3, GAS7

, e

miR137

hipermetilação do promotor em um grande, bem caracterizada, -base populacional CRC coorte. Além disso, nós examinamos as associações entre o estado de metilação de marcadores individuais e a sua combinação com as características clinicopatológicas nestes CRCs primárias, e para o primeiro relatório de tempo que

IGFBP3

hipermetilação é um biomarcador de diagnóstico e preditivo promissores em pacientes de CRC.

material e Métodos

os pacientes

Este estudo incluiu 425 pacientes com CCR que foram inscritos como parte do projeto Epicolon-I, que é um teste de base populacional da CRC como descrito anteriormente [22], [23], [24]. Uma vez que este estudo teve como objetivo determinar o potencial de prognóstico e preditivo de biomarcadores de metilação, as amostras de pacientes incluídos no estudo foram selecionados aleatoriamente a partir de uma coorte descrito anteriormente de pacientes para os quais estavam disponíveis dados de acompanhamento [7], [25], [26 ]. As características demográficas, clínicas, e relacionada com o tumor de probandos, assim como uma história familiar detalhada, foram obtidos utilizando um questionário previamente estabelecida [22]. características clínicas e moleculares de pacientes incluídos nesses estudos estão descritos na Tabela S1. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética de todos os hospitais participantes na coorte EPICOLON (Hospital 12 de Octubre, Madrid; Clinic Hospital, Barcelona, ​​Hospital Clínico Universitario, Zaragoza; Hospital Cristal-Pinor, Complexo Hospitalar de Ourense; Parc de Salut Mar, Barcelona; Hospital Donostia, CIBERehd, Universidade do País Basco, San Sebastian; Hospital Geral Universitário de Alicante; Hospital Geral de Granollers; Hospital general de Vic; Hospital Geral Universitário de Guadalajara e Fundación para la Formación e Investigación Sanitarias Murcia; Hospital Geral Universitário de Valencia) e consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente. O estado de metilação do promotor de seis genes (

SEPT9, TWIST1, IGFBP3, GAS7, ALX4

e

miR-137

) foi analisada em todos os 425 pacientes de CRC, bem como na mucosa de cólon normal de 21 indivíduos saudáveis ​​com uma colonoscopia normal.

extração de DNA e modificação bisulfite

DNA genômico foi extraído de tecido tumoral embebido em parafina (FFPE) amostras no estudo Epicolon-I. Sob a supervisão do patologista estudo, cortes de tecido foram cuidadosamente examinadas, regiões enriquecida-tumorais identificadas e cuidadosamente dissecados para extração de DNA. A seguir à remoção de parafina por xileno, o ADN foi isolado utilizando kits QIAamp DNA Mini, de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen, Valencia, CA). O ADN genómico resultante foi modificado com bissulfito de sódio-usando o kit EZ metilação ouro (Zymo Research, Orange, CA).

análise de DNA Metilação

pyrosequencing bissulfito foi realizada por análise de metilação quantitativa como anteriormente descrito (Figura S1) [7], [25], [26]. Os iniciadores utilizados foram concebidos utilizando o software de desenho PyroMark 1,0, e os ensaios foram executados em pyrosequencing o ADN modificado com bissulfito (Tabela S2 e S1 Informação). A média percentual de metilação de todos os locais de CpG em cada ensaio foi calculada para cada gene /marcador. Metilação valores de corte foram determinados para cada marcador com base nos níveis médios de metilação observadas na mucosa do cólon normal a partir de indivíduos saudáveis ​​+2 desvios-padrão. análise de metilação de confirmação adicional para

IGFBP3

também foi realizada por um ensaio de MSP quantitativa (qMSP) para o promotor /exon1 ilha CpG utilizando os primers e as condições de PCR como descrito anteriormente [27].

CpG ilha Methylator Fenótipo (CIMP) e microssatélites Instabilidade (MSI) de status

o status CIMP das amostras de CRC do Epicolon-I coorte foi previamente determinado utilizando pyrosequencing bisulfite dos marcadores CIMP

CACNAG1

,

SOCS1

,

RUNX3

,

NEUROG1

, e

MLH1

, conforme relatado anteriormente [7]. A CRC foi considerado CIMP-positivo se pelo menos 3/5 promotores foram metilado [7]. instabilidade microssatélite teste (MSI) foi realizada utilizando BAT26 e NR24 marcadores quasimonomorphic como previamente descrito [28]. Os tumores foram classificados como MSI-positivo quando qualquer um dos marcadores foi mutado, e foram consideradas microssatélites estável (MSS) quando nenhum marcador demonstrou qualquer evidência de instabilidade genética.

BRAF

mutação

Presença de o

BRAF V600E

mutação em amostras de CRC foi detectado utilizando sondas TaqMan e um sistema ABI Prism 7500 sequência de detecção (Applied Biosystems, Foster City, CA), com a discriminação alélica, como previamente descrito [29].

Análise

estatística

As variáveis ​​contínuas são apresentados como média + desvio padrão (SD), enquanto as variáveis ​​categóricas são citados como freqüência ou porcentagens. As diferenças estatísticas das características basais entre os grupos foram analisados ​​por meio do χ

2 teste para dados categóricos, seguido pela aplicação de correção de Yates eo teste de Mann-Whitney para a análise quantitativa dos dados. Os resultados preliminares deste estudo foram a sobrevida global (OS) e sobrevida livre de doença (DFS). As análises de ambos os resultados foram realizadas para a totalidade do grupo de CRC, e, separadamente, no subgrupo de pacientes fase II e III de CRC, a fim de avaliar especificamente o efeito do estado de metilação do prognóstico e a resposta à quimioterapia adjuvante. OS foi definido como o tempo desde a admissão à morte, e DFS foi definido como o tempo desde a admissão à morte de qualquer causa ou a primeira recaída. Os dados sobre OS e DFS foram censurados a 1100 dias a partir da data do diagnóstico de câncer. tumores CRC foram categorizados em grupos de alto e baixo estado de metilação usando Receiver Operating curva Características análise (ROC). A análise de Kaplan-Meier foi realizada para estimar as distribuições de DFS e o sistema operativo no estágio II e III, os doentes. distribuições de sobrevivência foram comparadas pelo teste de log rank. A análise multivariada para a determinação de taxas de risco para a morte ou recidiva tumoral foi realizada utilizando diversas variáveis, incluindo, metástase linfática, estágio TNM, estado MMR, grau de diferenciação do tumor, idade e quimioterapia adjuvante. Outras análises foram realizadas utilizando riscos proporcionais de Cox de regressão de uma forma passo a passo para testar o efeito do estado de metilação de um gene dada /marcador com o DFS e a sua interacção com a quimioterapia. taxas de risco e intervalo de confiança de 95% (IC 95%) para a morte foram calculados utilizando a modelagem de sobrevivência Cox. Todos os valores p são reportados de dois lados, e valores de p 0,05 foram considerados significativos. Todos os cálculos foram realizados com o programa SPSS 10.0 ou 4.0 software estatístico GraphPad Prism.

Resultados

Em nossa série de 425 casos de CRC, a média ± SD de idade dos pacientes foi de 70,4 + -11 anos, e havia mais pacientes do sexo masculino do que do sexo feminino (252/425; 60,3%). Dos 425 tumores, 117 (27,9%) foram localizados no cólon proximal, 151 (36,2%) estavam no cólon distai, e 150 (35,9%) estavam localizadas no recto. Aproximadamente 12,8% dos casos eram estágio I, 33,7% estágio II, 39,7% estágio III, e 13,7% estágio IV tumores. Descobrimos que 35/425 (8,2%) CRCs foram MSI, 90/303 (29,7%) foram CIMP-positivo, e 21/191 (10,9%), continham uma mutação V600E somática no

gene BRAF

. Como esperado, o fenótipo CIMP-positivo foi mais frequentemente associada a MSI ea presença de

BRAF V600E

mutação (22,3% vs. 2,3%, p 0,0001 para o fenótipo MSI, e 31% vs. 1,5% , p 0,0001 para o

BRAF V600E

mutação)

Valor diagnóstico de marcadores de metilação no CRC

os níveis de metilação médios para cada gene em tecidos CRC primários foram:. 23.8 % para

SEPT9

, 50,5% para o

TWIST1

, 44,9% para o

IGFBP3

, 50,2% para o

GAS7

, 36,5% para o

ALX4

, e 35,3% para o

miR137

. Como mostrado na Figura 1, os níveis de metilação de cada gene foram significativamente maiores no CRC contra mucosa normal a partir de indivíduos saudáveis ​​(

P

0,0001 a

P

0,0005 para todas as comparações). Estes resultados demonstram a especificidade para o cancro-hipermetilação destes genes e estabelecer uma base racional para a sua exploração potencial como biomarcadores de diagnóstico para CRC, considerando-se que todos os 6 marcadores hipermetilação demonstrado em todas as fases de CRCs (Figura 2).

Bissulfito resultados pyrosequencing para metilação do

SEPT9

(A),

TWIST1

(B),

IGFBP3

(C),

ALX4

(D),

GAS7

(e) e genes

miR137

(F) comparando mucosa normal dos controles saudáveis ​​(N-N) e tumores primários de pacientes com CCR.

pyrosequencing Bissulfito resultados de metilação do

SEPT9

(a),

TWIST1

(b),

IGFBP3

(c),

alx4

(d),

gas7

(e) e

mir137

(f) comparando mucosa normal de pacientes saudáveis ​​(nN) e tumores primários de pacientes com CCR de todas as fases TNM I-IV. n (número de indivíduos); mediana de metilação (%).

A fim de avaliar o desempenho de cada marcador de metilação individualmente para diagnóstico CRC, os resultados de metilação foram analisadas como uma variável categórica. Assim, cada gene foi classificada como metilado quando os níveis médios de metilação foram superiores a 7,1% para o

SEPT9

, 35,7% para o

TWIST

, 27,5% para o

IGFBP3

, 53,5% para

GAS7

, 28,5% para o

ALX4

, e 11,9% para o

miR137

. Com base nestas análises, os marcadores mais frequentemente metilado em tecidos CRC foram o

miR-137

gene (302/344, 87,7%), seguido de

IGFBP3

(289/348, 83% ),

TWIST1

(269/356, 75,6%),

SEPT9

(244/346, 70,5%),

ALX4

(214/350, 61,1%), e

GAS7

(164/378, 43,3%). Para ponderar se uma combinação de marcadores iria aumentar ainda mais a precisão do diagnóstico do ensaio, foram analisadas painéis combinação de marcador e descobriu que o

miR137

+

IGFBP3

combinação rendeu uma precisão diagnóstica de 86% , seguido de

TWIST1

+

IGFBP3

(82,7%) e

TWIST1

+

miR137

(78,5%). Além disso, verificou-se que a combinação de

miR137

+

IGFBP3

+ TWIST1 metilação teve a maior precisão do diagnóstico, 92%, como mostra a Tabela 1.

características clínico-patológicas associadas com biomarcadores de metilação

a seguir, investigou a relação entre várias características clínicas e moleculares e suas associações com metilação aberrante de todas as seis genes analisados ​​neste estudo. As variáveis ​​clínico-patológicas incluíram idade, sexo, estadiamento TNM e localização do tumor, e os fatores moleculares incluiu o status MMR, CIMP fenótipo eo

estado mutacional BRAF

. A localização do tumor e as fases TNM não se associou com o estado de metilação de qualquer um dos marcadores de genes. Curiosamente,

SEPT9

metilação foi significativamente associado ao sexo masculino (p 0,05; Tabela S3). Quando a metilação foi analisada como uma variável contínua, observou-se uma tendência para uma maior metilação do

TWIST1

,

IGFBP3, ALX4

, e

GAS7

(p 0,05) e mais velhos pacientes com CRC; no entanto, não encontramos uma correlação positiva entre o normal metilação mucosa do cólon nestes genes e idade em indivíduos saudáveis. (Figuras 3 4)

No que diz respeito às associações moleculares,

TWIST1

níveis de metilação foram maiores em comparação com o MSS MSI CRCs (51% versus 40,3%; p 0,05) (Tabela 2). Metilação de quatro genes,

ALX4, IGFBP3, GAS7

, e

miR137

, foi significativamente correlacionada com CIMP-positivos tumores (p 0,001). Além disso, como mostra a Tabela 2, CRCs com

ALX4

e

IGFBP3

metilação foram mais frequentemente associado com uma célula somática

BRAF V600E

mutação (13,5% vs. 1,8%, p 0,05 para

ALX4

, e 12,4% vs. 0%, p 0,05 para

IGBFP3

)

hipermetilação aberrante de genes e sua influência sobre. CRC paciente prognóstico

o acompanhamento médio para a série de 425 pacientes incluídos neste estudo foi de 1268 dias (3,4 anos, variando 0-2204 dias). No final do período de acompanhamento, 169 pacientes morreram (39,7%), ea mediana de seguimento para este grupo foi de 671 ± 513 dias (1,8 ± 1,4 anos). Informações sobre a causa da morte estava disponível em 99 pacientes; 67,7% (67/99) morreram devido a complicações de progressão tumoral, 18,2% (18/99) morreram devido a complicações da quimioterapia, e 14,1% (14/99) sucumbiu à morte por outras causas, incluindo complicações pós-operatórias. A recorrência do tumor foi observada em 116/370 pacientes (31,3%), com uma duração mediana de tempo de 644 ± 448 dias (1,7 ± 1,2 anos) pós-cirurgia.

Para determinar o significado prognóstico do estado de metilação de cada gene, todos os CRCs foram classificados em dois grupos com base em seus níveis de metilação (alta versus baixa), e da relação dose-resposta entre o grau de metilação e sobrevida livre de eventos foi examinado por análise da curva ROC. No geral, altos níveis de metilação do

GAS7

(valor de corte prognóstico = 52,62%; high-metilação: 43,3%, baixa-metilação: 56,7%; χ

2 p = 0,03) e

ALX4

genes (valor de corte prognóstico = 25,8%; de alta metilação: 67,1%, baixa de metilação: 32,9%; χ

2 p = 0,005) associada à má DFS em pacientes de CRC (dados não mostrando). Em contraste, os baixos níveis de

IGFBP3

metilação demonstraram uma associação com DFS significativamente piores de acordo com a análise não ajustada (valor de corte prognóstico = 53,1%; de alta metilação: 30,9%, baixa de metilação: 69,1%; χ

2 = 0,01; p Figuras 5A e B). Após a análise de regressão de Cox multivariada, onde foram analisadas múltiplas variáveis, apenas baixos níveis de

IGFBP3

metilação emergiu como um fator de risco independente para pobres DFS no estágio II e III pacientes de CRC (HR = 0,49, 95% CI: 0.28- 0,85, p 0,01). Além disso, o estado de metilação do

gene IGFBP3

foi o único fator de risco estatisticamente significante para a fase II CRC, após o ajuste para outros fatores prognósticos como idade, adjuvante 5-FU (5-fluorouracil) a quimioterapia ou o status MSI (HR = 0,28, 95% CI: 0,12-0,70, p = 0,006; Tabela 3)

(a) a sobrevivência livre de doença de pacientes com estágio II e III CRC, de acordo com

IGFBP3

estado de metilação (alta metilação, n = 73, (30,3%) de baixo metilação, n = 168, (69,7%). (b) a sobrevivência livre de doença de pacientes com doença em estágio II, de acordo com a

IGFBP3

metilação (alta metilação, n = 45, (32,4%);. baixa metilação, n = 94, (67,6%) (c) livre de doença sobrevida dos pacientes com estágio II e III da doença, na alta

IGFBP3

tumores metilação baseado em quimioterapia adjuvante (quimioterapia, n = 20, (22,5%);. sem quimioterapia, n = 69, (77,5%) (d) sobrevida livre de doença de pacientes com estágio II e III da doença, em baixa

IGFBP3

tumores de metilação de acordo com a quimioterapia adjuvante (Chemotherapyc n = 83, (52,7%); NO quimioterapia, n = 74, (47,2%).

hipermetilação gene aberrante e sua influência na sobrevida dos pacientes após o tratamento de quimioterapia

tratamento quimioterápico foi dado a 257/425 pacientes (60,5%), principalmente usando o 5-FU + leucovorin (236; 91,8% dos pacientes). Entre toda a coorte, 315 doentes (74,1%) apresentaram quer uma fase II ou III da doença, e 155 (49,2%) destes recebido quimioterapia adjuvante com 5-FU. Apenas 9 estágio II e III os pacientes receberam outros tratamentos quimioterápicos, e foram excluídos da análise posterior. Após um seguimento médio de 1221 dias (3,3 anos), 92 (31,2%) pacientes com estágio II e III mostrou recorrência do tumor, e até o final do período de acompanhamento, 101 (34,2%) pacientes desses grupos tinha morreu

a quimioterapia adjuvante proporcionou uma melhoria significativa na OS em estágios II e III pacientes CRC comparação com os doentes que não receberam quimioterapia (quimioterapia: 49,1%, não-quimioterapia:. 50,9%; χ

2 p = 0,0001). Essas diferenças de OS também estavam presentes na análise multivariada que controlou por idade, sexo, metástases em linfonodos, MMR, e CIMP estatuto fenótipo. (HR = 0,55 IC 95%: 0,36-0,85, p = 0,007)

Curiosamente, entre todos os 6 marcadores de metilação investigadas, apenas

IGFBP3

níveis de metilação foram preditivos de resposta à quimioterapia à base de 5-FU. De acordo com nossos resultados, os pacientes com baixa

IGFBP3

níveis de metilação teve mais OS (p = 0,0007) e DFS (p = 0,05) quando receberam quimioterapia. Por outro lado, em pacientes com alta

IGFBP3

metilação, quimioterapia adjuvante não melhorou OS (p = 0,4) ou DFS (p = 0,3; Figura 5C e D). Utilizando a análise de regressão de Cox multivariada (Tabela 4), em pacientes com baixa

IGFBP3

metilação, quimioterapia adjuvante previsto independentemente melhor OS (HR = 0,49, 95% CI: ,29-,80, p = 0,004); no entanto, não influenciam significativamente o DFS (p = 0,08). Por outro lado, o estado MMR foi a única variável que previu independentemente OS (p = 0,05) e DFS (p = 0,04) em pacientes com alta

IGFBP3

metilação (Tabela 4). No grupo de pacientes tratados com 5-FU quimioterapia adjuvante,

IGFBP3

estado de metilação não prever independentemente OS e DFS. Em contraste, DFS foi positivamente afetado pela

IGFBP3

estado de metilação em pacientes que não receberam quimioterapia adjuvante. (HR = CI 0,41, 95%: 0,18-,91, p = 0,02)

Discussão

nos últimos anos, uma série de promissores gene de metilação com base em biomarcadores de diagnóstico, incluindo

SEPT9, TWIST 1, IGFBP3, GAS7, ALX4

, e

miR137

têm sido propostos para a detecção precoce de neoplasia colorrectal. No entanto, a maioria desses marcadores têm sido confinados a rubricar estudos de descoberta de pequena escala, e não foram desenvolvidos na prática clínica, pois não têm sido sistematicamente validados em grandes grupos, independentes de pacientes com CCR. Tendo em conta esta lacuna no conhecimento, nós projetamos este estudo para confirmar o potencial diagnóstico desses biomarcadores, e verificar os seus valores prognósticos e preditivos no CRC. Além disso, estávamos interessados ​​em examinar as associações entre a hipermetilação aberrante destes genes e características clínico-patológicas através da análise de um grande bem caracterizada coorte, de base populacional de pacientes com CCR.

Com base em nossa análise de metilação quantitativa, todos seis genes interrogado preenchiam os critérios para potencial uso clínico como biomarcadores de diagnóstico de CRC. Estes critérios incluem: a) a metilação de cada gene ocorreu de um modo específico do tumor; b) os níveis de metilação de cada gene em tecidos neoplásicos foram significativamente maiores do que em mucosa de cólon normal; e c) nenhum dos genes mostrou um aumento dependente da idade na metilação do ADN na mucosa colónica normal, [30], [31]. níveis de metilação de cada gene permitiu classificar tecidos colorretais como normal ou neoplásica. Entre todos os marcadores investigados,

IGFBP3

e

miR137

níveis de metilação apresentou a maior acurácia diagnóstica como marcadores de genes individuais para a identificação dos CRCs primários (83% e 78,3%, respectivamente). Esta precisão do diagnóstico foi melhorada através da combinação do estado de metilação de dois marcadores de genes; Em particular, o estado de metilação de

IGFBP3 + TWIST1

ou

IGFBP3

+

miR137

tiveram os maiores valores de precisão de 86% e 82,7%, respectivamente, com os valores de sensibilidade e especificidade 80%.

Nós investigamos as características moleculares associados com os níveis de metilação tumor destes genes. Este foi de particular interesse como a classificação molecular baseado em MSI e estado CIMP tornou-se cada vez mais importante [32] para o seu prognóstico [33], [34], [35] e o papel preditivo em pacientes com CCR [7], [34], [ ,,,0],36]. Neste estudo, quatro dos seis genes foram associados positivamente com o fenótipo CIMP (

ALX4, IGFBP3, GAS7

, e

miR137

). Além disso, uma correlação positiva entre

BRAF V600E

mutação e metilação do

ALX4

e

IGFBP3

genes foi associada com CIMP de alta no CRC [37], [38] . Como esperado, a metilação do

ALX4

e

IGFBP3

genes foi associada com a presença do

mutação do gene BRAF

.

TWIST1

níveis de metilação foram maiores nos pacientes com tumores MMR-proficientes em comparação com tumores MSI; no entanto, em nossa coorte, apenas uma pequena proporção dos CRCs foram MMR deficiente (5%), e as correlações entre status e metilação marcadores MMR pode ter sido perdida quando se analisa o grupo como um todo.

No estágio pacientes II e III CRC que foram submetidos a ressecção potencialmente curativa, o prognóstico depende de recorrência da doença, que está principalmente associada com metástases à distância. Além disso, o benefício da quimioterapia adjuvante, especialmente para a fase II pacientes de CRC manteve-se uma área de controvérsia e resistência quimioterapêutica continua a ser um grande problema nesses pacientes. Portanto, a descoberta de novos biomarcadores de prognóstico e preditivos que podem ajudar a identificar estágio II e III os pacientes que estão em alto risco de recorrência e metástase, pode melhorar a actual estratégia para CRC estratificação dos pacientes e gestão de terapia. Para o melhor de nosso conhecimento, nenhum estudo anterior examinou a relação entre a metilação do

SEPT9, IGFBP3, TWIST1, GAS7, ALX4

, e

miR137

genes com o prognóstico em pacientes com CCR, assim como a capacidade destes biomarcadores para prever a resposta à quimioterapia adjuvante com base em 5-FU. Com base em nossos resultados nesta grande coorte de base populacional, bem caracterizado, fase II e III CRC pacientes com baixos níveis de

IGFBP3

metilação do promotor teve mais pobre OS e DFS em comparação com aqueles com altos níveis de hipermetilação DNA. Com relação à resposta à quimioterapia, quando baseado 5-FU quimioterapia adjuvante foi administrada a fase II e III CRC pacientes, apenas os pacientes com baixos níveis de

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tumores -methylated foram afetadas positivamente, resultando em mais DFS e oS vezes, indicando que o benefício de quimioterapia foi limitado a este grupo de pacientes de CRC. Curiosamente, este efeito de

IGFBP3

metilação foi independente do estado CIMP. No entanto, é importante salientar que, embora

IGFBP3

estado de metilação surgiu como o único fator independente que previu pobres probabilidade DFS entre estágio II pacientes com CCR, estudos clínicos independentes adicionais são necessários para provar que

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níveis de metilação em CRC poderia representar um teste de rotina potencial para o prognóstico de pacientes com CCR, e na melhoria da gestão de pacientes com doença localizada em combinação com ferramentas clínico-patológicas e moleculares atuais.

Outros estudos observaram uma relação entre alta níveis de

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metilação e má evolução clínica no pulmão e cancro do ovário [39], [40] e, mais recentemente, em pacientes com CCR [27]. relatórios discrepantes utilizando marcadores de metilação pode ser devido à utilização de diferentes metodologias e a análise de diferentes locais dentro da sequência ilhas de CpG. Neste estudo, utilizou-se pyrosequencing bissulfito para análise da metilação, o que é uma abordagem quantitativa fiável para a análise de metilação do DNA robusta comparada com a metilação convencional de PCR específica (MSP), que carece da quantificação fornecida por pyrosequencing bissulfato [27], [39], [40]. Além disso, para garantir ainda mais a precisão dos nossos resultados de metilação, que também realizou uma análise quantitativa-MSP (qMSP) dentro da região ilha do CpG previamente estudada em CRC [41]. Como mostrado na Figura 6, confirmou-se que os nossos resultados metilação pyrosequencing bissulfito foram positivamente correlacionados com os resultados obtidos na região ilha CpG anteriormente estudados [27], [39], [40].

(a) Esquema visão geral do fator crescido insulin-like gene (IGFBP3) proteína 3 de ligação. exons são representados por caixas azuis, íntrons com linhas azuis, e na região do promotor pelo azul linhas tracejadas.

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gene tem uma citosina-guanina-fosfato de ilha (CPG) a região do promotor e exon1 ressaltando o potencial de modular a expressão genética por meio de hipermetilação CPG, e este é representado por uma caixa verde. foram realizados dois ensaios diferentes que cobrem ambas as ilhas CpG (indicadas pelas setas verdes), utilizando dois métodos quantitativos: pyrosequencing e qmsp, a fim de correlacionar os níveis de metilação desses dois locais. (B) análise de regressão linear comparando

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níveis de metilação por pyrosequencing (% metilação) em 348 amostras de pacientes e ensaios qmsp (PMR) em tecidos de CRC (n = 197).

embora existam algumas diferenças entre este estudo e estudos publicados anteriormente, acreditamos que este trabalho é mais robusta e abrangente, como o nosso emprega o maior grupo de pacientes, é de base populacional, e inclui um grupo de controle de pacientes não tratados CRC para comparação. O papel biológico e tempo de

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metilação no CRC é mal compreendida;