Abstract

Anterior Gradiente Protein (AGR-2) é relatado para ser sobre-expressos em muitos cancros epiteliais e promove a metástase. Um mecanismo bem definido para a sua função (s) observada não foi previamente identificado. Encontrámos regulação positiva significativa de AGR 2-expressão numa linha de células de cancro da próstata metastático do osso, PC3, após a cultura em meio condicionado de medula óssea. Substancial expressão AGR-2 também foi confirmada em amostras de tecido da próstata câncer em pacientes com lesões ósseas. Através do desenvolvimento de clones estáveis ​​de células PC3 com diferentes níveis de AGR-2 expressão, identificou-se que a revogação da AGR-2 reduziu significativamente a adesão celular à fibronectina, colágeno I, colágeno IV, laminina I e fibrinogênio. Perda de adesão celular foi associada com diminuição acentuada na expressão de a4, a5, aV, P3 e P4 integrinas. A não se submeter a apoptose após descolamento é uma característica da metástase do cancro epitelial. As células PC3 AGR-2-silenciados apresentaram maior resistência à necrose tumoral apoptose induzida por fator relacionado apoptose ligando indutor (TRAIL)

in vitro

. Esta observação foi também suportado por uma redução significativa expressão da caspase-3 em células PC3 AGR-2-silenciados, que é um efector de morte chave de ambos os caminhos de sinalização intrínsecas e extrínsecas. Estes dados sugerem que a metástase do câncer AGR-2 influência da próstata por regulação da adesão celular e apoptose

Citation:. Chanda D, Lee JH, Sawant A, Hensel JA, Isayeva T, Reilly SD, et al. (2014) anterior Gradiente Proteína-2 é um regulador de Adesão Celular em cancro da próstata. PLoS ONE 9 (2): e89940. doi: 10.1371 /journal.pone.0089940

Autor: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, Estados Unidos da América

Recebido: 22 Outubro, 2013; Aceito: 25 de janeiro de 2014; Publicação: 27 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Chanda et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O financeira apoio dos Institutos Nacionais de Saúde concede R01 AR560948, R01 CA133737 e P30 AR046031 é apreciadas. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Dr. Raj Singh é um funcionário da Vivo Biosciences Inc. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer de próstata tem a maior taxa de incidência entre todos os tipos de câncer em homens no mundo desenvolvido e é a terceira principal causa de morte por trás do pulmão e colo-rectal [1]. Patogénese do cancro da próstata e suas metástases preferencial para o osso e de outros órgãos são regulados por genes, que funcionam cooperativamente para promover a cada passo da carcinogénese e da cascata metastática [2] – [4]. Embora as assinaturas genéticas distintas que regem fases de progressão do câncer são relatados no câncer de mama, como informações sobre o câncer de próstata ainda está em falta [5]. Identificar o papel das novas moléculas de importância diagnóstica e terapêutica continua a ser um dos principais focos de pesquisa sobre o câncer atual. Por análise da expressão do gene, observou-se aumento significativo de AGR-2 na linha celular de cancro da próstata PC3, metastizado para o osso, a seguir a manutenção em meio condicionado de medula óssea normal. AGR-2 foi identificado pela primeira vez como XAG-2 em

Xenopus laevis

, o que induz a diferenciação da glândula de cimento que ajuda os embriões para permanecer ligado ao substrato através da secreção de uma substância mucinoso [6]. O homólogo de mamífero, AGR-2, é uma isomerase de dissulfito de proteína (PDI), que contém um domínio tio-redoxin e responsáveis ​​pela produção de muco intestinal [7]. Ratos falta AGR-2 são propensas a desenvolver colite [7]. AGR-2 tem atraído atenção considerável nos últimos anos por seu suposto papel na progressão neoplásica e metástase [8] – [15]. AGR-2 foi encontrada para ser sobre-expresso em vários adenocarcinomas e tem sido associada a uma pior sobrevida de pacientes com câncer de mama e próstata [16], [17]. Alguns relatórios recentes lançaram luz sobre os elementos reguladores da função AGR-2, mas o seu papel específico (s) na tumorigênese e progressão para metástase ainda falta [18] – [20]. No cancro da próstata, AGR-2 é referido como sendo andrógeno indutível e apenas sobre-expressa durante a fase precoce da carcinogénese [13], [21]. Pelo contrário, um estudo recente também observaram redução AGR-2 expressão em tumores de alto grau, que coincidiu com doença metastática [13].

O presente estudo utilizou AGR-2 gene método de silenciamento no câncer de próstata humano metastático ósseo linha de células PC3 para entender sua função biológica na metástase do cancro da próstata óssea. Os resultados indicaram perda de AGR-2 em células PC3 resultou na redução significativa na adesão de células tumorais, a perda de expressão de a4, α5, aV, p3 e p4 integrinas e o desenvolvimento de resistência a apoptose, sugerindo o papel de AGR-2 em cascata metastática do cancro da próstata câncer, afetando a adesão de células tumorais e migração.

Materiais e Métodos

linhas celulares e Reagentes

Uma linha humana osteolítico de células de câncer de próstata, PC3, foi adquirida da ATCC (Manassas , VA), e um derivado clonal das células PC3, expressando a luciferase do pirilampo, foi uma oferta generosa do Dr. Kenneth J. Pienta (University of Michigan, Ann Arbor, Michigan). Ambas as linhas celulares foram mantidas em meio RPMI-1640 (Mediatech Inc. Hendron, VA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Mediatech Inc.) e penicilina /estreptomicina (Mediatech Inc.). O ARN total foi isolado utilizando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) e purificados utilizando um mini kit da QIAGEN (Valencia, CA). análise de cDNA microarray foi realizado pelos recursos compartilhados Cancer Genomics no Centro de Câncer Winship, da Universidade Emory (Atlanta, GA) usando um Illumina Beadstation 500 e os dados foram analisados ​​por JAVA Treeview, Spotfire, Gene Cluster 3.0 e análise de caminho Ingenuity. kit de síntese de ADNc iScript foi adquirido a Bio-Rad (Hercules, CA). AGR-2 iniciadores (directo 5′-TTGGGGTGACCAACTCATCT-3 ‘; reverso 5′- GGACAAACTGCTCTGCCAAT-3’) para a análise de RT-PCR foram desenhados utilizando o software Primer 3 (versão 4.0) e os oligonucleótidos foram adquiridos a Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA). As amostras de ADNc foram analisados ​​em Bio-Rad iCycler (Hercules, CA). 3-dimensional (3-D) grânulos PC3 para crescimento em meio condicionado de medula óssea foram geradas após crescimento das células PC3 em matrizes de Hu-Biogel e fornecido pela Vivo Biosciences (Birmingham, AL). Um Kit de Ensaio de Proliferação de Células Vybrant ® MTT foi adquirido a partir de Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). 3-D extracto de membrana basal da matriz ™ Cultura foi comprado de Cultrex (3445-00501, Gaithersburg, MD). Um kit de ensaio de adesão de células de 48 poços Cytoselect ™ foi adquirido a partir de células Biolabs, Inc. (CBA-070, San Diego, CA). Todos os kits e reagentes foram utilizados conforme as instruções do fabricante.

Anticorpos

rato e anticorpos monoclonais humanos e anticorpos policlonais para AGR-2 foram adquiridos à Abcam Ltd. (Cambridge, MA, e utilizado numa diluição de 1:1000 para imunoblots e 1:500 para IHC). Um kit de anticorpo de integrina amostrador foi adquirido a Cell Signaling (4749S, Danvers, MA, e utilizado a uma diluição de 1:1000 para imunoblots e 1:500 para IHC). A caspase-3, caspase-3 e da beta-actina clivado anticorpos foram adquiridos a partir de Cell Signaling (Danvers, MA, e utilizado a uma diluição de 1:500 para imunoblots). -Detecção imuno secundária foi realizada usando cabra-anti-rato /rato /IgG de coelho kits adquiridos ABC de Vector Laboratories (Burlingame, CA) e a GE Healthcare (Buckinghamshire, Reino Unido). Para a detecção de imunofluorescência secundário, de cabra anti-rato /IgG de murganho /coelho marcada com Alexa-Fluor-594 foi adquirido a partir de Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR, 2 ug /ml).

amostras de tecidos humanos

osso tecido de câncer de próstata metastático foi obtido a partir de autópsia na Universidade do Alabama em Birmingham, de acordo com aprovado conselho de revisão institucional protocolo (IRB). embebidos em parafina blocos de tecido fixadas em formalina e obtidos a partir dessas fontes foram seccionados a 6 pM. Todas as amostras de tecido foram revistos e caracteriza-se por patologistas anatômicas certificados.

Isolamento de Medula Óssea condicionado

Médio

Male camundongos C57BL /6 foram sacrificados e ambos fêmur ea tíbia foram colhidos e medula foi lavado com SIGMA estéril isento de soro médio Stemline (St. Louis, MO) utilizando uma agulha de calibre 28,5 equipado para uma seringa de 1 ml num tubo estéril de 50 ml contendo 10 ml de meio isento de soro Stemline. aglomerados de medula óssea foram removidos por repetida passando através de uma agulha de calibre 16,5 equipado para uma seringa de 10 ml, até uma suspensão de células única homogénea é atingida. As células são peletizadas através de centrifugação a 1200 rpm, lavadas três vezes com meio isento de soro e finalmente re-suspensa em 50 ml de meio contendo soro e Stemline antibióticos bovino fetal a 10%. As células são ainda diluídas com soro contendo Stemline meio a 100 ml e distribuído para quatro 150 centímetros

2 frascos de cultura celular (Corning Inc., Corning, NY) para a manutenção em uma câmara de humidade com 95% de O

2 e 5% de CO

2 alimentação. Após dois dias, o meio de cultura foi recolhido e centrifugado a alta velocidade para se livrar das células e detritos. Os sobrenadantes foram reunidos e utilizados directamente para a cultura de 3-D, contas PC3.

Construção de recombinante shRNA Vector e Desenvolvimento da PC3 Clones individuais derivadas de células com AGR-2 Knockdown

Vinte um par alvos de base foram seleccionados a partir de regiões únicas da sequência de codificação AGR-2 utilizando Tuschl et al., 1999 directrizes de concepção siRNA [22]. Entre as sequências de shRNA testados, o que demonstrou a eficácia máxima foi utilizado no presente estudo e consistiu de sentido 21-mero (GACAAACACCTTTCTCCTGAT) e cadeias anti-sentido, separadas por uma região de 9 pb e continha sítios de restrição BamHI ou HindIII, respectivamente , para clonagem direccional (DNA tecnologias integradas, Coralville, IA). Os oligonucleótidos foram recombinados e directamente ligado a um pRNAT.U6 /Neo plasmídeo /expressão da GFP (Genescript, Piscataway, NJ). Uma das sequências de 21-mer (CCTTGAGACTTGAAACCAGAA) que falharam para silenciar AGR-2 foi utilizado como controlo experimental para minimizar qualquer efeito fora do alvo. células PC3 foram cultivadas em placas de 6 poços a aproximadamente 90% de confluência em meio isento de antibiótico. As células foram então transf ectadas com plasmídeos que expressam AGR-2 shRNA utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Após 24 h, o meio de transfecção foi substituído por meio completo e depois de mais 24 horas, as células positivas para GFP foram classificados fluxo e mantidas em pré-padronizada 600 ug /ml de neomicina (10131, Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA). Uma vez que as células resistentes a neomicina desenvolvida, as células foram tripsinizadas e novamente plaqueadas em placas de 96 poços em placas de cultura de um /poço frequência uma célula, em duplicados. AGR-2 clones knockdown PC3 (PC3

AGR-2SH) clones de células e de controlo (PC3

Controle) foram selecionados depois de testar para AGR-2 expressão através de western blot e imunofluorescência.

sTRAIL- apoptose induzida Ensaios

humano recombinante-indução de apoptose ligante (TRAIL) foi comprado de EMD Millipore Corporation, Temecula, CA. relacionados com TNF- PC3

Controle e PC3

células AGR-2SH foram tratados com 0, 12,5, 25, 50 e 100 concentração ng /ml de TRAIL. A viabilidade celular foi determinada após 12 horas e 72 horas por coloração com iodeto de propídio (BD Biosciences) e proliferação celular do MTT Assay Kit, respectivamente. As células tratadas foram também colhidas depois de 0 h, 1 h, 3 horas e 6 horas por raspagem células, os sedimentos celulares foram lavados duas vezes com PBS arrefecido em gelo e sujeitas a transferência de Western para a detecção de caspase 3 e caspase-3 clivada péptidos activos.

Western Blotting

As células foram tripsinizadas, lavadas e re-suspensas em tampão de lise de proteína antes de serem uma vez a -80 ° C congelado-descongelado. As proteínas foram desnaturadas a adição de tampão de SDS-PAGE contendo β-mercaptoetanol e incubação a 95 ° C durante 5 min. O ADN genómico foi cortado por ultra-sonicação. As concentrações de proteína foram medidas pelo método de Lowry (Biorad, Hercules, CA). As proteínas foram separadas em gel de poliacrilamida quer 10 ou 15% e transferida para membrana de nitrocelulose. A membrana foi incubada durante 1 hr, em leite seco não gordo a 2%, em TBST para bloquear o anticorpo primário a ligação não específica. A membrana foi então incubada durante a noite com anticorpos primários diluídos apropriadamente em tampão TBST. anticorpo de beta-actina foi utilizado como controlo de carga. Seguindo uma lavagem 3 vezes em TBST, a membrana foi incubada em IgG de cabra anti-murganho /coelho conjugado com peroxidase de rábano (1:5000, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) durante 30 min. A membrana foi lavada novamente em TBST e desenvolvido usando um reagente de quimioluminescência aumentada (GE Healthcare Bio-Sciences Corp. Piscataway, NJ) e fotografada em um programador de quimioluminescência Fuji LAS-3000.

Imunofluorescência

ambos PC3

controlo e PC3 células

AGR-2SH foram crescidas em cultura, até 50% de confluência em lâminas septadas, lavados em PBS e fixadas em gelada 3,7% de paraformaldeído em PBS contendo 0,1% de Triton-X-100 , durante 20 min, a temperatura ambiente. As células foram cuidadosamente lavadas e incubadas durante a noite a 4 ° C em anticorpo AGR-2 humana monoclonal de rato. Após lavagem com PBS, as células foram incubadas com IgG anti-rato Alexa Fluor-594-rotulado (Molecular Probes, Eugene, OR), durante 30 minutos, à temperatura ambiente. As células foram lavadas e os núcleos foram coradas com DAPI para contraste. As células fluorescentes rotulados foram montados usando Vectashield (Vector Labs, Burlingame, CA) e visualizadas em um microscópio de fluorescência Leica DMRB.

A histomorfometria e imunohistoquímica

Os tecidos moles foram fixados em 10% buffered- neutra solução de formalina durante 48 horas antes de ser embutido em parafina para análise histológica. tecidos ósseos foram descalcificados em 0,5 mol /L de EDTA em Ca

2 + – e Mg

2 + livre de PBS de Dulbecco (Cellgro) antes da inclusão em parafina. Seis uM secções seriadas longitudinais foram cortadas a partir do fémur e da tíbia e coradas com hematoxilina e eosina (H E) para determinar as características de crescimento do tumor no osso. Para imuno-histoquímica, 6 mM secções de parafina foram desparafinados em xileno e hidratados por meio-álcool graduado. A recuperação de antígenos foi realizada em tampão de citrato, pH 6,0, sob vapor durante 20 min. As secções foram arrefecidos até à temperatura ambiente e a peroxidase endógena foi removido utilizando 0,3% H

2O

2 em metanol durante 30 min e bloqueadas com soro de cabra normal a 3% durante 30 min. As secções de tecido foram então incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. As secções foram lavadas em PBST e novamente incubados à temperatura ambiente (TA) com o anticorpo secundário conjugado com biotina de cabra anti-coelho /anti-rato durante 2 horas. Após a lavagem, as secções foram incubadas com peroxidase de rábano silvestre conjugado com estreptavidina durante 1 h à temperatura ambiente. Após outra lavagem com PBST, imunodetecção foi realizada utilizando DAB-H

2O

2 (Vector Labs, Burlingame, CA) e contrastadas com hematoxilina sempre que aplicável.

Ensaios de Migração

Os ensaios de migração foram realizados por um método de “fecho de feridas” e usando ensaio de câmara de Boyden. No ensaio de encerramento de feridas, as células PC3 AGR-2-silenciadas e células PC3 de controlo foram colocadas em placas a 10

5 por poço numa placa de seis poços. Ao atingir 90% de confluência, as células foram privadas de soro durante a noite. Meio fresco foi adicionado às células e as feridas foram criados utilizando um filtro estéril de 200 ul ponta da pipeta. As fotografias do fechamento da ferida foram tiradas às 0 horas e 22 horas, para comparar a diferença na taxa de encerramento de feridas entre a AGR-2-silenciadas e linhas de células de controlo PC3. Um ensaio de migração câmara de Boyden foi realizada por plaqueamento 4 × 10

4 PC3

controle e PC3

células AGR-2SH por poço em uma inserção de cultura de células (8 mm de tamanho de poro, formato de 24 poços; Becton Dickinson Labware) em meio isento de soro, em triplicado. Para iniciar a migração 10% de FBS foi usado como um quimio-atractor na câmara inferior. As células foram incubadas durante 6 horas a 37 ° C e removidas a partir da câmara superior utilizando um cotonete. As células na parte inferior da câmara foram visualizados sob um microscópio de fluorescência e contou-se utilizando o software Image J.. O efeito da AGR-2 silenciamento sobre a migração de células PC3 foi apresentado como valores relativos, em comparação com o controle (100%).

Análise Estatística

Os dados foram analisados ​​pelo aluno de

t

-teste. Valores fornecidos são a média ± SEM e as diferenças foram consideradas significativas se p . 0,05

Resultados

AGR-2 expressão está aumentada em células de câncer de próstata metastático na Presença de condicionado de Medula Óssea Microenvironment

metástase óssea é uma característica da disseminação do câncer de próstata, que oferece um ambiente ideal para estudar a metástase de tais células cancerosas dentro do microambiente e, especificamente, os sinais moleculares que promovem a sua sobrevivência no nicho metastático. Para elucidar se dar resposta aos referidos sinais no microambiente altera a expressão AGR-2 em células de cancro da próstata, PC3 células foram cultivadas em esferóides 3-dimensional e mantidas durante 3 dias em meio condicionado de medula óssea. O ARN total foi isolado a partir destas células e sujeitas a análise de cDNA microarray (Figura 1A), que foi posteriormente confirmado por em tempo real quantitativa de RT-PCR (Gene Expression Omnibus, GEO adesão # GSE38714; NCBI sistema de rastreamento # 16589736). AGR-2 estava sobre-expressa de forma significativa (p 0,05) quando comparado com as células PC3 cultivadas em meio normal (Figura 1B), sugerindo AGR-2 pode ser necessário para a adaptação inicial de células tumorais metastáticas a nova microambiente. AGR-2, também foi determinada no osso metastizado da próstata amostra de tecido de câncer. Intensa expressão AGR-2 foi detectada, o que sugere requisito de AGR-2 para o estabelecimento de metástases ósseas (Figura 1C).

. cDNA microarray mapa de calor mostrando maior expressão AGR-2 (vermelha) em células PC3 que cresceram em meio de medula óssea condicionado comparado a média normal (verde). B. Dados em tempo real de RT-PCR que mostram um aumento significativo (p 0,05) aumento na AGR-2 expressão em células PC3 após crescimento em medula óssea normal médio condicionado (BMCM) em comparação com quando cultivadas em meio normal (RM). C. imuno análise mostrando intensa AGR-2 imunomarcação nas células cancerosas humanas da próstata metastizado para o osso (Original aumento de 400X).

Determinação da AGR-2 Expressão mRNA em várias linhas celulares do cancro da próstata

Relativa expressão de ARNm AGR-2 foi determinada no osso metastático PC3, linhas celulares de cancro da próstata humano LnCap e C4-2B e metastático linha celular de cancro da próstata DU145 cérebro por RT-PCR. Os resultados indicam significativamente maior expressão AGR-2 em PC3, LnCap e linhas celulares C4-2B em relação à linha celular DU145, sugerindo importância de AGR-2 em metástase óssea do cancro da próstata (Figura 2A).

. AGR-2 foram determinados por análise de RT_PCR em várias linhas celulares de cancro da próstata humano. As células PC3 com metástases ósseas têm a mais alta expressão do mRNA AGR-2, enquanto que as células metastáticas DU145 cerebrais têm a menor quantidade de expressão AGR-2. B. Desenvolvimento de AGR-2 células PC3 silenciados. análise de Western Blot mostra regulação negativa significativa de proteína AGR-2 após a introdução estável de construção de direccionamento shRNA AGR-2 em células PC3. beta-actina foi utilizado como um controlo de carga. C. Análise de imunofluorescência comparando expressão AGR-2 em AGR-2 células PC3 silenciados contra células controle PC3 (Original aumento de 400X).

Determinação da AGR-2 Expressão em PC3

Controle e PC3

AGR-2SH linhas celulares

Quantidade de AGR-2 silenciamento de genes em PC3

AGR-2SH Controle e PC3 foi avaliada por Western blot (Figura 2B) e imunofluorescência (Figura 2C ). Mais de noventa por cento para baixo-regulação da AGR-2 expressão foi alcançada em PC3 células

AGR-2SH quando comparado com PC3

As células de controlo.

Características de crescimento alterada de células PC3 Seguindo AGR-2 silenciamento gênico

Quando as células PC3 com diferentes níveis de AGR-2 expressão foram analisados ​​

in vitro

, não houve diferença significativa nas taxas de proliferação entre PC3

AGR-2SH e PC3

Controle linhas de células (Figura 3a). No entanto, em culturas em monocamada, as PC3

As células de controlo pareciam ser do tipo fibroblastos e firmemente ligados à superfície plástica. As células foram frouxamente ligados uns aos outros e apenas por meio de extensões pseudopodial. O PC3

células AGR-2SH por outro lado, manteve fenótipo mais epitelial com morfologia arredondada ou cubóide e formou um paralelepípedo como a aparência quando confluentes. Ao contrário dos PC3

As células de controlo, PC3

células AGR-2SH parecia estar vagamente ligado à superfície do plástico (Figura 3B).

A. ensaio de proliferação celular MTT mostrando taxas similares de crescimento no PC3

AGR2sh células controle e PC3. B. PC3

células de controlo (acima) mostram uma aparência de fibroblastos-like com extensão pseudópodes, como para contatos célula-célula. PC3

células AGR2sh (abaixo) mostrou uma célula-like mais epitelial, arredondado fenótipo. Estas células também foram frouxamente ligado às placas de cultura em comparação com células de controlo. A fluorescência verde nos painéis à direita mostra tanto PC3

controle e PC3

AGR2sh células GFP constitutivamente expressa por causa da presença da GFP cassete de expressão nos vectores usados ​​para criar o controle e linhas de células PC3 AGR-2-silenciados.

AGR-2 Promove Cellular Adesão

Quando as células

AGR-2SH PC3

Controle e PC3 foram comparados pela sua capacidade de se ligar a vários matriz extracelular (ECM) proteínas, incluindo fibronectina, colagénio I, colagénio IV, laminina e o fibrinogénio utilizando um kit de ensaio de adesão de células, os resultados indicaram uma redução significativa na capacidade de PC3

células AGR-2SH para permanecer ligado a todos os componentes da ECM testado. PC3

AGR-2SH adesão à fibronectina foi maximamente diminuída (70%), entre outras proteínas da MEC, indicando AGR-2 influências via (s) que promovem a adesão celular (Figura 4A).

. propriedades de adesão de PC3

PC3

células AGR2sh controle e foram avaliados após um crescimento em placas de cultura revestidas com várias proteínas de ECM. Primeiro, as células foram semeadas em duplicado, sobre os substratos revestidos e deixou-se aderir. Em seguida, as células não ligadas foram lavadas, e as células aderentes foram fixadas e coradas. Finalmente, a mancha foi extraído e quantificado colorimetricamente. A redução significativa na adesão celular de fibronectina (*** p 0,001), colagénio I (** p 0,01), colagénio IV (*** p 0,001), laminina (* p 0,05) e fibrinogénio (* p 0,05) foram observadas no caso de PC3

AGR2sh células quando comparado com PC3

células de controlo. BSA poços revestidos foram utilizados como o reagente de controlo (p 0,1). Os dados aqui apresentados são a média ± SEM. B. significativa a sub-regulação de a4, a5, aV, p3 e p4 integrinas foi observada em PC3

AGR2sh células, em comparação com PC3

células de controlo. Não foi observada diferença nos níveis de integrina b1 entre os dois tipos de células. Beta-actina foi utilizado como controlo de carga. Várias bandas de proteínas presentes nos borrões incluem precursor integrina e proteínas maduras, bem como produtos clivados é esperado massa molecular de acordo com informações do fabricante (Cell Signaling Technology, Cat # 4749S).

Perda de integrina Expressão em as células PC3 Falta AGR-2

heterodímeros Integrina em várias combinações são conhecidos para mediar a adesão celular à ECM e desempenham um papel importante no crescimento tumoral e metástase [23]. Para determinar se as modulações de AGR-2 níveis durante o crescimento tumoral e metástase está associada com níveis de integrina alterados e função, determinou-se a expressão de um painel de integrinas (a4, a5, aV, p1, p3, p4, integrinas p5) em PC3

AGR-2SH e PC3

As células de controlo por Western blot. Significativamente reduzida expressão de a4, a5, aV, P3 e P4 integrinas

células AGR-2SH foi observada em PC3. Quantidades comparáveis ​​de níveis b1 integrina foram observados em ambas as linhas celulares enquanto que nenhuma integrina β5 foi detectada em qualquer linha de células. Estes dados sugerem fortemente um papel para AGR-2 na regulação da adesão celular através de expressão da integrina. (Figura 4B).

Redução da migração de células tumorais em AGR-2-silenciados células PC3

Para determinar se a adesão celular reduzida e expressão de integrina nas células PC3 AGR-2-silenciados afetados células PC3 migração, um ensaio tanto “fecho de feridas”, bem como um ensaio de câmara de Boyden migração foi realizada. Os resultados indicaram uma redução significativa (p 0,01) a migração de células de tumor em células PC3 AGR-2-silenciados quando comparado com células de controlo PC3. Ambos os ensaios também sugerindo a adesão celular via a expressão da integrina é crucial para a migração de células tumorais (Figura 5 A B).

High AGR-2 expressando

células controle PC3 e baixo AGR-2 expressando PC3

células AGR-2SH foram cultivadas em cultura de 6 poços prato até 90% de confluência. Eles foram privadas de soro durante a noite e deixou-se migrar após a criação do ferimento utilizando uma ponta de pipeta de 200 uL e adição de meio fresco completo. Foram tiradas fotografias a 0 horas e 22 horas para a determinação da taxa de fecho da ferida entre as duas linhas celulares. B. Ensaio de Boyden Secção: PC3

células de controlo e células

AGR-2SH PC3 foram plaqueadas em inserções de cultura de células em meio isento de soro e a migração das células foi estimulada adição de 10% de FBS como quimioatractor na câmara inferior. Após 6 horas de incubação, as células foram removidas a partir do topo da peça inserta com um cotonete e as células no lado inferior do inserto foram fotografadas e contadas. O efeito da AGR-2 silenciamento sobre a migração de células PC3 é apresentada aqui como valores relativos, em comparação com o controle (100%).

desenvolvimento de resistência TRAIL em células PC3

AGR-2SH

As experiências anteriores indicaram células PC3 AGR-2-silenciados mostrou adesão celular reduzida, integrina expressão e migração. células epiteliais normais sofrem apoptose após descolamento da membrana basal (anoikis), enquanto que a resistência anoikis é uma das características das células cancerosas malignas. Para determinar se AGR-2 silenciamento tem contribuído para a susceptibilidade a anoikis, tanto PC3

Controle e PC3

células AGR-2SH foram cultivadas

in vitro Compra de 72 horas na presença de 0, 12,5, 25, 50 e 100 ng /ml de proteína TRAIL humano solúvel (s) recombinante. Resultado da experiência foi analisada por ensaio de viabilidade celular utilizando um estojo de ensaio de proliferação de células após o tratamento MTS TRAIL. Embora a morte celular foi observada em ambos os PC3

As células de controlo e

células AGR-2SH PC3, as células PC3

AGR-2SH sobreviveram ao desafio TRAIL significativamente melhor do que os PC3

As células de controlo (Figura 6A) sugerindo perda de AGR-2 pode ser associada com o desenvolvimento de resistência anoikis em células tumorais malignas. A viabilidade celular seguindo LIARTs desafio foi também determinada por coloração das células com iodeto de propídio (PI).

células AGR-2SH PC3

Controle e PC3 foram cultivadas

in vitro Compra de 12 horas na presença de 0 ng /ml e 100 ml de concentração /ng de LIARTs seguido de coloração PI. contraste de fase, fluorescente e imagens Overlayed foram capturadas usando um microscópio Leica DMI 4000B e analisados ​​com software Image J.. Ambas as células vivas e mortas foram contadas e as células não viáveis ​​(PI positivo) foram representados como percentagem do número total de células. Os resultados mostraram células positivas significativamente maior PI (p 0,05) em PC3

As células de controlo em comparação com PC3 células

AGR-2SH (Figura 6 B C). Caspase-3 é encontrada para ser activado em ambas as vias de morte celular extrínsecos e intrínsecos e levar a cabo a fase de execução da apoptose [24]. Caspase-3 foi encontrado ser significativamente mais baixa em células PC3 AGR-2-silenciados em comparação com células de controlo na análise de transferência de Western, que também suporta o desenvolvimento de resistência anoikis (Figura 6D). Não foi observada nenhuma diferença entre células PC3 AGR-2-silenciadas e controlo em termos de caspase-8, receptor de morte e 5-caspase-9 (dados não mostrados). a actividade da caspase-3 requer clivagem proteolítica da caspase-3 inactiva em 19/17 kDa activada caspase-3 clivada [25]. Para comparar a geração de caspase-3 clivada tanto PC3

Controlo e PC3 células

AGR-2SH foram cultivadas na concentração de 50 ng /ml de LIARTs, por um período de 0 h, 1 h, 3 horas e 6 horas. As células foram colhidas por desmantelamento e pelete de células foi lavada duas vezes com PBS antes do isolamento de proteínas. A caspase-3 e caspase-3 foi determinada por transferência de Western, que apresentaram maiores níveis de ambos os péptidos em PC3

células de controlo em comparação com PC3

células AGR-2SH de uma forma dependente do tempo (Figura 6D). . Análise de câncer de próstata conjunto de dados de expressão gênica para câncer de próstata primário e metastático (194 casos), publicado por Taylor et al, 2010, utilizando CBIOPORTAL indicou uma razão de chances de 4,25 (intervalo de confiança 1,40-12,86; p 0,02 pelo teste exato de Fisher) entre AGR -2 e caspase-3, sugerindo uma tendência para a co-ocorrência destas duas moléculas [26].

. PC3

PC3

células AGR2sh controle e foram tratados

in vitro

com várias concentrações de LIARTs. A viabilidade celular foi testada após 72 horas usando um kit de ensaio de viabilidade celular. foi observada em PC3

células de controlo em comparação com PC3

AGR2sh células; significativamente maior de morte celular (0,001 p & lt). B. A viabilidade celular seguinte LIARTs desafio foi também determinada entre PC3

controle e PC3

AGR2sh células por coloração PI e visualização sob microscópio de fluorescência (Original Ampliação 200X). C. Várias fotografias foram tiradas para cada linha de células após o tratamento LIARTs e coloração PI. Ambos vivem e células mortas foram contadas manualmente usando o software Image J. e graficamente plotados. análise de mancha de D. ocidental mostrando caspase-3 níveis de caspase-3 e clivada em células PC3 AGR-2-silenciados controlo não induzido e induzido por TRAIL e.

Discussão

metástase de câncer de próstata ao osso e produz lesões ósseas osteoblásticas /, que causam dor óssea grave, susceptibilidade à fratura e compressão da medula espinhal [27]. Osso cancro metastático é incurável e leva a significativa morbidade e mortalidade nesses pacientes. Adesão de, circulam células cancerosas esfoliada dentro das proteínas da MEC da medula óssea é a principal etapa necessária para o estabelecimento de metástase óssea [28]. No nosso estudo de microarranjo, a regulação positiva significativa de AGR 2-expressão de ARNm após manutenção em meio condicionado de medula óssea sugere um papel de AGR-2 para facilitar o crescimento de células de cancro da próstata no microambiente do osso.