Abstract

As evidências acumuladas indicam que macrófagos ativar as células-tronco mesenquimais (MSCs) para a aquisição de fenótipo pró-inflamatório. No entanto, o papel das MSCs activado por macrófagos em cancro gástrico permanece em grande parte desconhecida. Neste estudo, verificou-se que as MSCs foram activadas por macrófagos para produzir níveis elevados de citoquinas inflamatórias. A formação de colónias de células e ensaios de migração Transwell revelou que os sobrenadantes de MSC activadas poderiam promover tanto celular epitelial gástrica e proliferação de células de cancro gástrico e migração. Além disso, a expressão da transição epitelial-mesenquimal (EMT), angiogénese, e genes relacionados com stemness foi aumentada em MSCs activados. As formas fosforiladas de NF-kB, ERK e STAT3 em células gástricas foram aumentadas por MSC activas. A inibição da activação do NF-kB por PDTC bloqueou o efeito de MSCs activados em células de cancro gástrico. Co-injeção de MSCs ativados com células de câncer gástrico poderia acelerar o crescimento do câncer gástrico. Além disso macrófagos, monócitos do sangue periférico humano activados derivados também MSCs para solicitar a proliferação de células de cancro gástrico e migração. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que as MSCs activados por macrófagos adquirir fenótipo pró-inflamatório e o crescimento do cancro gástrico rápido em forma de NF-kB-dependente, o que proporciona novas provas para a modulação das MSCs por microambiente do tumor e ainda mais visão para o papel de estroma células na carcinogênese gástrica e progressão do câncer

Citation:. Yang T, Zhang X, Wang M, Zhang J, Huang F, Cai J, et al. (2014) A ativação da CTM a células de crescimento de câncer macrófagos prompts gástrico humano através de NF-kB Caminho. PLoS ONE 9 (5): e97569. doi: 10.1371 /journal.pone.0097569

editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japão

Recebido: 18 de fevereiro de 2014; Aceito: 21 de abril de 2014; Publicado: 13 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pelo Plano de Investigação principal do National Science Foundation Natural da China (Grant No. 91.129.718), a National Science Foundation Natural da China (Grant no. 81302119, 81201660, 81071421), província de Jiangsu para Outstanding Sci-tech Equipe Inovação em faculdades e Universidades (Grant não. SJK2013-10), o Projeto de Jiangsu Província de Transformação Científica e Inovação Tecnológica e Conquistas (Grant no.BL2012055), da província de Jiangsu Outstanding Medical líder acadêmico e Sci-tech Innovation Programa Team (Grant no.LJ201117), Natural Science Foundation da província de Jiangsu (Grant no.BK2012709, BK20130540), Doutorado Fundação Programa de Ministério de Educação do Estado (Grant não. 20113227110011), província de Jiangsu para Natural Scicence Investigação nas Faculdades e Universidades (13KJB320001). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é um dos tumores malignos mais frequentes e mantém uma importante causa de mortalidade por cancro em todo o mundo [1], [2]. Na China, há cerca de 360.000 pessoas morrem de câncer gástrico cada ano [3]. Embora a incidência tenha diminuído nos últimos anos no Ocidente, a sobrevivência é ainda pior [4]. Ao longo das últimas décadas, tem sido um grande esforço exercido para elucidar a patogénese do cancro gástrico. No entanto, o complexo mecanismo de carcinogênese gástrica ainda está descoberto. As evidências acumuladas indicam que a inflamação crónica a longo prazo, é uma das principais causas de tumorigénese. Liberação de mediadores pró-inflamatórios e aumento dos níveis locais de espécies de oxigênio e nitrogênio podem contribuir para a carcinogênese [5]. A produção desregulada de citocinas no microambiente inflamatório estimula a expressão de genes associados com o desenvolvimento do cancro e modifica as características estruturais do microambiente para acelerar a iniciação e progressão do cancro [6] – [9].

microambiente do tumor consiste em várias células estromais , incluindo as células que se infiltram imunes, fibroblastos associados a carcinoma (CAFS), células-tronco mesenquimais (MSCs) e de sangue e as redes vasculares linfáticos. Estas células interagem um com o outro e constituem microambiente inflamatório e contribuir para a tumorigénese [10], [11]. Entre as células do estroma, macrófagos, células imunes reguladoras importantes, desempenham um papel dominante na gestão de inflamação no microambiente tumoral. Por exemplo, isolado a partir de macrófagos microambiente do tumor de doentes com cancro da mama citocinas quimiotáticas secretas para aumentar a metástase de células de carcinoma [12]. Os macrófagos também foram exibidas para promover a resposta inflamatória e a tumorigénese através de impacto sobre a expressão de citoquinas inflamatórias e alterando os programas oncogénicos moleculares dentro das células epiteliais [13].

células estaminais mesenquimais (MSCs) são um outro componente principal do tumor microambiente e são considerados como as células precursoras de câncer associado células mesenquimais e células endoteliais [14]. Os estudos anteriores indicam que as MSCs factores solúveis secretas para promover a proliferação de células de cancro e metástase [10]. Em um modelo de cancro gástrico associada à inflamação, as MSC podiam ser activados no sentido de FAC para aumentar a inflamação crónica e progressão do cancro [15]. Além disso, as MSC foram relatados para recrutar monócitos /macrófagos para promover o crescimento do tumor de uma forma de CCR2-depedent [16]. Interações entre macrófagos e MSCs produzir um fenótipo pró-inflamatório ativado com alta CXCL10 e secreção de IL-6, que podem influenciar o microambiente inflamatório [17].

O câncer gástrico é um modelo clássico de inflamação crônica ao câncer. No entanto, o papel das MSCs em macrófagos activados por cancro gástrico e o mecanismo subjacente são ainda desconhecidos. Neste estudo, verificou-se que as MSCs foram fortemente activadas por macrófagos sob condição inflamatória, para produzir citocinas inflamatórias e factores promotores de tumor, levando à melhoria da proliferação gástrico das células epiteliais e do cancro celular e migração através da activação de NF-kB via. Nossos resultados indicam que os macrófagos ativados MSCs promover o crescimento do câncer gástrico e progressão sob condição inflamatória.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

linha de células de câncer gástrico humano HGC-27, linhagem humana gástrica células epiteliais GES-1, e uma linha de células de leucemia monocítica aguda humana THP-1 foram adquiridos pelo Instituto de Bioquímica e Biologia celular da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). GES-1 e as células THP-1 foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) com soro de bovino fetal a 10% (FBS, Invitrogen), e células HGC-27 foram mantidas em alta-glucose DMEM (H -DMEM, Invitrogen) com 10% de FBS. MSCs foram derivados a partir do cordão umbilical e cultivadas em meio DMEM de baixa glicose (G-DMEM, Invitrogen) com 10% de FBS. As células foram todas incubadas a 37 ° C na incubadora humidificada de cultura de células com 5% de CO

2. Os tecidos do cordão umbilical frescas foram coletadas de mães puérperas saudáveis ​​após foi obtido consentimento informado por escrito. MSCs foram isolados e caracterizados como descrito anteriormente [18]. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Jiangsu Universidade de Ética. MSCs na passagem 3 foram selecionados para os experimentos.

O sobrenadante Preparação

Para a preparação de macrófagos associados sobrenadante MSCs, MSCs (3 × 10

5) foram semeadas a aderir. As células THP-1 (01:01 ratio) foram adicionados com meio fresco, na presença ou na ausência de LPS (1 ug /ml). Após co-cultura durante 48 h, o meio foi rejeitado e as células foram cuidadosamente lavadas com PBS para remover as células THP-1. Os sobrenadantes de MSC activadas foram recolhidas 24 horas mais tarde, filtrou-se com um filtro de 0,22-um e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. Quando utilizado para análises da função das células, os sobrenadantes de MSC activadas foram misturados com um volume igual de 10% de FBS-DMEM contendo H-ou meio RPMI-1640. Por via de sinalização de análises, as células foram tratadas com os sobrenadantes de MSC activadas durante 1 h

Luminex Ensaio

citocina Humano quimiocina kit de painel esférulas magnéticas (# HCYTOMAG-60K) (Millipore, Billerica, MA, EUA) foi concebido para detectar colónias de granulócitos factor de estimulação (G-CSF), factor de crescimento derivado das plaquetas-BB (PDGF-BB), de monócitos em proteínas 1 (MCP-1), fator de necrose tumoral-α (TNF-α), factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), IL-10, IL-1β, IL-4, IL-6 e IL-8 no sobrenadante a partir activada MSCs. Todos os procedimentos foram processados ​​de acordo com as instruções do fabricante. Os sinais foram detectados e analisados ​​utilizando o Sistema Luminex200 (Millipore).

Transwell Ensaio de Migração

Após o tratamento com os sobrenadantes de MSC activadas durante 48 h, GES-1 e HGC-27 células ( 1 × 10

5 /poço) foram colocados na câmara superior (8 um) (Corning, NY, EUA) em meio isento de soro. O meio completo foi colocado dentro da câmara inferior. Após incubação durante 12 h, as células remanescentes na parte inferior da membrana de policarbonato foram limpas com cotonetes de algodão. As células que migram para a superfície inferior da membrana foram então fixadas com metanol durante 30 min. As células migradas foram coradas com violeta de cristal durante 15 minutos e contou-se seis campos aleatórios sob o microscópio (100 ×).

Ensaio de formação de célula Colony

As células foram recolhidas após tratamento com os sobrenadantes a partir de MSCs durante 48 horas e semeadas em placas de 6 poços (1000 células /poço) e cultivadas durante 10 dias. O meio foi mudado de três em três dias. No final do período de crescimento, as células foram fixadas com metanol durante 30 minutos e coradas com violeta de cristal durante 15 minutos. As colónias de células foram fotografadas e o número de colónias foi contado para análise estatística.

Extração de RNA e PCR em tempo real

O RNA total foi extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante . Cinco microgramas de ARN foi utilizado para análise de PCR quantitativo em tempo real. β-actina foi utilizado como um controlo interno. As sequências de primers específicos foram todos listados na Tabela S1.

Western Blot

As células foram lisadas e homogeneizados em tampão RIPA suplementado com inibidores de protease completos. A mesma quantidade de proteínas (200 ug) foi resolvida em 12% SDS-PAGE. As proteínas foram então transferidas para membranas de PVDF Após a electroforese. Depois de bloqueadas em 5% (w /v) de leite desnatado durante 1 hora à temperatura ambiente, as membranas foram então incubadas a suas respectivas diluições apropriadas de anticorpos primários específicos durante a noite a 4 ° C. As fontes de anticorpos primários foram: anti-Oct4, anti-Sox2, anti-vimentina e anti-fosfo-STAT3 (Signalway Anticorpo, EUA), anti-GAPDH (Kangcheng, Xangai, China), anti-caderina-E, anti- ERK1 /2, anti-fosfo-ERK1 /2 e anti-N-caderina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), anti-PCNA, anti-STAT3, anti-NF-kB, anti-fosfo-NF- kB, anti-CyclinD1, anti-VEGF e anti-C-Jun (Bioworld Tecnologia, Louis Park, MN, EUA), anti-C-myc (Grupo Proteintech, Chicago, IL, EUA).

animal modelo

Três a cinco semanas de idade camundongos BALB /c nus foram adquiridos da SLAC animais de Laboratório Center (Xangai, China). Os animais foram mantidos em conformidade com as políticas institucionais, e todos os estudos foram realizados com aprovação do Comitê Universidade do sobre uso e cuidados de animais da Universidade de Jiangsu. células HGC-27 (1 × 10

6) e MSC (5 × 10

5) foram tratadas com tripsina, lavadas e ressuspensas em 200 ul de PBS, respectivamente. Em seguida, as células foram misturadas e co-injectados no flanco esquerdo de ratinhos nus. Os tumores foram removidos cirurgicamente 20 dias após a injecção, fotografado e ponderados. O tamanho do tumor foi avaliada por medição paquímetro e calculada com base na fórmula elipsóide modificado (L × W × W /2), onde L representa o comprimento, e W representa a largura.

Imunohistoquímica

formalina secções de tecido de tumor do rato embebidos em parafina fixos foram desparafinados pela primeira vez em xileno, reidratadas através etanol graduado. As secções foram fervidas durante 10 minutos em tampão de citrato (pH 6,0, 10 mM) para recuperação de antigénios. A actividade de peroxidase endógena foi inibida com a exposição ao peróxido de hidrogénio a 3% durante 10 min. Em seguida, as secções foram bloqueadas com BSA a 5% (Boster Bioengineering, Wuhan, China) e incubadas com PCNA diluída adequada ou anticorpo primário VEGF a 37 ° C durante 1 h. Depois de lavadas com PBS, as secções foram então incubadas com anticorpo secundário diluído durante 20 minutos. Finalmente, as secções foram visualizados com 3,3′-diaminobenzidina (DAB) e, em seguida, contra-coradas com hematoxilina para exame por microscopia óptica (200 x).

monócitos humanos primários Isolamento

Os monócitos humanos foram obtidos a partir de buffy coat de amostras de sangue periférico de dadores saudáveis ​​por doados utilizando Ficoll (Histopaque-1077) (Sigma, EUA). RPMI 1640 suplementado fresco com 10% de FBS foram mudado a cada 2 dias, e as células não-aderentes foram removidas e purificadas. Os monócitos foram incubados durante 7 dias e 50 ng /ml de M-CSF foi adicionado para se obter os macrófagos (M). Em seguida, 24 h sobrenadante secretada por macrófagos foi recolhido e filtrado. MSCs aderentes foram tratadas com o sobrenadante de macrófagos na ausência ou presença de LPS (1 ug /ml) durante 48 h e lavou-se. Os sobrenadantes de MSCs ativadas foram recolhidas 24 h mais tarde e usado para seguir estudos.

Análise Estatística

A análise estatística foi feita com software SPSS Statistics 16.0. Os dados foram apresentados como média ± SD. Diferenças em diferentes grupos foram analisados ​​usando ANOVA one-way. As diferenças entre tratamentos PDTC foram testados pelo

t

teste. Estatística

P

valor 0,05 foi considerado significativo

Resultados

Co-cultura com macrófagos Sob Inflamatória Estado-regulada a expressão de citocinas inflamatórias e stemness Genes in. MSCs

para investigar o efeito dos macrófagos sobre as MSCs sob condição inflamatória, que co-cultivadas com MSC de células THP-1 na ausência ou na presença de LPS (1 ug /ml) durante 48 h. As células THP-1 foram removidos por lavagem em PBS e as MSCs aderentes foram cultivadas em meio fresco durante mais 24 h (Figura S1). ensaio de Luminex foi realizado para determinar os níveis de vários factores inflamatórios nos sobrenadantes de MSC. Os resultados mostraram que a produção de IL-6, IL-8, TNF-α, MCP-1, VEGF e G-CSF foi significativamente aumentado no sobrenadante a partir de MSC co-cultivadas com células THP-1 na presença de LPS. Níveis baixos ou indetectáveis ​​destas citocinas foram observadas em MSCs que não foram co-cultivadas com células THP-1 (Figura 1A). Para confirmar o aumento da expressão dessas citoquinas inflamatórias, que pré-formada-PCR em tempo real para detectar os níveis de mRNA de citocinas estes. Nós descobrimos que em consistente com os resultados do ensaio de Luminex (Figura 1B), co-cultura com células THP-1-regulados os níveis de ARNm de IL-6, IL-8 e TNF-α no MSC. Para determinar se a co-cultura com células THP-1 afecta a stemness de MSC, foi detectada a expressão de Oct4 e Sox2 em MSCs utilizando Western blot. Os resultados mostraram que tanto os níveis de proteína Oct4 e Sox2 foram aumentados em MSCs que foram co-cultivados com células THP-1 (Figura 1C). Para confirmar ainda mais este fenômeno, nós também examinou os níveis de mRNA de Oct4 e Sox2 em MSCs. Os resultados de PCR em tempo real mostraram que a co-cultura com células THP-1-regulado a expressão de genes em Oct4 e Sox2 MSC (Figura 1D). Em geral, estes resultados sugerem que as MSCs foram significativamente activado para produzir níveis mais elevados de citocinas inflamatórias por células co-cultivadas células THP-1, sob condição inflamatória.

(A) ensaio de Luminex para a IL-6, IL-8, TNFa, MCP-1, VEGF e G-CSF os níveis nos sobrenadantes de MSC. analisa (B) PCR em tempo real de IL-6, IL-8, TNFa, MCP-1, VEGF e a expressão de ARNm de TGF-β no MSC. ***

P Art 0,001, **

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P Art 0,05. (C) análises de Western blot dos níveis de proteína Oct4 e Sox2 em MSCs. analisa (D) PCR em tempo real de expressão de ARNm Oct4 e Sox2 em MSCs. ***

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Macrophages- MSCs ativados reforçada a proliferação e migração de células epiteliais gástricas

os macrófagos e MSCs são componentes importantes do microambiente do tumor. Para demonstrar o papel funcional de MSCs macrófagos activados, estão reunidos os sobrenadantes de MSC activadas e incubou-se com gástrica linha celular epitelial GES-1 durante 48 h. Em seguida, realizada ensaio de formação de colónias de células para avaliar a proliferação de células GES-1. Como mostrado na Figura 2A, as células incubadas com o sobrenadante de MSCs activados cresceram mais rapidamente e formaram colónias maiores e mais do que aqueles em outros grupos. Além disso, a incubação com o sobrenadante de MSCs activadas também aumentou os níveis de proteína PCNA e de VEGF em células GES-1 (Figura 2B). Os resultados do ensaio de migração Transwell mostrou que o número de migraram GES-1 em células activadas MSCs grupo mais LPS foi mais do que nos outros grupos (Figura 2C). Os resultados das análises de Western blot mostrou que as MSCs macrófagos activados aumentou a expressão de marcadores de células mesenquimais (N-caderina e vimentina) e diminuiu a expressão do marcador de célula epitelial (E-caderina) em 1 GES-células (Figura 2D). A seguir, determinou-se a expressão do VEGF, MMP9 e TGF-β utilizando PCR em tempo real. Tal como mostrado na Figura 2E, a incubação com o sobrenadante de MSCs Activar mais grupo LPS-regulado a expressão de VEGF, MMP9 e TGF-β em células GES-1. Assim, MSCs ativados por macrófagos no ambiente inflamatório promoveu significativamente a proliferação das células do epitélio gástrico e migração.

(A) Imagens representativas de ensaio de formação de colónias de células e histograma do número de colônias. Os dados foram coletados como média ± desvio padrão de três poços. **

P Art 0,01, *

P Art 0,05. (B) Os ensaios de Western blot para PCNA e os níveis de proteína VEGF. (C) Imagens representativas de ensaio Transwell migração e histograma do número de células migradas GES-1. Ampliação, × 100, barra de escala = 50 mm. ***

P Art 0,001, **

P Art 0,01, *

P Art 0,05. (D) Os ensaios de Western blot para E-caderina, N-caderina e os níveis de proteína Vimentina. analisa (E) PCR em tempo real de VEGF, MMP9 e a expressão de ARNm de TGF-β. **

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Os macrófagos ativados MSCs promoveu o crescimento e migração de células de câncer gástrico

Uma vez que os macrófagos ativados MSCs afetar a proliferação de células epiteliais gástricas e migração, o próximo determinado o efeito de MSCs macrófagos ativados sobre o câncer gástrico humano células HGC-27. Os resultados do ensaio de formação de colónias de células mostraram que HGC-27 células incubadas com o sobrenadante de MSCs macrófagos activados cresceram mais rapidamente e formado clones maiores do que os outros grupos (Figura 3A). análises de parafuso ocidentais mostrou que os níveis de proteína PCNA e de VEGF em células HGC-27 foram significativamente sobre-regulada pelo sobrenadante de macrófagos activados MSC (Figura 3B). ensaio de migração Transwell revelou que o número de células migradas HGC-27 foi notavelmente aumentada pela sobrenadante a partir de MSC de macrófagos activados (Figura 3C). As análises de transferência de Western mostrou que as MSCs macrófagos activados induziu a expressão de marcadores de células mesenquimais (N-caderina e vimentina) e inibiu a expressão do marcador de célula epitelial (E-caderina) em HGC-27 células (Figura 3D). Os níveis de ARNm de VEGF, MMP9 e TGF-β foram também aumentadas em células HGC-27 após o tratamento com o sobrenadante a partir de MSC de macrófagos activados (Figura 3E). Considerando-se que stemness célula cancerosa está fortemente ligada à sua migração, detectamos a expressão de genes em células stemness HGC-27. A expressão de Oct4 e Sox2 foi notavelmente up-regulada pelo sobrenadante de MSCs macrófagos ativados (Figura 3F). Em consistentes com a real-time PCR resultados, os níveis de proteína de Oct4 e Sox2 foram também aumentadas em células HGC-27 pelo sobrenadante de MSCs macrófagos activados (Figura 3G). Em resumo, estes resultados sugerem que os macrófagos activados MSCs também promoveu o crescimento de células de cancro gástrico, a migração através da indução de EMT e stemness célula sob condição inflamatória.

(A) Imagens representativas de ensaio de formação de colónias de células e de histograma número de colônias. Os dados foram coletados como média ± desvio padrão de três poços. *

P Art 0,05. (B) Os ensaios de Western blot para PCNA e os níveis de proteína VEGF. (C) Imagens representativas de Transwell ensaio de migração e histograma do número de células migradas HGC-27. Ampliação, × 100; barra de escala = 50 mm. ***

P Art 0,001, **

P Art 0,01. (D) Os ensaios de Western blot para E-caderina, N-caderina e os níveis de proteína Vimentina. analisa (E) PCR em tempo real de VEGF, MMP9 e a expressão de ARNm de TGF-β. ***

P Art 0,001, *

P Art 0,05. (F) ensaio de Western Blot para os níveis de proteína Oct4 e Sox2 em células HGC-27. analisa (L) PCR em tempo real de expressão de ARNm Oct4 e Sox2. **

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macrófagos ativados MSCs Promovido Proliferação celular gástrica e migração através de NF-kB Caminho

a fim de explorar o mecanismo responsável pelo papel de promoção de MSCs macrófagos ativados em proliferação e migração celular, determinou-se a expressão de vários transdutores de sinalização importantes para a inflamação e câncer, incluindo STAT3, ERK e NF-kB, em células epiteliais gástricas e células de cancro gástrico. Os resultados das análises de Western blot mostrou que os níveis de p-STAT3, p-ERK e p-NF-kB foram significativamente mais elevados nas células GES-1 tratadas com os sobrenadantes de MSC activadas do que aqueles em outros grupos. O nível de proteína de NF-kB não apresentou alterações, enquanto que de ERK e STAT3 diminuiu ligeiramente (Figura 4A). Os aumentos de p-STAT3, p-ERK e os níveis de proteína p-NF-kB também foram observados em células HGC-27 após o tratamento com os sobrenadantes a partir das MSCs activadas (Figura 4B). Foi confirmada a sobre-regulação de p-STAT3, p-ERK e os níveis de proteína p-NF-kB pelos sobrenadantes das MSCs activados em uma outra linha celular de cancro gástrico SGC7901 (Figura S2). Para determinar se os genes alvo a jusante também foram activadas em células HGC-27, foi examinada a expressão de ciclina D1, C-myc e proteína C-Jun. Tal como mostrado na Figura 4C, os níveis de proteína de ciclina D1 e C-Jun foram elevados após tratamento com os sobrenadantes a partir das MSCs activados.

(A) GES-1 e (b) HGC-27 células tratadas com os sobrenadantes para MSC activados. A expressão de p-STAT3, STAT3, p-ERK, ERK, p-NF-kB, e NF-kB proteínas foram determinadas utilizando Western blot. (C) ensaios de Western blot para ciclina D1, C-myc, e os níveis de proteína C-Jun nas células HGC-27. (D) Os ensaios de transferência de Western para os níveis de proteína de NF-kB p-NF-kB e em células HGC-27 que foram tratados com os sobrenadantes a partir das MSCs activados na presença ou ausência de PDTC (100 nM). O número de colónias de células (E) e as células migraram (F) para 27 HGC-células tratadas com diferentes sobrenadantes de MSC, na presença ou ausência de PDTC (100 nM). analisa (L) em tempo real de PCR do VEGF, MMP9, e a expressão de ARNm de TGF-β em HGC de 27 células tratadas com diferentes sobrenadantes de MSC, na presença ou ausência de PDTC (100 nM). **

P Art 0,01, *

P

. 0,05

Para futuro determinar se NF-kB desempenha um papel importante nas funções de activado MSCs, células HGC-27 foram pré-tratadas com PDTC para inibir a fosforilação do NF-kB e, em seguida, incubadas com os sobrenadantes das MSCs activados. Verificou-se que a indução de NF-kB por fosforilação MSCs em células activadas HGC-27 foi acentuadamente inibida por PDTC (Figura 4D). Os resultados da formação de colónias de células e ensaios de migração Transwell mostraram que a proliferação aumentada e migração de células HGC-27 pelas MSCs activadas foram significativamente reduzida nos grupos tratados com PDTC (Figuras 4E e 4F). Além disso, o tratamento com PDTC também inibiu a sobre-regulação de VEGF, MMP9 e TGF-β por MSC activados em HGC-27 células (Figura 4G). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que as MSCs ativados linha de células epiteliais gástricas e proliferação de células de câncer gástrico e de migração por meio de NF-kB.

macrófagos ativados MSCs promoveu o crescimento câncer gástrico in vivo

Dada a evidência de que MSCs macrófagos ativados poderia aumentar a proliferação de células gástricas

in vitro

, nos perguntamos se esses MSCs exercida promovendo papel no crescimento do câncer gástrico

in vivo

. Assim, nós co-injetaram células HGC-27 com as MSCs ativados em ratinhos nus. Vinte dias mais tarde, os tecidos de tumor foram removidos, pesados ​​e medidos. Tal como mostrado nas Figuras 5A e 5B, os tumores de xenoenxerto em grupo MSC co-injectado activado foram maiores do que aqueles em outros grupos. As análises imuno-histoquímicos foram realizados para determinar a expressão de proteínas relacionadas com o crescimento e factores pró-angiogénicos em tecidos tumorais. A coloração positivo mais forte de PCNA e VEGF foi observada no grupo de MSC co-injectado activada (Figura 5C). Análises em tempo real de PCR foram realizados para detectar a expressão de VEGF, MMP9 e TGF-β em tecidos tumorais. Descobrimos que a expressão de todos estes genes em grupos co-injectadas foram maiores que em HGC-27 sozinho células grupo (Figura 5D). Os resultados das análises em tempo real PCR mostrou que os níveis de mRNA de Oct4, Sox2 e Sall4 foram as mais altas no grupo MSCs co-injetados activado (Figura 5E). Em resumo, estes dados indicam que o crescimento do câncer gástrico MSCs macrófagos ativados prompt de

in vivo

.

(A) Imagens representativas dos tecidos tumorais xenotransplante e (B) o volume e peso de tumor tecidos colhidos de ratinhos injectados com células HGC-27 isoladamente ou em conjunto com as MSC. (C) Análise imunoistoquímica de níveis de proteína PCNA e VEGF em tecidos tumorais. Ampliação, × 200; barra de escala = 50 mm. (D) em tempo real análises de PCR do VEGF, MMP9, e a expressão de ARNm de TGF-β em tecidos tumorais. ***

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P Art 0,05. analisa (E) PCR em tempo real de expressão Oct4, Sox2, e Sall4 mRNA em tecidos tumorais. ***

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Os monócitos primários MSCs ativados para Prompt câncer gástrico proliferação e migração celular através de NF-kB

para confirmar ainda mais a ativação de MSCs por macrófagos para solicitar a proliferação de células de câncer gástrico e migração, nós isolamos monócitos do sangue periférico humano e recolhido o sobrenadante monócitos macrófagos diferenciados. Após a incubação com o sobrenadante de monócitos macrófagos diferenciados, as MSC foram colhidas e o RNA total foi extraído para análises em tempo real de PCR. Como mostrado na Figura 6B, o tratamento com o sobrenadante de monócitos macrófagos diferenciados supra-regulados os níveis de ARNm de IL-6, IL-8, MCP-1 e VEGF no MSC. Em seguida, incubou-se as células gástricas cancerosas com o sobrenadante das MSCs activados. Os resultados da formação de colónias de células e ensaios de migração Transwell mostraram que o sobrenadante das MSCs activados aumentar a proliferação e migração de células HGC-27 (Figuras 6C e 6D). Demonstramos ainda que a incubação com sobrenadantes das MSCs activadas aumentou a expressão de p-STAT3, p-ERK e p-NF-kB em células HGC-27 (Figura 6E). Tomados em conjunto, estes dados sugerem que em células consistente com as células THP-1, macrófagos primários humanos também activada MSCs para solicitar a proliferação de células de cancro gástrico e da migração através de NF-kB.

analisa (A) PCR em tempo real de expressão de IL-6, IL-8, MCP-1 e ARNm de VEGF no MSC. ***

P Art 0,001, **

P Art 0,01, *

P Art 0,05. (B) Imagens representativas de colônias de células e histograma do número de colônias. Os dados foram coletados como média ± desvio padrão de três poços. **

P Art 0,01, *

P Art 0,05. (C) Imagens representativas de Transwell ensaio de migração e histograma do número de células migradas HGC-27. Ampliação, × 100; barra de escala = 50 mm. **

P Art 0,01. (D) Os ensaios de Western blot para p-STAT3, STAT3, p-ERK, ERK, p-NF-kB, e NF-kB níveis de proteína em células HGC-27.

Discussão

Durante as últimas décadas, a ligação da inflamação ao câncer tem atraído muita atenção [5], [6]. exposição a longo prazo de células epiteliais para microambiente inflamatório leva à transformação maligna [9], [19]. As células estromais foram mostrados para ser criticamente envolvida na progressão da inflamação para cancro através da modulação do microambiente inflamatório [7], [8]. Os macrófagos e MSC são dois principais componentes do estroma tumoral e participam na regulação da extensão da reacção inflamatória durante a carcinogénese [16]. No entanto, a interação entre macrófagos e MSCs no câncer gástrico não foi bem caracterizada.

O câncer gástrico é evoluiu de gastrite crônica a longo prazo e é um modelo clássico de cancro relacionados com a inflamação. Nós isolamos anteriormente MSCs residentes de tecidos de câncer gástrico humano e demonstrou que o câncer gástrico tecido derivado MSCs secretado lotes de citocinas inflamatórias e promovida a progressão do cancro gástrico. Durante o processo de inflamação, os monócitos /macrófagos podem ser recrutados para dotar as MSCs com características promotoras de tumores [16]. Além disso,

Helicobacter pylori

induzir a inflamação crônica nas células epiteliais gástricas através da liberação de LPS existentes nas suas paredes celulares. Neste estudo, foram pré-tratados com MSCs de macrófagos, na presença de LPS para imitar microambiente cancro gástrico e para determinar se as MSC macrófagos activados contribuem para a progressão do cancro gástrico. Nós demonstramos que as MSCs foram incubadas com os macrófagos e LPS secretada níveis mais elevados de citoquinas inflamatórias. Um estudo recente relatou que a estimulação contínua com meio condicionado de macrófagos induzida MSCs para adquirir um fenótipo pró-inflamatório [17]. Em consonância com o seu estudo, descobrimos que curto tempo de incubação com os macrófagos também activado MSCs para produzir maior nível de citocinas inflamatórias.

epitelial-mesenquimal-transição (EMT) é um processo importante durante a metástase do câncer [20]. Ao longo dos anos, as propriedades de reprogramação relacionadas com a EMT foram atribuídos para melhorar a plasticidade celular em células cancerosas. células-tronco do câncer, foi introduzida e mostrado para contribuir para tumorigênese e metástase do tumor [21] – [24]. Estudos recentes sugerem que uma subpopulação de células-tronco semelhantes e mesenquimais-like exibido um maior tumorigenicidade em células epiteliais gástricas

in vitro e in vivo

[25]. Neste estudo, verificou-se que as MSCs activadas, que foram co-cultivados com macrófagos na presença de LPS, pode notavelmente melhorar a migração de células epiteliais gástricas, bem como células de cancro gástrico.