Abstract

O carcinoma hepatocelular (HCC) é uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. A ressecção cirúrgica e quimioterapia convencional e radioterapia, em última análise falhar devido à recorrência do tumor e resistência do HCC. O desenvolvimento de novas terapias contra o HCC é, portanto, necessário urgentemente. As vias da quinase dependente da ciclina (CDK) são alvos importantes e bem estabelecidos para o tratamento do câncer. Em particular, CDK2 é um factor chave que regula o ciclo celular G1 para S e de transição uma marca para cancros. Neste estudo, utilizamos nossa proteína-ligando software de encaixe livre e de código aberto, idock, prospectivamente para identificar inibidores CDK2 potenciais de 4.311 medicamentos de moléculas pequenas aprovados pela FDA, usando uma estratégia de reorientação e uma metodologia de acoplamento ensemble. Classificadas segundo a pontuação média idock, nove compostos foram adquiridos e testados

in vitro

. Entre eles, o Fluspirileno droga anti-psicótica exibiu o maior efeito anti-proliferativo em células de carcinoma hepatocelular humano HepG2 e Huh7. Nós demonstramos pela primeira vez que Fluspirileno tratamento aumentou significativamente a percentagem de células em fase G1, e diminuiu as expressões de CDK2, ciclina E e R, bem como as fosforilações de CDK2 em Thr160 e Rb em Ser795. Nós também examinou o efeito anti-câncer do Fluspirileno

in vivo

em ratinhos nus BALB /C por via subcutânea xenoenxerto com células Huh7 de carcinoma hepatocelular humano. Os nossos resultados mostraram que o tratamento por via oral Fluspirileno inibiu significativamente o crescimento do tumor. Fluspirileno (15 mg /kg) exibiram actividade anti-tumoral forte, comparável à do líder cancro droga 5-fluorouracilo (10 mg /kg). Além disso, o tratamento com cocktail Fluspirileno e 5-fluorouracilo exibiu o maior efeito terapêutico. Estes resultados sugerem, pela primeira vez que Fluspirileno é um potencial inibidor de CDK2 e uma droga anti-cancro candidato para o tratamento de carcinoma hepatocelular humano. Tendo em vista o fato de que Fluspirileno tem uma longa história de uso humano seguro, a nossa descoberta de Fluspirileno como um potencial medicamento anti-HCC pode apresentar uma terapia clínica imediatamente aplicáveis ​​

Citation:. Shi XN, Li H, Yao H, Liu X, Li G, KS Leung, et ai. (2015)

In Silico

Identificação e

In Vitro

e

In Vivo

Validação de Anti-Psychotic Drogas Fluspirileno como um potencial CDK2 inibidor e um candidato Anti-Cancer da droga. PLoS ONE 10 (7): e0132072. doi: 10.1371 /journal.pone.0132072

editor: Yu-Jia Chang, Taipei Medicina da Universidade, TAIWAN

Recebido: 20 Janeiro, 2015; Aceito: 09 de junho de 2015; Publicação: 06 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Shi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por subsídios da estação de trabalho acadêmico Hsiang-fu Kung da Universidade médica Kunming, National Natural Science Foundation da China (NSFC) 81272549, Lab Key projeto de Shenzhen (ZDSY20130329101130496) da China, a subvenção directa da Universidade chinesa de Hong Kong, o GRF Grant (Project Referências 414413, 772910 e 470911) do Conselho Bolsas de investigação de Hong Kong.

Conflito de interesses os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o carcinoma hepatocelular (HCC) é o tipo mais comum de câncer de fígado.. Apenas 30% a 40% dos pacientes de CHC é elegível para tratamentos curativos, os quais incluem a ressecção cirúrgica como a primeira opção, o transplante de fígado e de ablação percutânea. No entanto, existe uma elevada frequência de recorrência do tumor após ressecção cirúrgica, e a maioria dos HCC parece resistente a quimioterapia convencional e radioterapia. Portanto, o desenvolvimento de novas terapias contra HCC é muito procurado.

A causa da HCC envolve múltiplas vias. As vias da quinase dependente da ciclina (CDK) como importantes alvos terapêuticos para o tratamento do câncer têm sido bem estabelecida. CDKs são enzimas envolvidas na replicação celular, e seu papel no crescimento do tumor, há muito fizeram-los em alvos de drogas atraentes. Mas as tentativas industriais início em CDKs inibidoras para restaurar o crescimento celular para problemas de toxicidade foram encontradas normais. inibidores de CDK de primeira geração eram não específicas, inibindo muitas CDKs diferentes (há mais de 20, muitos dos quais têm sido implicados em vários tipos de tumores), e resultando no tipo de toxicidade e eficácia silenciado visto com quimioterapias mais velhos.

dependente de ciclina quinase 2 (CDK2) é uma das cinases de proteína serina /treonina. Ela desempenha um papel central na regulação da transição do ciclo celular de G1 para a fase S, e, assim, no controlo da proliferação celular. Assim, inibidores de CDK2 são potencialmente eficazes agentes anti-câncer. Embora um certo número de inibidores de CDK2 foram descritas na literatura [1] e alguns entraram fases de ensaios clínicos, e.g. flavopiridol [2], a roscovitina [3] e olomoucina [4], nenhum deles tem sido aprovado para uso clínico devido a várias razões, tais como toxicidade e especificidade multi-alvo. Além disso, nenhum dos inibidores CDK2 relatados são para o tratamento de HCC.

Neste estudo, utilizamos o nosso idock software de acoplamento proteína-ligante livre e de código aberto [5, 6] para a tela aprovado pela FDA pequena fármacos de moléculas contra CDK2, evitando assim o problema da toxicidade. Adotamos o

in silico

abordagem de triagem virtual baseada em estrutura e ancoragem conjunto de reaproveitar medicamentos aprovados para o tratamento de cancros que envolvem regulação CDK2, com um foco principal na carcinoma hepatocelular humano (HCC). Testamos nove compostos computacionalmente favorecidas

in vitro

em linhas de células de carcinoma hepatocelular HepG2 e Huh7, e com sucesso identificou o Fluspirileno medicamento anti-psicótico como um potencial inibidor de CDK2. Em seguida, realizada

In vivo

experiências em ratinhos nus xenoenxertados com células Huh7, e mostraram que Fluspirileno exibiu actividade anti-tumoral forte comparável à do líder cancro droga 5-fluoro-uracilo, que cria mais Fluspirileno como um anti-candidato droga contra o câncer. Também mostrou que o tratamento com ambos cocktail Fluspirileno e 5-fluorouracilo pode produzir efeito terapêutico sinérgico. Por fim, analisamos a conformação de ligação previsto de Fluspirileno e revelou as interações intermoleculares críticos que possivelmente governam Fluspirileno ligação a CDK2.

Métodos e declaração de Ética Materiais

Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética de animais de laboratório da Universidade médica Kunming.

encaixe Ensemble e composto selecção

Existem tantos como 346 raios-X estruturas cristalográficas resolvidos de CDK2 do PDB (Protein Data Bank ) [7, 8] com um ID UniProt de P24941 (S1 Tabela). Entre eles, foram coletadas 44 estruturas cristalinas de CDK2 em complexo com um ligando ligado (Tabela 1; S1 Fig). Estes 44 estruturas foram selecionados porque eles não contêm íons metálicos, que podem influenciar a precisão de encaixe de idock [6], e também porque eles contêm um ligando ligado, cujo coordenar ajuda a definir um espaço de busca facilmente. Um roteiro previamente escrito [6] foi re-utilizado para definir automaticamente o espaço de busca de encaixe por encontrar a menor caixa cúbica que cobre o ligando toda co-cristalizado e estendendo-se posteriormente a caixa por 10Å em todas as três dimensões. Os 44 estruturas CDK2 foram extraídas manualmente de seus complexos correspondentes com os ligantes e águas co-cristalizado removidos, e depois convertido para o formato PDB para o formato PDBQT usando o script prepare_receptor4.py de AutoDockTools [9].

para testar a precisão redocking de idock, os ligantes co-cristalizado também foram extraídas manualmente de seus complexos correspondentes e convertidos para o formato PDB para o formato PDBQT usando o script prepare_ligand4.py de AutoDockTools [9]. Estes ligantes foram então encaixado de volta à sua estrutura CDK2 correspondente e seu desvio quadrático médio (RMSD) a partir da conformação co-cristalizado foi calculado.

As estruturas de medicamentos aprovados pela FDA foram obtidos a partir da DBAP e fda catálogos de banco de dados ZINCO [10, 11], onde o catálogo DBAP compreende drogas coletados a partir do banco de dados drugbank [12] e o catálogo FDA aprovou compreende drogas recolhidos através do DSSTox projeto (-pesquisável Estrutura Toxicidade Distribuído) aprovado. O catálogo DBAP da versão 2014/03/19 com 1.738 compostos e o catálogo fda da versão 2012-07-25 com 3.176 compostos foram baixadas. Entre estes compostos 4.914, 4.311 eram únicas em termos de ZINCO ID. Estes 4.914 compostos em formato Mol2 foram então convertidos para o formato PDBQT usando o script prepare_ligand4.py de AutoDockTools [9].

Nossa v2.1.2 idock software de encaixe livre e de código aberto [6] foi então executado para prever as conformações de ligação e as afinidades de ligação dos 4.914 compostos, quando atracados contra os 44 estruturas CDK2 utilizando uma estratégia de acoplamento conjunto [13-15]. Para cada estrutura da proteína, rede de energia livre mapas com uma fina granularidade de 0,08 Å foram construídos em paralelo e para cada composto, 256 Monte Carlo tarefas de otimização conformacional foram executados em paralelo em múltiplos núcleos de CPU.

Depois de encaixe, idock emitido um número máximo de nove conformações previstos para cada composto de entrada. A conformação atracado com a melhor pontuação idock foi selecionado porque ele foi mostrado previamente para ser o mais provável mais próximo da conformação de cristal com uma taxa de sucesso redocking de mais de 50% em três benchmarks diferentes [6]. Os 4.914 compostos foram ordenados na ordem crescente de sua previu energia livre de ligação média entre as 44 estruturas CDK2, e os com maior pontuação foram examinados visualmente utilizando iview [16] no contexto de CDK2 utilizando a estrutura de cristal de raios-X do maior resolução, ou seja, PDB ID 1GZ8 neste caso (Tabela 1). Em seguida, comercialmente disponíveis compostos foram consultados e comprados através do site da Chemical Livro https://www.chemicalbook.com/e, posteriormente validado

in vitro

e

in vivo

.

produtos químicos, anticorpos, linhas celulares e de cultura de células

os produtos químicos selecionados e a principal droga contra o câncer 5-fluorouracil foram adquiridos da Sigma-Aldrich, EUA. Anti-ciclina D, B1, E, CDK2, Rb, Pho-CDK2 (Thr160), pho-Rb (Ser795) e GAPDH foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, Massachusetts, EUA.

linhas de células de hepatoma HepG2 e Huh7 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection, Manassas, Virgínia, EUA. Estas linhas celulares foram cultivadas em meio RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Invitrogen, Rockville, Maryland, EUA) a 37 ° C em 5% de CO

2 e 95% de ar humidificado.

as células foram plaqueadas em placas de 96, 24, ou de 6 poços placas com meio com FBS a 0,125% durante 24 horas e depois tratou-se com 10% de meio com FBS contendo os compostos de teste a várias concentrações de 1, 3, 10, 30

u

M, e incubou-se durante 24, 48 ou 72 horas.

ensaio MTT

As células foram plaqueadas a uma densidade inicial de 9 × 10

3 células /cavidade em placas de 96 poços e incubou-se com 0,5 mg /ml de 3- (4,5-metiltiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazólio durante 4 horas. O meio foi em seguida descartado e

foram adicionados 200 μ l de

formazano em dimetilsulfóxido (DMSO). A absorvância foi medida a 570 nm de acordo com o protocolo padrão. A IC

50 valores foram calculados por GraphPad Prism 5.

células

análise do ciclo celular

HepG2 ou Huh7 (4 × 10

4) foram semeadas em placas de 24 poços em RPMI 1640 contendo 0,125% de FBS, e cultivadas durante 24 horas. As células foram incubadas em meio contendo 10% de FBS e várias doses de Fluspirileno (1, 3, 10, 30

μ

M) durante 12, 24, 36 horas a 37 ° C, em seguida, fixado em gelada etanol a 70% e coradas com um kit Coulter DNA-Prep Reagentes (Beckman Coulter, Fullerton, Califórnia, EUA). teor de ADN celular de 1 x 10

4 células de cada amostra foi determinada com o uso de um fluxo EPICS ALTRA citómetro (Beckman Coulter). distribuição de fases do ciclo celular foi analisada com o software ModFit LT 2.0 (Verity Software House, Topsham, Maine, EUA). Todos os resultados foram obtidos a partir de duas experiências separadas, cada um dos quais foi feito em triplicado.

análise celular apoptose

células

HepG2 e Huh7 foram semeadas em placas de 24 poços com 0,125% de meio FBS para 24 horas e, em seguida, com 10% de meio FBS contendo Fluspirileno em concentrações 3, 10 e 30

μ

M. Seguindo as instruções do fabricante para quantificar as células apoptóticas, a ocorrência da apoptose foi determinada por coloração das células com ambos anexina V e iodeto de propídio (PI) (Life Technologies). Resumidamente, as células foram tripsinizadas com 0,25% de tripsina na ausência de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA). As células foram lavadas duas vezes com PBS e ressuspensas em 500

μ

l de tampão de ligação a uma concentração de 2 x 10

5 – 10

6 células /ml. Dois microlitros de anexina V-EGFP e 5

μ l de

PI foram adicionados à suspensão seguido de 5 a 15 minutos de incubação no escuro. As células foram então analisadas utilizando citometria de fluxo (CyFlow Espaço /Partec, Alemanha).

Western blotting

células

HepG2 e Huh7 foram plaqueadas em placas de 6 poços, com meio com FBS a 0,125% durante 24 horas e, em seguida, com 10% de FBS contendo meio Fluspirileno na concentração de 3, 10, 30

μ M.

As células foram recolhidas após 6 horas de incubação. As células foram lisadas com tampão RIPA contendo PMSF 1 mM e um cocktail inibidor de protease a 4 ° C durante 30 minutos. Após centrifugação a 13.000 rpm durante 15 minutos, os sobrenadantes foram recuperados e a concentração de proteína foi medida pelo kit de ensaio de proteína BCA (Thermo). Quantidades iguais de lisados ​​celulares foram resolvidas em 10% SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose (Sigma). Após o bloqueio, as membranas foram incubadas sequencialmente com os anticorpos primários e secundários diluídos apropriados. As proteínas foram detectadas por o sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (Amersham, Piscataway, New Jersey, EUA). Para assegurar a igualdade de carregamento das amostras, as membranas foram re-sondado com um anticorpo anti-GAPDH (Cell Sinalização Technologies).

tratamento Fluspirileno

in vivo

BALB /ratinhos nus C, durante 4 a 5 semanas de idade de Vital River Laboratory Technology Co. Ltd, de Pequim, China, foram mantidos sob condições específicas livres de patógenos. Para o ensaio de crescimento de tumor xenoenxertado, 1 × 10

6 /0,2 ml de PBS células Huh7 foram injectados por via subcutânea no flanco direito dos ratos. O tamanho do tumor foi medido todos os dias. Três semanas após a inoculação, quando os tumores cresceram até um volume de 80 a 100 m

3, os ratos foram divididos aleatoriamente em grupos de cinco ratinhos por grupo, e alimentados por sonda esofágica oral com 0,5% de CMC-NaCl contendo Fluspirileno (15mg /kg) e por injecção intraperitoneal de 5-fluorouracilo (10 mg /kg) por dia, durante 21 dias. volumes de carcinoma foram medidos a cada 3 a 4 dias após o aparecimento do tumor. O volume do tumor foi calculado pela fórmula

V

=

ab

2/2, onde

a

é o eixo mais longo e

b

é mais curto eixo. Os ratinhos foram depois sacrificados por deslocamento cervical.

A análise estatística

Os resultados foram obtidos a partir de pelo menos três experiências diferentes e expressos como média ± DP. A análise estatística foi realizada pelo teste t de Student e as diferenças foram consideradas estatisticamente significativos se p 0,05. resultados estatisticamente significativos são marcados com o símbolo * nas figuras.

Resultados

Resultados Redocking

Para os complexos CDK2 44, os ligantes co-cristalizado foram ancorado contra a sua correspondente estrutura CDK2 para ver se idock poderia prever poses de ligação como conformacionalmente próximo ao posar como possível co-cristalizado. Tal precisão redocking foi quantificada pelo desvio quadrático médio (RMSD) das poses previstos a partir da co-cristalizado representar. Para cada um dos 44 complexos, idock previu nove poses, portanto, nove valores RMSD. Os valores RMSD dos nove coloca nos 44 ensaios redocking são fornecidos na Tabela S2.

Figura 1 representa a distribuição dos valores de RMSD a primeira postura (denotado como representar 1), que foi previsto para ter o menor energia livre entre as nove coloca, assim como a distribuição de valores RMSD da postura que tem a RMSD mínimo entre as nove coloca (denotado como o pose m). explicação detalhada e as razões da selecção destes dois tipos de poses pode ser encontrada em [6]. Semanticamente, o valor RMSD de representar 1 (indicado como RMSD1) eo valor RMSD de postura m (denotado como RMSDm) refletem a precisão redocking se apenas o de cima e de cima nove previu poses são considerados, respectivamente. Por definição, RMSDm ≤ RMSD1 é sempre garantida. Fora dos 44 ensaios redocking, 10 ensaios produzidos RMSD1 2A e 28 ensaios produzidos RMSDm 2a. Estes resultados redocking refletem em certa medida, a adequação do uso idock para atracar compostos contra estruturas CDK2.

As distribuições RMSD de representar 1 e posar m são mostradas em preto e vermelho, respectivamente. 10 e 28 pontos estão abaixo da linha de base de RMSD = 2a de postura 1 e posar m, respectivamente.

Resultados de encaixe Ensemble e selecção dos candidatos a inibidores

Totalmente 4.914 medicamentos aprovados pela FDA foram encaixado e classificados de acordo com sua média prevista afinidade de ligação através de 44 estruturas cristalinas de raios-X de CDK2. Os seus valores de energia livre preditos são fornecidos na Tabela S3. Os resultados de previsão de encaixe com visualização iview [16] estão disponíveis gratuitamente na https://istar.cse.cuhk.edu.hk/idock/iview/?1GZ8-dbap e https://istar.cse.cuhk.edu.hk /idock /iview /? 1GZ8-fda.

Figura 2 representa graficamente a distribuição da pontuação média idock dos 4.914 compostos. 15 compostos tinham previsto energia livre de -10 kcal /mol ou menos, sendo o melhor ter -10,46 kcal /mol. Com base na disponibilidade comercial, 9 compostos de maior pontuação (Tabela 2; Fig 3; S4 tabela) foram adquiridos para futuras investigações

842 e 783 compostos estavam nas faixas de [-7,5, -8,0) e [. ,,,0],-7,0, -7,5), respectivamente, constituindo os dois maiores lixeiras. 15 e 63 compostos foram nas faixas de [-10.0, -10.5) e [-9,5, -10,0), respectivamente, constituindo as duas caixas apropriadas para seleção de candidatos drogas.

Este valor foi criado por RDKit (https://rdkit.org/).

Fluspirileno diminuiu a viabilidade celular de carcinoma hepatocelular

o primeiro avaliou o efeito anti-câncer dos nove compostos de ensaio de MTT (Fig 4). Todos os nove compostos diminuiu a viabilidade celular em células HepG2 e Huh7, mas teve citotoxicidade discrepantes em diferentes concentrações. Entre eles, Fluspirileno teve a menor IC

50, ou seja, 4.017

μ

M para HepG2 e 3.468

μ

M para Huh7. Fluspirileno exibiu a mais alta citotoxicidade em comparação com o controlo com significância estatística (p 0,05). Tal efeito de inibição era dependente da dose e do tempo. inibição acentuada foi observada em 10

μ

M e 30

μ

M, mas não se observou efeito significativo em concentrações abaixo de 3

μ

M.

(a) os nove compostos tinham citotoxicidade discrepante de linhas de células HepG2 e Huh7 em diferentes concentrationas, com Fluspirileno exibindo a maior citotoxicidade em comparação com o controlo (p 0,05). (B) Fluspirileno exibiu inibição da dose e dependente do tempo sobre a viabilidade celular em linhas de células HepG2 e Huh7 em comparação com o controlo (p 0,05).

tratamento Fluspirileno preso ciclo celular na fase G1

para entender se Fluspirileno inibida atividades CDK2 em células de carcinoma hepatocelular, analisamos o efeito do tratamento Fluspirileno com concentrações de 3, 10, 30

μ

M para 6, 12, 24 horas no ciclo celular perfil em células HepG2 e Huh7 por citometria de fluxo (Fig 5). Fluspirileno tratamento aumentou significativamente a percentagem de células em fase G1 em comparação com o controlo (p 0,05) de um modo dose e dependente do tempo. Em 30

μ M ou

10

μ M

concentração, tratamento Fluspirileno aumentou continuamente a percentagem da fase G1 durante 24 horas. Após 24 horas de tratamento Fluspirileno, o aumento da fase G1 foi acompanhado pela redução simultânea da fase S. As percentagens sub-G1 são fornecidos na Tabela S5. Os histogramas representativos de conteúdo de DNA são fornecidos na Fig S5.

(A) Fluspirileno dose e tempo de tratamento aumentou de forma dependente da percentagem de células em fase G1. Em 30

μ M ou

10

μ M

concentração, tratamento Fluspirileno aumentou continuamente a percentagem da fase G1 durante 24 horas. (B) distribuição do ciclo celular 24 horas após tratamento Fluspirileno. O aumento da fase G1 foi acompanhado pela redução simultânea da fase S.

Fluspirileno tratamento induziu apoptose de células

Um medicamento que só pode induzir a paragem do ciclo celular não é bom o suficiente, porque os tumores será fácil voltar a crescer após a retirada da droga. Portanto, nós também investigou se Fluspirileno poderia induzir a apoptose de células (Fig 6). Fluspirileno tratamento em 30

μ M ou

10

μ

concentração M aumentou significativamente a percentagem de apoptose em linhas de células Huh7 e HepG2 em comparação com o controlo de uma forma de dose e dependente do tempo (p 0,05). Os gráficos de dispersão de PI contra a anexina V são fornecidos em S6 Fig.

Fluspirileno tratamento em 30

μ

M ou 10

μ

concentração M aumentou significativamente a percentagem de apoptose em linhas de células Huh7 e HepG2 em comparação com o controle de uma maneira dose e tempo-dependente (p 0,05).

tratamento Fluspirileno diminuiu as expressões de CDK2, Rb, ciclina e, pho-CDK2 e Pho-RB, mas não ciclina D1 e ciclina B1

investigou-se o efeito de Fluspirileno sobre as expressões de proteínas críticas envolvidas na transição G1 para S em células HepG2 e Huh7 por western blotting (Figura 7) . Fluspirileno tratamento reduziu as expressões de CDK2, Rb, Pho-CDK2, Pho-Rb e ciclina E. Em contraste, os níveis de ciclina D1 e ciclina B1 de expressão manteve-se inalterada. Estes resultados são consistentes com o que se espera de um inibidor de CDK2.

tratamento Fluspirileno diminuiu as expressões de CDK2, Rb, ciclina E, pho-CDK2 e pho-Rb, mas não ciclina D1 e ciclina B1.

observa-se também que o tratamento Fluspirileno majoritariamente diminuiu a expressão em vez de fosforilação de CDK2. Propomos que essas diferenças são razoáveis ​​no sentido de que após a ligação, os complexos CDK2-Fluspirileno pode sofrer diretamente degradação, portanto, resultando em uma maior redução da expressão CDK2 de fosforilação. Além disso, pode ligar-se a Fluspirileno CDK2 com uma elevada afinidade, mas depois de CDK2 é fosforilada, a ligação de Fluspirileno pode ser prejudicada e a afinidade de ligação pode, assim, ser enfraquecida.

O tratamento diário oral, Fluspirileno o crescimento do tumor reduzido

in vivo

Foi avaliado o efeito da Fluspirileno no crescimento de carcinoma hepatocelular

in vivo

em ratinhos nus BALB /C subcutaneamente injectados com células Huh7 (Fig 8). No 21 ° dia após o tratamento, Fluspirileno (15 mg /kg) resultou numa redução significativa do peso do tumor e o volume em comparação com o controlo (p 0,05), ao mesmo tempo que não houve alteração significativa para o peso corporal. A actividade anti-tumoral de Fluspirileno por via oral (15 mg /kg) era comparável ao de 5-fluorouracilo (10 mg /kg). Importante, a terapia combinada exibiu o maior efeito terapêutico. Estes resultados sugerem, pela primeira vez que Fluspirileno é um potencial inibidor de CDK2 e uma droga candidata anti-cancro para o tratamento de carcinoma hepatocelular humano.

A actividade anti-tumoral de Fluspirileno por via oral (15 mg /kg) foi comparável ao do 5-fluorouracilo (10 mg /kg). Além disso, a terapia cocktail exibiu efeito terapêutico sinérgico

A análise estrutural da conformação de ligação previsto de Fluspirileno

Figura 9 representa graficamente a conformação prevista de Fluspirileno em complexo com CDK2 (PDB ID.: 1GZ8) usando iView [16]. Fluspirileno foi previsto para ligar dentro do bolso de ligação de ATP de CDK2 e interagir com CDK2 principalmente através de ligações de hidrogênio, contatos hidrofóbicos e catiónica

π

interações. Putativamente, o átomo H8 forma uma ligação de hidrogénio com o oxigénio espinha dorsal de Ile10, e o átomo de H32 forma mais duas ligações de hidrogénio com o oxigénio espinha dorsal de Leu83 e His84. As cadeias laterais de Ile10, Ala31 e Leu134 estabelecer um túnel hidrofóbico para a cauda hidrófoba de Fluspirileno para enterrar dentro. Um dos dois anéis aromáticos localizados na cauda de Fluspirileno forma um catiónica

π

interacção com a cadeia lateral carregada positivamente de Lys33. Todas estas ligações de hidrogênio putativos, contatos hidrofóbicos e catiónica

π

interações estão espalhados ao longo dos fragmentos de cabeça, média e cauda de Fluspirileno, assim, segurando firmemente Fluspirileno na sua posição prevista e orientação. Em comparação, o conhecido inibidor de CDK2 2-amino-6- (3′-metil-2′-oxo) butoxypurine (MBP nome de código para abreviar), que é um O (6) -substituído derivado de guanina, é conhecido para estabelecer hidrogénio quatro vínculos com Lys33, Glu81 e Leu83 (S2 Fig).

resíduos CDK2 são prestados como linhas coloridas por tipo de átomo. Fluspirileno é processado como varas coloridas por tipo de átomo. Os átomos que interagem e resíduos são rotulados. O ciano, verde e rosa linhas tracejadas representam ligações de hidrogênio, contatos hidrofóbicos e

¸

interações, respectivamente. Esta figura foi criada pelo iview [16].

Nós inspecionados ainda mais a conformação prevista de Fluspirileno na presença de superfície molecular CDK2 (S3 Fig). Em comparação com o derivado de guanina MBP (Fig S4), Fluspirileno ocupa uma parte muito maior da bolsa de ligação, e a sua forma corresponde adequadamente a da cavidade de ligao. Com base nesta análise estrutural em conjunto com a nossa

in vitro

e

in vivo

experimentos, inferimos que Fluspirileno podem ligar-se fisicamente para CDK2.

Discussão

o progresso do ciclo celular e é sequencialmente processada estritamente através das interacções de CDKs e ciclinas [17]. Diferentes complexos de ciclina-CDK são activados em diferentes fases do ciclo celular. Quando o ciclo celular atravessa G1 para a fase S, a ciclina D1-CDK4 /6 e a ciclina E-CDK2 complexos são ordenadamente activado e a proteína do retinoblastoma (pRb) é hiper-fosforiladas em serina e treonina [18]. O pRB hiper-fosforiladas promove a libertação de factores de transcrição E2F, o qual, por sua vez facilitam a transcrição de numerosos genes necessários para a transição G1 para S e progressão da fase S [19]. Do ponto de vista medicinal, CDK2 tem sido um alvo clássico e importante para a terapia do cancro.

Apesar de uma série de inibidores de CDK2 entraram fases de ensaios clínicos, nenhum foi oficialmente aprovada para uso clínico, provavelmente por causa de sua toxicidade e especificidade de multi-alvo. Dado o obstáculo que o desenvolvimento de uma nova droga

de novo

é um empreendimento trabalhoso e caro, redirecionando drogas velhas livre de toxicidade para novas utilizações é uma estratégia favorável.

A poderosa sinergia de

em métodos in silico

em reaproveitamento de drogas por triagem virtual baseada em estrutura (SBVS) foi destaque em várias publicações recentes [20]. Para citar alguns casos de sucesso Repurposing por SBVS, [21] redescoberto ácido acético 2,4-diclorofenoxiacético, uma auxina planta bem conhecida, como um novo agente anti-inflamatório através de

in silico

estudos de modelagem e de docking molecular juntamente com a formulação de drogas e

in vivo

inspecção anti-inflamatório; [22] tentou adaptar fármacos aprovados pela FDA por uma abordagem integrada SBVS e relataram a descoberta de piperacilina 1 como um inibidor da enzima activadora NEDD8 (NAE) em sistemas isentos de células e à base de células com elevada selectividade.

Além de SBVS, triagem virtual baseado em ligante (LBVs) também encontra suas aplicações bem sucedidas no reaproveitamento. [23] utilizado Ultrafast reconhecimento de formas (RSU) [24] para procurar compostos com forma semelhante a um inibidor previamente relatada da proteína arginina desiminase de tipo 4 (PAD4), um novo alvo terapêutico para o tratamento da artrite reumatóide, e identificada uma nova composto que tem uma estrutura muito diferente do inibidor modelo ainda mostrou inibição significativa sobre a atividade enzimática da PAD4.

Encorajado por essas histórias de sucesso, neste estudo adotamos a estratégia de reorientação, e utilizados a metodologia computacional de SBVS por encaixe por ligando proteína à sua lista candidatos de fármacos de moléculas pequenas aprovados pela FDA. Especificamente, usamos nosso programa de encaixe rápido idock [5, 6] em combinação com a nossa iview visualizador conveniente [16] para a tarefa de redescobrir medicamentos existentes como inibidores CDK2. idock é um desenvolvimento interessante não só porque tem sido demonstrado vigorosamente [6] para superar o software de encaixe state-of-the-art AutoDock Vina [25] em termos de velocidade de encaixe, pelo menos, 8,69 vezes e, no máximo, 37,51 vezes, mantendo taxas de sucesso redocking comparáveis, mas também porque é livre e de código aberto sob uma licença permissiva. As últimas garantias que os usuários de ambas as empresas e as universidades podem utilizar livremente idock em seus próprios projetos que requerem acoplamento proteína-ligante.

Para facilitar a utilização de idock, seus argumentos de entrada e resultados de saída foram propositadamente concebido para ser semelhante aos de AutoDock Vina, portanto, os usuários existentes podem facilmente trânsito para idock e beneficiar de aumento de velocidade considerável no desempenho SBVS. Além disso, para promover potenciais SBVS por idock, um servidor web chamado istar [6] foi desenvolvida e disponibilizada gratuitamente na https://istar.cse.cuhk.edu.hk/idock, onde existem tantos como mais de 23 milhões compráveis pequena molécula compostos pronto para o encaixe contra qualquer proteína fornecida pelo usuário. Desde 1 de Maio de 2015, houve mais de 1000 envios de trabalhos de encaixe por usuários de 98 países. Ambos idock [5] e istar [6] poderia vir a complementar os esforços dos medicamentos químicos em pesquisa de descoberta de drogas. Além para fins de pesquisa, algumas universidades também utilizar o nosso idock para o ensino de propósito em seus cursos de bioinformática.

Em relação aos dados estruturais em uso, até agora, existem tantos como 346 estruturas cristalinas de raios-X resolvidos de CDK2 com um UniProt ID de P24941 (S1 Tabela). Para levar em conta a variabilidade estrutural e ao meu conhecimento a partir de múltiplas estruturas de CDK2, foram selecionados 44 estruturas holo de CDK2 em um estado ligado a um ligando no complexo para realizar encaixe ensemble. A pontuação final utilizada para priorizar compostos foi propositadamente concebido para ser a pontuação média desse composto quando acoplado aos 44 estruturas selecionados de CDK2 com seus ligando removido manualmente antes de encaixe co-cristalizado.