Abstract

Os xenoenxertos de cancro colo-rectal humano (CRC) em camundongos imuno-deficientes têm grande potencial para acelerar o estudo da biologia do tumor e terapia. Foram avaliados xenotransplantes estabelecidas em NOD scid //IL2Rγ nulo dos tumores primários ou metastáticos de 27 pacientes com CRC para estimar a sua capacidade de expansão de células tumorais para

in vitro

estudos e avaliar quão fielmente eles recapitulou o perfil transcricional dos seus tumores parentais. análise de RNA-SEQ de tumores humanos CRC parentais e seus derivados xenoenxertos demonstrado que as alterações da transcrição reprodutíveis caracterizar o tumor humano a transição de xenotransplante murino. Na maioria, mas não todos os casos, o estroma, vasculatura e elementos hematopoiéticos humanos foram sistematicamente substituídos por análogos de murino, enquanto o componente de carcinoma persistiu. Uma vez estabelecida como xeno-enxertos, CRC células humanas que podem ser propagadas por transplante em série permaneceu estável transcricionalmente. Três xenoenxertos histologicamente atípicos, estabelecidas a partir de pacientes com metástases peritoneais, continha elementos estromais humanas e abundantes vasos sanguíneos para além de células de tumores humanos. Os transcriptomes destes xenoenxertos tumor /estromais mistos não se assemelham aos dos seus tumores parentais, e as tentativas de propagar tais xenotransplantes por transplante de série foram infrutíferas. foi observada a expressão estável de numerosos genes previamente identificados como alvos de alta prioridade para a imunoterapia em linhagens mais de xenotransplante. Também foi observada expressão aberrante em células de CRC dos genes humanos que são normalmente apenas expressos em células hematopoiéticas. Nossos resultados sugerem que as células CRC humanos expandidas em xenoenxertos murino têm grande utilidade para estudos de Imunobiológicos tumor e terapias específicas, como a imunoterapia, mas também identificar potenciais limitações

Citation:. Chou J, Fitzgibbon MP, Mortales C-LL, Towlerton AMH, Upton MP, Yeung RS, et al. (2013) fenotípica e transcricional Fidelity de Colon Patient-Derived Cancer xenoenxertos em ratinhos imunodeficientes. PLoS ONE 8 (11): e79874. doi: 10.1371 /journal.pone.0079874

editor: Siu Tim Cheung, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 22 Abril 2013; Aceito: 26 de setembro de 2013; Publicação: 20 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado em imunologia do cancro do Instituto Irvington do Instituto de Pesquisa do câncer (JC) (www.cancerresearch.org), o Fundo Edson Orin J. para imunoterapia, uma concessão Clínica Cientista no Translational Research (# 1007475) a partir de o Fundo Burroughs Wellcome (EHW) (www.bwfund.org), uma concessão do Departamento de Defesa (W81XWH-12-0349) (MPF e MWM) (cdmrp.army.mil), e subvenções do NCI /NIH: SAIC contrato # HHSN261200800001E (MPF e MWM), U01 CA176270 (MWM e EHW), e DK56465 P30 (para B. Torok-Storb) (www.nih.gov). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

recentemente ressecados cancros colorectais primários e metastáticos (CRC) [1], [2], assim como muitos outros tipos de hematológicas e tumores sólidos humanos, pode ser estabelecida como xeno-enxertos em ratinhos imunodeficientes, tais como o NOD /

scid

/IL2Rγ – /- (NSG) tensão e propagada a longo prazo através de transplante de série. xenotransplantes CRC fornecer um sistema modelo atractivo para estudar a biologia do tumor e terapia. Em contraste com as linhas celulares de CRC estabelecidas a partir de tecidos cirúrgicos frescos muitas vezes perdem características importantes dos seus tumores humanos parental uma vez que eles se adaptaram a, e foi propagada em,

in vitro

cultura, derivado do paciente xenotransplantes CRC reproduzir muitos dos fenotípicas e genotípicas características dos tumores parentais a partir dos quais eles são derivados [1] – [17]. Análise do derivado do paciente xenotransplantes CRC foi profundamente avanço do entendimento da arquitetura do tumor, a heterogeneidade e outros aspectos críticos da biologia do tumor. xenotransplantes CRC também têm excelente potencial para uso como sistemas modelo no qual a explorar a terapia com agentes quimioterapêuticos [9] – [13], [17], bem como novas formas de tratamento CRC-alvo, tais como imunoterapia [11], [17], [18]. Além disso, a capacidade para propagar CRC humana em ratinhos imunodeficientes pode potencialmente proporcionar uma fonte renovável de células de CRC para utilização em

In vitro

estudos.

As diferenças entre os tumores humanos CRC e os seus derivado xenoenxertos, no entanto, não existe. Mais significativo é a observação consistente de que xenoenxertos de CRC são suportados por murino, em vez de humano, estroma [7], [9], [15], [16]. Consequentemente, xenotransplantes CRC oferecer uma oportunidade para avaliar o transcriptoma de células de carcinoma humanos separadamente de seu estroma humano de apoio. análise da transcrição profunda de xenoenxertos CRC pode, portanto, ajudar com a interpretação de análises de transcrição publicados de tumores CRC humanos recém-ressecados, que representam uma mistura de ambos estroma humano e carcinoma [19], [20]. A medida em que a interacção com estroma murino e influências vasculatura perfil transcricional das células tumorais humanos no xenoenxerto não foi examinado até à data com os métodos que permitem a discriminação inequívoca entre transcritos humanos derivados de células tumorais e de transcritos de murino derivadas do estroma e vasculatura. Por isso, realizou um estudo abrangente da morfologia e da transcrição perfis de um painel de xenoenxertos estabelecidos em camundongos NSG de cancros do cólon humanos primários e metastáticos recém-ressecados, para avaliar a fidelidade com que os xenotransplantes recapitulou os perfis de transcrição e características moleculares únicas do pais tumores humanos de onde derivam. A análise foi realizada de transcrição com ARN-SEQ, que permite a determinação da origem humana ou de murino de transcritos com um elevado grau de confiança. Para avaliar a estabilidade destas características através de transplantação em série, que também realizada uma análise detalhada da transcrição de uma linhagem de xenoenxerto, que foi criado a partir de um único tumor do cólon humano primário e, subsequentemente, tem sido propagado através de dez gerações de destinatários NSG. Nós determinamos que os xenotransplantes de tumores do cólon humanos é caracterizada por alterações biológicas e reprodutível de transcrição que caracterizam a transição humano para murino, que na maioria dos casos para seleccionar uma população de tumores transcricionalmente estável suportado por estroma murino e vasculatura. Além disso, foram identificados conjuntos de genes expressos seletivamente no epiteliais (carcinoma) ou componentes do estroma de xenoenxertos CRC.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

amostras cirúrgicas de primário ou câncer colorretal metastático foram obtidas de doadores identificados-de através da Rede Cooperativa de Tecidos Humanos (CHTN, da Universidade Vanderbilt, Nashville, TN), ou de assuntos que estão sendo tratados na Universidade de Washington (UW) Medical Center (Seattle, WA), que deu por escrito consentimento informado de acordo com um protocolo aprovado pelo Institutional Review Board do Cancer Research Center UW /Fred Hutchinson (FHCRC) Cancer Consortium. Investigação de amostras humanas foi realizado de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki. Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações encontradas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, 8

th Edition (National Research Council, National Academies Press). O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal do FHCRC. Todos cirurgia foi realizada sob anestesia tribromoethanol, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

transporte e processamento de amostras de tecido

tumor metastático recentemente ressecados e /ou tumor primário espécimes de cancro colorrectal obtido a partir da CHTN (23 doentes originais, 24 espécimes) ou localmente (27 doentes originais, 33 espécimes) foram colocados no meio de transporte que consiste de meio DMEM /F12 (Hyclone), complementado com 10 ug /mL de ciprof loxacina (Bayer), 1% de penicilina /estreptomicina ( 10.000 U /mL de penicilina, 10 mg /ml de estreptomicina) (Invitrogen), e 0,5 ug /mL de anfotericina B (Invitrogen). Eles foram enviados durante a noite no gelo para o processamento do dia seguinte (tumores CHTN) ou transportados dentro de uma hora para o processamento no mesmo dia (tumores UW). As pequenas porções de cada tumor foram rapidamente congelados ou colocado em RNAlater (Life Technologies) e também colocados em formalina. O balanço de cada tumor foi lavado com solução salina tamponada com fosfato (Invitrogen), em seguida, reduzido a uma suspensão de células individuais através de disrupção mecânica, e a digestão enzimática ao longo de 1-2 horas o meio de transporte em DMEM /F12 suplementado-base com 4,66 ug /ml de heparina de sódio (Sigma), 2% de suplemento B27 (Invitrogen), e 5% de substituição KnockOut soro (Invitrogen), 1 mg /mL de colagenase I (Sigma), 0,1 mg /mL de hialuronidase, e 0,1 mg /ml de DNase I (Worthington Biochemical) . células digeridos foram lavadas com meio isento de enzima e ressuspensas em 30-50 mL de Matrigel (BD Biosciences), antes da injecção.

xenoenxertos primárias foram estabelecidas através da injecção de suspensões de células individuais (1 × 10

4-2 × 10

6 células) preparadas a partir de amostras de cancro colo-rectal, quer sob a cápsula do rim [21] (a partir de n = 14 doentes originais) e /ou por via subcutânea nos flancos (n = 46 doentes) de 6-12 semanas de idade do sexo masculino ou subletal feminina γ irradiados (250 cGy a 20 cGy /min) ratos NSG levantadas na Cancer Research Center Fred Hutchinson. O intervalo entre a injecção e a ressecção cirúrgica do rato foi 24-30 horas para os tumores do cólon obtidos a partir do CHTN e 3-6 horas para tumores obtidos localmente. Cinco amostras de tumor digeridos foram enriquecidas para CD133

+ células antes da injecção, utilizando contas magnéticas conjugadas com anti-CD133 anticorpo (Miltenyi Biotec), de acordo as instruções do fabricante. Os ratinhos portadores de tumores progressivamente alargando foram autorizados para sobreviver até que os tumores atingiram um diâmetro de 2 cm, que se manifesta sinais de sofrimento, ou ter sofrido de 20% de perda de peso, altura em que foram sacrificados para a colheita do tumor. Pedaços de xenoenxerto colhidas foram imediatamente flash congelados ou colocado em RNAlater, colocados em formalina para histologia posterior, e colocado no meio de transporte e processados ​​de um modo idêntico ao tumor humano original para o transplante de série para um outro hospedeiro NSG.

imuno-histoquímica e microscopia

fixado em formalina, cortes de tecido embebidos em parafina de amostras de cancro do cólon ressecados ou xenoenxertos foram preparadas para microscopia por coloração com hematoxilina e eosina, ou com anticorpos contra o antígeno leucocitário humano (HLA) de classe I (MBL corporation), antígeno carcinoembrionário (CEA) (Novus), citoqueratina 20 (CK20) (Dako), Ki-67 (Dako), CD31 (Dako), molécula de adesão de células epiteliais (EPCAM) (Novus), E-caderina (Cell Marque ), a morte programada-1 (PD1) (Marca celular), vimentina (Dako), fibronectina (Dako), CD4 (Novacastra), CD8 (Novacastra), e CD3 (Novacastra) de acordo com as instruções dos fabricantes. Os controlos positivos e negativos foram executadas para cada anticorpo. As lâminas foram vistos em um microscópio Nikon E800 Eclipse, e as imagens foram adquiridas com uma câmera Olympus Magnafire SP e software Magnafire (Optronics).

Citometria de Fluxo

A suspensão única célula preparada a partir de um xenoenxerto derivado de D61540.T2 foi corado com Qdot 525 nanocristais (Invitrogen) para a diferenciação de células vivas e mortas, isotiocianato de fluoresceína (FITC) -conjugated anticorpo anti-DP-1 (BD Biosciences), e ficoeritrina (PE) -conjugated anti-CTLA-4 anticorpo (BD Biosciences). Os dados foram adquiridos num fluxo FACSCanto citómetro II (BD Biosciences) e analisados ​​com o software Kaluza (Beckman Coulter).

ARN-SEQ Preparação da Amostra e Sequenciação

O ARN foi extraído de amostras utilizando RNeasy Além disso Mini ou AllPrep ARN /kits de ADN (QIAGEN). A qualidade do ARN foi avaliada num Agilent Bioanalyzer 2100. As amostras com número de integridade do RNA (RIN) superior a 7 foram diluídos para 50 ng /mL para a preparação biblioteca de sequenciamento com o kit de preparação TruSeq Amostra (Illumina). Começando com cerca de 1 ug de ARN total, ARNm foi isolado com grânulos de captura de oligo-dT, então fragmentados e convertido em ADNc com transcrição reversa preparado-hexâmero aleatório e síntese da segunda cadeia. cDNAs resultantes foram fragmentados por ultra-sons e tamanho-selecionados para moléculas de -300 pb. A ligação de adaptadores de sequenciação com código de barras, em seguida, foi realizada de acordo com as recomendações do fabricante. As amostras de ADNc foram submetidos a sequenciação múltipla, com um a quatro amostras por pista, sobre o Ilumina HiSeq 2000, para se obter sequências de gama emparelhado 50 pb. Este processo resultou entre as sequências de 54,6 M e 367,0 M passando os Illumina filtros de controle de qualidade padrão.

Quantitative PCR

As células criopreservadas de P2726.Ov foram processados ​​com um Kit Dead Cell Removal (Miltenyi Biotec) e depois classificados em EPCAM

– e EPCAM

+ fracções com pérolas magnéticas conjugadas a um anticorpo específico-EpCAM humana (Miltenyi Biotec). O ARN foi extraído a partir de cada fracção, e o ADNc foi preparado utilizando oligo-dT e iniciadores aleatórios de hexâmero do kit First Strand cDNA Synthesis (Roche). Os iniciadores 5 ‘e 3’ para a PCR quantitativa (qPCR) foram concebidos utilizando quer qPrimerDepot [22] ou Primer-BLAST [23] (Tabela S1 S4 Ficheiro). Padrão SYBR Green (Roche) qPCR realizadas num ABI Prism 7900HT foi utilizado para detectar transcritos de genes. Os dados de fluorescência foram analisados ​​em LinRegPCR [24], e a concentração inicial estimada (N

0) de cada gene foi normalizado contra o de gene de manutenção

GAPDH. A origem humana de amplicons de PCR de xenoenxertos foi verificada por análise da curva de dissociação.

RNA-seq Data Analysis

Para cada amostra, todos emparelhado lê passam pelos filtros de qualidade foram processados ​​com o splice- TopHat cientes de curto leitura alinhador [25]. Para as amostras de xenotransplante, que empregou uma estratégia de filtragem conservadora simples para separar humano lê, decorrente das células tumorais humanas enxertadas, de rato lê deverá ser amostrados de suporte do tecido murino. Nesta estratégia, TopHat foi usada para alinhar lê tanto para rato (MM9) assembleias genoma de referência humana (hg19) e. Lê que combinava com o genoma humano com maior fidelidade (menos bases descasamento) foram retidos como humano lê. Aqueles que combinava com o genoma do rato com maior fidelidade foram retidos como murino. Lê combinando ambos os genomas com igual fidelidade foram colocados em uma terceira classe “ambígua” e não é considerado ainda mais. Para permitir a comparação útil entre amostras humanas de tumor (gratuito pela construção de contaminar sequências de rato) e xenotransplantes derivados, processamos as amostras humanas através do mesmo processo de filtragem. Menos de 0,2% dos lê a partir dessas amostras exclusivamente humanos foram erroneamente marcados como originários de rato, sugerindo que a nossa estratégia de filtragem tem uma taxa de erro de classificação baixa. A Tabela 1 resume o rendimento de sequenciação, variando de, pelo menos, 5 GB e 30 GB por cima da amostra, juntamente com a percentagem de leituras em cada amostra classificada como humano, ratinho, ou ambígua. são dados de sequenciamento disponíveis no NCBI Sequence Leia Archive (acesso #: SRP028952).

Gene-level ler as contagens foram gerados a partir humano e rato alinhado lê usando o pacote HTSeq (http: //www- huber.embl.de/users/anders/HTSeq). Ler as contagens foram gerados com o script htseq de contagem para cada locus do gene humano e rato em uma união do RefSeq e coleções KnownGenes UCSC associado ao hg19 humana e montagens MM9. Lê completamente contido dentro de qualquer exão de um modelo gene foram atribuídas a esse gene. As contagens de leitura para cada gene foram normalizados, dividindo-os pelo número total de leituras, em milhões, obtidos por essa amostra.

Análise Estatística

A análise estatística foi realizada no ambiente R para fins estatísticos computação e Microsoft Excel. análise de agrupamento hierárquico não supervisionado de dados de expressão gênica foi realizada utilizando o ambiente: R para computação estatística. O aparador pacote 3.0.2 [26] foi usada para identificar os genes que foram diferencialmente expressos em duas ou mais amostras. Tagwise dispersões foram calculados para cada gene utilizando o método do modelo linear generalizado, e testes de razão de probabilidade foram calculados entre pares de conjuntos de amostras. Genes com taxas de detecção de falsas 0,05 após ajuste Benjamini-Hochberg [27] para comparações múltiplas foram definidas como expresso diferencialmente. conjuntos de genes sobre ou sub-representados entre os genes diferencialmente expressos foram identificados utilizando pacote de R goseq 1.10.0 [28], com a via canônica e química e conjuntos de genes perturbações genéticas do banco de dados assinaturas moleculares (MSigDB) v3.0 [29] . O método de distribuição hipergeométrico Wallenius não central foi usada para aproximar a distribuição dos membros do conjunto de genes entre os genes expressos diferencialmente.

curvas de crescimento de tumor foram ajustadas à equação de tempo de duplicação definida como e qualidade do ajustamento medido pela coeficiente de determinação R

2. O teste exato de Fisher bicaudal foi utilizado para comparações de dados categóricos entre dois grupos, enquanto bicaudal teste t de Student foi utilizado para comparações de dados quantitativos entre dois grupos.

Resultados

Experiência com a geração e da Propagação CRC xenoenxertos

uma vantagem de xenotransplante é que potencialmente fornece um método para propagar células CRC indefinidamente e fielmente reproduz o tumor humano parental inicial. Procurou-se elaborar um protocolo que seria mais eficiente realizar este objetivo. Subletal ratos NSG irradiados foram injetados com suspensões de células únicas preparadas a partir de amostras de tumores, sem

in vitro

cultura prolongada intervenção que poderiam selecionar para adaptações não presentes no tumor original humano. Um total de 33 de 57 espécimes cirúrgicos obtido a partir de 27 dos 50 pacientes individuais com qualquer loco-regional e /ou CDC metastático (Tabela S2 na S4 Ficheiro) foram estabelecidos com sucesso como xenoenxertos.

Inicialmente, a injecção de células tumorais CRC enriquecido antes da implantação de células que expressam o CRC putativo haste marcador de células CD133

+ foi comparada com a injecção de grandes quantidades, as células tumorais não separado para estabelecer xenoenxertos porque o primeiro tem sido associada com uma maior probabilidade de o enxerto [1], [2] . Sempre que possível, o número máximo de CD133

+ – células separadas ou a granel, as células não separados podem ser obtidos a partir de um tumor foi injectado, a uma dose de até 2 × 10

6 células. Embora a injeção de 1 × 10

4 CD133

+ – células classificadas em alguns casos foi suficiente para estabelecer um xenotransplante (Tabelas S2 e S3 em S4 Arquivo), as taxas globais de enxerto para CD133

+ – classificadas As células não foram significativamente melhor do que a maior parte, as células não triados (2/5 vs. 25/45, respectivamente). Dado que tanto CD133

– e CD133

+ células de tumores CRC metastáticos têm o potencial para estabelecer xenoenxertos [6], e, a fim de captar a heterogeneidade do tumor humano original, tanto quanto possível, a decisão estava feita para usar células tumorais CRC indiferenciados para o xenotransplante em todos os experimentos posteriores. Também em relação a implantação de células de tumor sob a cápsula renal com a implantação subcutânea, em vista de relatórios publicados de altas taxas de enxerto de células de CRC após a injecção da cápsula de infra-renal [1]. Quando injecções simultâneas de números iguais de células de CRC do mesmo tumor foram feitas no flanco e sob a cápsula do rim de 3 ratinhos diferentes, os tumores subcutâneos resultantes eram muito maiores do que aqueles que se desenvolveu no rim. Além disso, a injecção subcutânea de células no flanco foi associado com uma maior taxa de estabelecimento xenoenxerto do que a injeção subcapsular (3/14 vs. 26/45,

p

= 0,03 por bicaudal teste exato de Fisher) (Tabelas S2 e S3 em S4 Arquivo), e foi associado com menor morbidade e mortalidade precoce, com mortes precoces no ≤1 semana que ocorre em 14 de 30 ratos que receberam injeções subcapsular e 6 de 208 ratos que receberam implantes subcutâneos sozinho (

p

= 0,0001).

com base nestas observações preliminares, injeção subcutânea de massa, células CRC indiferenciados no flanco foi utilizado em todos os experimentos posteriores para estabelecer xenotransplantes CRC. Os xenoenxertos estabelecidos desta forma foram analisados ​​retrospectivamente para as características que podem estar associados com o enxerto preferido. Não houve correlação significativa entre o sucesso enxerto e as características clínicas dos pacientes dos quais foram obtidos tumores (Tabela S4 no S4 Arquivo). sexo dos pacientes do sexo masculino foi associado com uma tendência para o enxerto Superior (

p

= 0,06). O número médio de células injetadas no sucesso e tentativas frustradas de enxertia foi significativamente diferente -1.2 × 10

6 (intervalo: 2 × 10

5-2 × 10

6) células em injeções bem-sucedidas contra 8,8 × 10

5 (intervalo: 1 × 10

4-2 × 10

6) em tentativas falhadas (

p

= 0,04)

xenotransplantes série foram estabelecidos a partir. 18, de 26 de primeira geração, 11 dos 14 de segunda geração, e em 8º de 8 xenoenxertos de terceira geração. Alguns xenoenxertos não foram passadas devido ao pequeno tamanho (≤1 mm de diâmetro), a morte do rato inesperada antes da colheita do tumor, ou a indisponibilidade de beneficiários ratos NSG. Dos 26 enxertos de primeira geração para a qual passagens em série foi tentada, aqueles que tinham demonstrado crescimento exponencial mostrou uma maior taxa de enxerto na segunda geração do que aqueles que não o fizeram (16/20 vs. 2/6, respectivamente,

P

= 0,05), e nenhum dos xenoenxertos que não atingiram o crescimento exponencial pode ser passadas com sucesso para além da segunda geração. Todas as linhas de xenoenxerto que foram passadas para além da segunda geração produziu tumores consideráveis ​​ 5 mm, e pode crescer para o tamanho máximo admissível do tumor de 2 cm. Um tumor primário do cólon (D55949) e um tumor metastático (P2726) foram serialmente transplantadas através de 10 gerações. A amplificação do número de células de tumor humano tornada possível pela xeno foi na maior parte dos casos, pelo menos, 50 vezes a dose da célula original para cada geração, permitindo a expansão rápida e eficaz das células de CRC.

A histologia de tumores e CRC seus xenoenxertos derivativos

a maioria dos xenoenxertos de primeira geração demonstraram morfologia variável glandular com componentes epiteliais e estromais bem definidas, assemelhando-se os tumores parentais humanas (PHTs) de onde foram derivadas (Figuras 1 e Fig S1 Fig S2). expressão homogênea de classe I humano complexo principal de histocompatibilidade (MHC) foi observada em todos os espécimes cirúrgicos CRC avaliados neste estudo, independentemente da sua derivação a partir de tumores primários ou de lesões recorrentes /metastáticos. A expressão de MHC de classe I humano em xenoenxertos de primeira geração, no entanto, mostrou dois padrões distintos. Todos os xenoenxertos de primeira geração derivadas de tumores de cólon primários e de três, todas as derivadas de lesões recorrentes /metastáticos mostraram expressão homogénea de classe I humanas MHC nos componentes epiteliais mas ausência de expressão nos componentes do estroma (Figuras 1 e Fig S1 Fig S2 ), sugerindo que o estroma nestes xenoenxertos era de origem de murino, como foi anteriormente relatado [7], [9]. Estes xenotransplantes será referido como xenoenxertos de carcinoma (CXS). Em contraste, os xenoenxertos de primeira geração derivada de três pacientes diferentes (P2726, P2750 e P2825) eram predominantemente do estroma na morfologia e mostraram expressão de classe I humana de MHC em ambos os seus componentes epiteliais e do estroma, demonstrando que o estroma nestes xenoenxertos foi em menos parcialmente composta por células humanas (Figuras 1 e Fig S3). Todos os três destes pacientes tiveram disseminação peritoneal de sua doença. Estes xenoenxertos do estroma (SXS) foram obtidos a partir das metástases peritoneais de pacientes P2750 e P2825 e do fluido de ascite maligna de P2726 paciente, a partir de cuja metástase do ovário múltiplas linhagens CX com a composição típica de tumor humano /murino estroma também foram gerados. a coloração imuno-histoquímica com anticorpos específicos para vimentina humana, uma proteína do estroma, confirmou a presença de vimentina humana abundante nos três SXS, enquanto que a coloração com anticorpos específicos para E-caderina humanas revelou que as células tumorais epiteliais compreendia uma pequena fracção de células nestes SXS ( As figuras 1 e Fig S3)

Cada linha em (a) -. (C) compreende micrografias das secções de tecido a partir de um único tumor humano parental ou xenotransplante murino. (A) Coluna da esquerda: cortes de tecidos corados com hematoxilina e eosina (H + E). colunas subseqüentes, da esquerda para a direita: cortes de tecidos corados para a classe humana antígeno leucocitário I (HLA-ABC), epiteliais marcador E-caderina, vimentina marcador mesenquimais, PECAM1 marcador endotelial, e marcador de células T CD3. As linhas, de cima para baixo, mostram as características histológicas de tumores humanos parentais de D61540, P2726 e P2750, emparelhado com os xenotransplantes de primeira geração. A histologia do xenoenxerto estroma-predominante desenvolvida a partir de fluido de ascites P2726 também é mostrado na quinta linha; a seta branca na micrografia de E-caderina nesta linha indica um pequeno foco de células tumorais. Pontas de seta na micrografia PECAM1 para o xenoenxerto P2750.Tu.X1 indicam áreas com células PECAM-1-imunorreactivo. Todas as imagens foram obtidas no aumento de 200x. barra branca escala na micrografia superior esquerdo representa 200 m.

A imuno-histoquímica (IHQ) também demonstrou que os vasculatures de CXS e SxS, como acontece com os seus elementos estromais, eram de origem divergente. Um subconjunto de tumores humanos parentais emparelhados com os primeiros xenoenxertos geração foram examinados para a expressão da molécula de plaquetas humano endotelial de adesão celular (PECAM-1, CD31), que é selectivamente expresso em células endoteliais humanas e subconjuntos de células hematopoiéticas. A imunorreactividade para PECAM-1 humano foi observada em todos os PHTs, como esperado, mas não nas suas CXS derivados. Ambos os SXS, no entanto, demonstrou expressão de PECAM-1 humano, embora a distribuição de células de PECAM-1-imunorreactivas humanos no sxs foi um pouco irregular e não perfeitamente recapitular a distribuição de tais células que foi tipicamente observadas nos PHTs ( As figuras 1 e Fig S3). A presença de estroma humano na SxS, mas sua ausência no CXS foi espelhado por um padrão semelhante de expressão CD3 humano. IHC revelou que CXS não o fez, em geral, contém quaisquer células que coraram com anticorpos contra CD3 humana e CD8, consistente com a perda de humano infiltrando CD3

+ e CD8

+ células de seus xenotransplantes derivados. Surpreendentemente, ambos os SXS, no entanto, as células que expressam CD3 humano e CD8 e eram células T humanas residuais com maior probabilidade que tinham sido co-injectados com o inoculo de células tumorais contidas, persistiu nos SXS, e infiltrado nos xenoenxertos mais extensivamente que TIL do PHT (Figuras 1 e Fig S3, e dados não mostrados).

as características histológicas do CXS secundárias e subsequente geração eram, em geral, bastante semelhantes às dos CXS geração precedente a partir do qual eles foram derivados . O componente epitelial da maioria das linhagens CX mantida expressão robusta de ambos EpCAM e CEA através de transplante de série, bem como o número e distribuição de células que expressam Ki-67 estável permaneceu igualmente (Figura S2A). O estroma e da vascularização dessas linhagens CX foram consistentemente negativas para a expressão de classe I humano MHC (Figura S2A), sugerindo que eles estavam estavelmente apoiada por navios de estroma e sangue murino.

Global Análise transcricional do colorretais Tumores e xenoenxertos

ARN-SEQ foi utilizado para definir o ser humano e, para xenoenxertos, perfis transcricionais murino de amostras de cancro de cólon 4 -2 tumores primários e 2 os tumores metastáticos, 11 xenoenxertos estabelecida a partir destas amostras de tumor, e uma amostra do normal cólon adjacente a um dos tumores metastáticos (P2750) (arquivos S1 e S2). Para avaliar a reprodutibilidade da análise de ARN-SEQ de amostras de cancro do cólon e os seus derivados de xenoenxertos, foram comparados os perfis de transcrição das duas metades de um tumor de cólon primário de bissectados D61540 paciente. Esta análise revelou correlação apertado (Pearson coeficiente r = 0,985) entre os níveis de todos os genes humanos em que as duas metades da amostra (Figura 2A) de expressão. Foi observada uma correlação semelhante apertado (r = 0,975) entre os perfis de transcrição das metástases do ovário e do omento sincronicamente ressecados, mas não contíguas do P2726 paciente (Figura 2A).

Gráficos de dispersão exibir as contagens de transcrição normalizados (em contagens por milhão) para genes humanos individuais nas duas amostras que são indicados no

x viajantes – e

y

-axes. cruzes vermelhas indicam genes de limpeza de consenso [50]. genes não-domésticas são indicados por círculos violetas ou triângulos amarelos: Círculos violetas representam genes expressos em algum nível em ambas as amostras, e triângulos amarelos ao longo dos eixos representam genes expressos em uma amostra, mas não o outro. O coeficiente de correlação de Pearson entre todos os genes para cada comparação aos pares é indicado em preto acima do canto superior esquerdo de cada trama; a correlação para o subconjunto de genes de limpeza é indicado em vermelho. A linha diagonal é o locus de pontos para os quais x = y. (A) As comparações de o nível de genes humanos em que as duas metades do tumor colorrectal bissectada a partir D61540 (painel da esquerda) e nas metástases do ovário e do omento de P2726 (painel da direita) de expressão. (B) Comparações do nível de genes humanos expressão em três tumores humanos parentais (D61540.T2, P2726.Ov e P2750.Tu, da esquerda para a direita) e em suas xenoenxertos de primeira geração (D61540.T2.X1, P2726 .Ov.X1, e P2750.Tu.X1). (C) A comparação dos níveis de expressão de genes humanos no xenoenxerto estroma-predominante atípica estabelecida a partir de P2750 e na sua xenoenxerto de primeira-geração. (D) Meio cinética de crescimento de CXS (n = 5) derivada da metástase do ovário e do omento de P2726 (P2726.Mets.X1) estão indicados por losangos pretos ligados pela linha a cheio, em comparação com a cinética de crescimento de derivados de SX o fluido de ascite de P2726 (P2726.As.X1) indicado pelos quadrados cinza conectadas pela linha cinza. Todos os xenoenxertos foram estabelecidas através da injecção de 2 x 10

6 células no flanco de um rato NSG.