Abstract

O GLI (Gli2 GLI1 /) fatores de transcrição têm sido implicados no desenvolvimento e na progressão da cancro da próstata, embora nossa compreensão de como eles realmente contribuir para a biologia destes tumores comuns é limitado. Observou-se que a actividade repórter GLI foi mais elevada em células normais independente de androgénio (PNT-2) e tumorigénica (PC-3, DU145 e) em comparação com células de cancro de próstata LNCaP dependente de androgénios e, por conseguinte, os níveis de ARNm GLI também foram elevados. A expressão ectópica de GLI1 ou o mutante ΔNGLI2 constitutivamente ativa induziu uma morfologia de paralelepípedos-like distinta em células LNCaP que, em relação à primeira, correlacionada com o aumento Gli2 bem como a expressão dos basais /-tronco como marcadores CD44, β1-integrina, ΔNp63 e BMI1, e a diminuição da expressão do marcador de luminal AR (receptor de androgénio). células LNCaP-Gli1 eram viáveis ​​na presença da bicalutamida inibidor AR e a expressão do gene de perfis revelou que o transcriptoma de células LNCaP-Gli1 foi significativamente mais perto DU145 e células PC-3 do que as células de controlo de LNCaP-PBP (vector vazio), como bem como identificar LCN2 /NGAL como uma transcrição altamente induzida que está associada com independência hormonal no cancro da mama e da próstata. Funcionalmente, as células LNCaP-GLI1 exibido um maior crescimento clonal e foram mais invasiva do que as células de controle, mas eles não formam colônias em agar mole ou prostaspheres em suspensão, sugerindo que eles não possuem propriedades de células-tronco inerentes. Além disso, alvo supressão de GLI1 ou Gli2 com siRNA não reverter o fenótipo transformado de células LNCaP-GLI1 nem duplas knockdowns GLI1 /Gli2 ativar AR expressão em DU145 ou PC-3 células. Como tal, no início de segmentação das oncoproteínas GLI pode dificultar a progressão para um estado independente de hormonas, mas uma compreensão mais detalhada dos mecanismos que mantêm este fenótipo é necessário para determinar se a sua inibição irá aumentar a eficácia da terapia anti-hormonal através da indução de uma fenótipo luminal e aumento da dependência de função AR

Citation:. Nadendla SK, Hazan A, Ward M, Harper LJ, Moutasim K, Bianchi LS, et al. (2011) GLI1 Confere alterações fenotípicas profundo sobre células LNCaP câncer de próstata que incluem a aquisição de um Estado independente hormonal. PLoS ONE 6 (5): e20271. doi: 10.1371 /journal.pone.0020271

Autor: James McCubrey, East Carolina University, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de fevereiro de 2011; Aceito: 18 de abril de 2011; Publicado em: 25 de maio de 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Nadendla et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi principalmente (e generosamente), apoiado pelo regime Middlesex University Matched Financiamento (SKN), Ação próstata https://www.prostateaction.org.uk/(SKN e AH: códigos Grant G2007 /55, G2008 /07 e G2009 /30 ) e Barts e The London Charity https://www.bartsandthelondoncharity.org.uk/(GWN). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é o câncer mais comum em homens e, apesar de tumores inicialmente respondem bem ao tratamento anti-hormonal, o fato de que muitos tumores adquirem resistência a esta forma de terapia fornece um grande obstáculo no tratamento de formas avançadas da doença. Embora os factores precisos que iniciam CaP permanecem obscuros, numerosos estudos têm descrito lesões genéticas e os mecanismos de sinalização aberrantes que podem contribuir para a formação e progressão do tumor, e aqueles que ajudam a conferir independência de androgénio são de particular interesse uma vez que podem representar novos alvos para intervenção terapêutica ( revisto em [1]).

Tal como acontece com muitas formas de tumor, o papel das células-tronco cancerosas (CSC) tem recebido atenção considerável na CaP biologia, nomeadamente em matéria de iniciação do tumor, mas também progressão e metástase (revisto em 2]). Como os tumores de próstata apresentam um fenótipo incluindo a expressão AR predominantemente luminal, eles são pensados ​​para derivar células secretoras luminal. No entanto, com base em perfis de CD e expressão de citoqueratina, características basais semelhantes foram identificadas em tumores primários e podem ser aumentadas em tumores e metastático refractário a hormonas [3], [4]. Além disso, as células basais /tronco-como isolados a partir de ambos os tumores primários e linhas celulares de cancro exibir maior tumorigenicidade em experiências de xenoenxerto de rato [5], [6], [7], [8], [9], [10]. Em contraste, Vander Griend et al [11] propôs que a célula de iniciação do câncer pode ser uma célula que expressa AR intermediário que “adquire atividade do tronco-like” e a heterogeneidade da PCA é ainda mais realçada por estudos de modelos de ratos: Wang et al [12] descrita uma população de células estaminais raras luminal (expressando Nkx3-1) que pode dar origem a tumores enquanto que Lawson et al [13] verificaram que as células estaminais epiteliais basais foram transformadas de forma mais eficiente.

hedgehog (hh) sinalização representa a principal via de desenvolvimento que está implicada na formação e progressão de vários tipos de tumores, incluindo as da pele, mama, pâncreas, cérebro e pulmão. sinalização HH, principalmente mediado pela GLI jusante (referindo-se tanto GLI1 e Gli2) fatores de transcrição, está ligada a tumorigénese através da regulação de diversos mecanismos, tais como a proliferação, diferenciação, apoptose, migração /invasão e a manutenção de populações CSC (revisto em [14], [15], [16]).

estudos recentes têm descrito ativação de HH de sinalização na CaP embora os resultados tenham sido muitas vezes conflitantes e o mecanismo (s) pelo qual GLI contribuir para neoplasia não estão bem compreendidos (revisto em [17], [18]). Por exemplo, vários estudos têm defendido que a expressão aumentada GLI1 epitelial promove a formação de tumor [19], [20], [21]. Em contraste, Fan et al [22] observou nenhuma diferença significativa nos níveis de ARNm de SHH ou GLI1 entre tumor e tecido benigno zona combinados e, mais significativamente, que GLI1 foi expressa no estroma, mas não epiteliais, de componentes da HBP e PCA. Em relação ao estado mais avançado da doença, níveis elevados de proteínas SHH e ARNm GLI1 foram descritos em amostras metastáticos e DHH, GLI1 e Gli2 têm sido associados com transformação para um estado refractário a hormonas [21], [23], [24], [25]. Além disso, estudos recentes têm estabelecido uma ligação entre /sinalização GLI e AR HH no dependente de androgénio (AD), a linha epitelial luminal da célula cancerosa próstata LNCaP e demonstraram que GLI1 mantém a viabilidade das células na ausência de actividade de AR [25], [26 ], [27], [28].

Aqui mostra-se que uma elevada actividade GLI é observada em independente de androgénios (AI) DU145 e linhas celulares de cancro da próstata PC-3 epitelial e que GLI1 ectópica promove a independência de androgénio em As células LNCaP, que se correlaciona com a sua transformação para um fenótipo mais característico da DU145 e células PC-3. No entanto, a supressão GLI não promove um fenótipo AD em DU145 ou células PC-3. Como tal, no início de segmentação das oncoproteínas GLI podem impedir a progressão para um estado independente de hormonas, mas esta abordagem não pode melhorar a eficácia da terapia anti-hormonal em células tumorais que perderam expressão de RA e que não são dependentes da sua sinalização para a sua viabilidade .

Resultados

Análise de expressão GLI em células de câncer de próstata

para investigar um papel putativo para GLI no cancro da próstata, determinou-se pela primeira vez o nível de atividade repórter GLI em vários linhas de células de próstata. actividade repórter GLI foi maior no AI DU145 e linhas celulares de cancro da próstata PC-3 em comparação com a linha celular de cancro da próstata LNCaP e AD actividade repórter foi também mais elevada na linha de epitélio normal AI PNT-2 de células de próstata (fig. 1A). Por conseguinte, a expressão de ARNm e GLI1 Gli2 foi mais elevada em todas as linhas celulares de IA em comparação com células LNCaP (Fig. 1B). Como tal, foi analisado o efeito de sobre-expressar o mutante e GLI1 ΔNGLI2 activo sobre a biologia de células LNCaP. O efeito mais marcante de GLI1 ectópica (eGLI1) e ΔNGLI2 relacionadas com a morfologia das células: em contraste com a morfologia fusiforme característica de células parentais ou controlam LNCaP-PBP (vector vazio), dentro de poucos dias as células pós-transdução /colónias com uma morfologia de paralelepípedos-like eram evidentes em células LNCaP sobre-expressar eGLI1 ou ΔNGLI2 (Fig. 1C). Após a seleção de drogas, tanto as células LNCaP-ΔNGLI2 LNCaP-GLI1 e tinha completamente transformada adotar uma morfologia que lembra PNT-2 ou DU145 células (ver Fig. 5A para visualizar a morfologia totalmente transformado). GLI1 ectópica e a actividade da proteína foi confirmada por ΔNGLI2 indução de ARNm PTCH1 (Fig. 1D). Além disso, o ARNm endógeno Gli2 foi induzida em células LNCaP-Gli1 que, inesperadamente, ARNm GLI1 endógeno foi suprimida em células LNCaP-ΔNGLI2 revelando que a mudança morfológica pode ser mediada por Gli2 (Fig. 1E). Como DU145 e PC-3 células expressam altos níveis de GLI1 e Gli2 comparação com células LNCaP (Fig. 1B), optou-se por investigar a biologia das células LNCaP-GLI1.

(A) Análise de GLI actividade repórter da luciferase em diferentes linhas celulares independentes de androgénios e em comparação com a linha celular LNCaP dependente de androgénios. (B) A análise quantitativa por PCR de níveis GLI1 e ARNm Gli2 nas linhas celulares independentes de androgénios e em comparação com as células LNCaP (C) células de paralelepípedo semelhante /colónias surgir em células LNCaP com GLI1 ectópica ou expressão ΔNGLI2 (indicado por setas). (D) Análise de expressão de ARNm de qPCR PTCH1 em células LNCaP-Gli1 e LNCaP-ΔNGLI2. Análise (E) qPCR da expressão de ARNm em células LNCaP Gli2-Gli1 e a expressão de ARNm em células LNCaP GLI1-ΔNGLI2. (F) A morfologia das células LNCaP que expressam EGFP não se altera quando co-cultivadas com células LNCaP-Gli1.

Inicialmente, a actividade repórter GLI foi medida em células LNCaP-Gli1 e mostrou ser a uma nível comparável com células DU145 PC-3 e (Fig. 1B, cf. colunas 2-4). Posteriormente, abordamos se a capacidade de eGLI1 para induzir a morfologia de paralelepípedos, como em células LNCaP foi através de meios autónomos ou se ou não este parácrina exigida /juxtacrine sinalização através de moléculas secretadas por células LNCaP-GLI1. A morfologia das células LNCaP que expressam EGFP não se alterou quando co-cultivadas com células LNCaP-Gli1 revelando que a morfologia de calçada semelhante é induzido de forma autónoma (Fig. 1F). No entanto, não se pode excluir a possibilidade de que a indução da morfologia de calçada semelhante é mediada através dos receptores que são expressos em células de LNCaP-Gli1 (inicialmente com uma morfologia normal) e que se liga posteriormente a moléculas segregadas pelo mesmo (ou outro) LNCaP- GLI1 células que actuam através da sinalização parácrina /juxtacrine

GLI1 confere-andrógeno independência de células LNCaP

a expressão de marcadores epiteliais foi investigada para determinar se o fenótipo luminal das células LNCaP foi alterada por eGLI1.: AR foi fortemente reprimida nas células LNCaP-GLI1 enquanto que o basal /haste-como marcadores CD44, β1-integrina, ΔNp63 e BMI1 foram todos aumentados (Fig 2A.); isto foi confirmado por análise de Western blot para AR e CD44, com um aumento da expressão na superfície celular desta última confirmada por FACS (Fig. 2B e C). Devido à mudança global uniforme na expressão de CD44 que escolheu para empregar a população heterogénea para um estudo mais aprofundado. No que se refere a dependência de androgénio, ao passo que a exposição à bicalutamida inibidor AR potentemente suprimiu a proliferação de células LNCaP-PBP, o aumento do potencial proliferativo de células LNCaP-Gli1 não foi afectada e este foi verificada por meio de citometria de fluxo (Fig. 2D, pistas 1-4 e E ). Portanto, tal como determinado por expressão do marcador epitelial e insensibilidade a bicalutamida, estes dados sugerem que eGLI1 induz regressão (ou diferenciação de) de células LNCaP de uma forma basal /haste semelhante a que é naturalmente independente da sinalização de AR para viabilidade.

(a) análise de qPCR de expressão do marcador epitelial em células LNCaP-Gli1 em relação a células de LNCaP-PBP (NB os dados são apresentados como os logaritmos naturais de modo a indução relativa de CD44 é quase 7000 vezes). (B) Análise de Western blot de expressão AR e CD44 em LNCaP-PBP, LNCaP-GLI1 e células DU145 (setas denotam isoformas CD44 comuns às células DU145 LNCaP-GLI1 e). (C) Análise FACS da expressão de CD44 em células de LNCaP-Gli1 LNCaP-PBP e. (D) Ensaio de Proliferação de comparar e para determinar o efeito de bicalutamida sobre a taxa de proliferação de células LNCaP-Gli1 LNCaP-PBP e, assim como o efeito de AG1478 (inibidor de EGFR) e U0126 (inibidor MEK) sobre esta última. (E) Análise do ciclo celular por citometria de fluxo em LNCaP-PBP e células LNCaP-GLI1 expostos a bicalutamida.

Para aprofundar o assunto, LNCaP-PBP, LNCaP-GLI1, DU145 e PC- 3 as células foram analisadas por microarranjos de DNA: perfis de matriz global revelou que o transcriptoma de células LNCaP-Gli1 era mais semelhante ao DU145 e células do que as células LNCaP-PBP revelando assim a extensão PC-3 em que as células LNCaP-GLI1 mudaram fenótipo ( A Fig. 3A). Em comparação directa com células LNCaP-PBP, a expressão de transcritos de 260 diferiu mais do que 10 vezes (144 e 116 para baixo para cima) em células LNCaP-Gli1 (Fig. 3B e Figuras S1 e S2). classificação funcional destes transcritos produzidos 15 grupos ontológicas incluindo aqueles associados com a biologia do tumor, tais como a adesão célula-célula, a motilidade celular, EMT (transição epitelial-mesenquimal) e independência hormonal (Figura S3); o último grupo incluindo LCN2 (lipocalina 2) e CAV2 (caveolin 2), que foram previamente identificados como parte de uma assinatura comum para independência hormonal no cancro da mama e cancro da próstata [29]. A maioria das 144 aumentou transcritos foram expressos em níveis semelhantes em células LNCaP-Gli1 quando comparado com DU145 e /ou células PC-3 ( diferença três vezes), enquanto que a expressão de 12 transcrições (incluindo LCN2) foi 3 vezes superior em células LNCaP-GLI quando comparado com ambos os tipos de células (Figura S1 e Tabela 1). Reciprocamente, a 116 de diminuição transcritos apenas um, MRPL23, foi expressa . 3 vezes mais baixa em células LNCaP-Gli1 em comparação com ambos DU145 e células PC-3 (Figura S2)

(A) Um estatística comparação de perfis de expressão de gene globais para determinar a percentagem de transcritos que são expressos em níveis significativamente diferentes em LNCaP-PBP, DU145 e PC-3 de células em comparação com LNCaP-GLI1 (Pearson correlação co-eficiente ≥0.7, p 0,05) (B ) mapa de calor denotando transcritos em células LNCaP-Gli1 em que a alteração na expressão é tanto 10 vezes e altamente significativamente diferente quando comparado com células LNCaP-PBP (do estudante

t

-test, p 0,01): listas de painel esquerdo aumentado genes, listas de painel direito, diminuiu genes e DU145 e PC-3 de células são apresentados para comparação (* indica variantes de transcritos do mesmo gene). (C) Análise de Western blot comparando a expressão de certas proteínas de sinalização entre LNCaP-PBP e células LNCaP-Gli1 com DU145 e PC-3 lisados ​​incluídos para comparação. (D) A fosforilação das proteínas do citoesqueleto MLC2 é mediada por ROCHA em células LNCaP-GLI1 (nb o anticorpo para o total MLC não funcionou em nossas mãos).

Além de microarranjo de DNA perfilamento, a extensão da maior activação da via de sinalização foi avaliada por transferência Western em células LNCaP-Gli1. independência hormonal é associada com a activação da via EGFR e embora tenha sido estabelecido que a expressão de ARNm de EGFR não é grandemente aumentada em linhas de células de AI ([29] e os nossos dados de microarray), um forte aumento na expressão da proteína EGFR foi observada em células LNCaP-Gli1 a um nível comparável com DU145 e células PC-3 (Fig. 3C). ERK atividade (quinase regulada por sinal extracelular) também foi aumentada em células LNCaP-GLI1 (Fig. 3C) e inibição farmacológica de EGFR ou ERK suprimida seus altos potencial proliferativo (Fig. 2D, colunas cf. 1, 3, 5 e 6) . No que diz respeito AKT, embora o aumento da actividade está associada com a inactivação mutacional de PTEN em células LNCaP [30], [31], [32], eGLI1 reduzida a um nível comparável com células DU145 sugerindo que há mecanismo (s) que pode ser explorada para evitar a perda desta importante gene supressor de tumor (Fig. 3C). Em relação ao citoesqueleto, as células LNCaP-Gli1 apresentado um aumento de MLC2 (miosina de cadeia leve 2) fosforilação que foi semelhante para ambos DU145 e PC-3 de células (Fig. 3C e dados não mostrados). MLC2 regula o citoesqueleto de actina (incluindo a formação de fibras de stress) e é a própria regulada por MLCK (miosina quinase da cadeia leve) e Rock (quinase Rho-associado); exposição ao Y27632 inibidor ROCHA, mas não o inibidor MLCK ML-7 reduziu MLC2 fosforilação embora este não reverteu a morfologia de paralelepípedos-like de células LNCaP-GLI1 (Fig. 3D e observações não publicadas). Em resumo, estes dados demonstram ainda mais a extensão em que as células LNCaP-GLI1 assemelham DU145 e células PC-3.

células LNCaP-Gli1 não exibem crescimento independente de ancoragem-

HH sinalização /GLI regula normal e populações de células-tronco do câncer e estudos recentes têm descrito como EMT é uma característica inerente de tais células [15], [16], [33]. Curiosamente, apesar da sua morfologia de calçada semelhante, os resultados da micromatriz revelou que induz eGLI1 EMT em células LNCaP (Figura S3). Na verdade, a diminuição da E-caderina e aumento da expressão de vimentina foi confirmada por Western blotting, embora isto não era dependente de EGFR ou MEK-ERK de sinalização [34] (Fig. 4A). Por conseguinte, as células LNCaP-Gli1 eram altamente invasiva por meio de um substrato de Matrigel ™ (Fig. 4B) e eles também exibido um maior crescimento clonal quando semeadas a baixa densidade (Fig. 4C). No entanto, apesar da expressão dos marcadores de ‘stemness »(incluindo CD44, β1-integrina e BMI1), EMT e um maior crescimento clonal (Figs. 2A, 4A e 4C), ao contrário das células de controlo de células LNCaP-Gli1 não formar prostaspheres em suspensão ou colónias em agar mole (Fig. 4D). Para endereçar a possibilidade de que as células LNCaP-GLI1 não proliferam em cultura de 3-D, porque eles não são capazes de se diferenciar para um fenótipo luminal (isto é, por causa da expressão constitutiva eGLI1), células DU145 também foram cultivadas sob as mesmas condições. Não foram observadas colónias em qualquer ensaio com células DU145, sugerindo que AR

– células estão mal clonogénicas in-independente de ancoragem

In vitro

sistemas de cultura (dados não mostrados); este é apoiado por Thiyagarajan et al [35] que observou que DU145 (e células PC-3) foram muito menos proliferativa em ágar mole em comparação com células LNCaP embora alguns o crescimento da colônia era evidente em seu estudo.

(A ) análise Western blot comparando a expressão dos marcadores de EMT e-caderina e vimentina entre as células LNCaP-GLI1 e LNCaP-PBP (NB a redução de e-caderina nas células LNCaP-Gli1 é parcialmente revertida na presença do inibidor de EGFR AG1478 e em menor medida, o U0126 inibidor MEK). ensaio de invasão (B) Transwell comparando o potencial invasivo de células LNCaP-Gli1 LNCaP-PBP e por meio de um substrato de Matrigel. (C) clonogenicidade ensaio de avaliação da capacidade de formação de colónias de células LNCaP-GLI1 LNCaP-PBP e quando semeadas a baixa densidade. (D) o crescimento Anchorage-independente é observada em células LNCaP-PBP mas as células não LNCaP-GLI1 (painel superior – ensaio colónia de agar mole; painel inferior – ensaio prostasphere).

supressão GLI não promove um fenótipo luminal-como em células de câncer de próstata andrógeno-independente

Finalmente, procurou-se determinar se a supressão alvo de GLI foi suficiente para reverter o fenótipo transformado de células LNCaP-GLI1 ou para induzir um fenótipo luminal, como em DU145 ou PC-3 células. A transfecção de células de LNCaP-Gli1 com GLI1 ou Gli2 siRNA não influenciar a morfologia de células de LNCaP-Gli1 nem houve qualquer mudança na expressão de ARNm de AR ou ΔNp63 (Figuras 5A-C e Figura S4A.); isto indica que a conversão fenotípica induzida por eGLI1 em células LNCaP é irreversível e que a manutenção do fenótipo IA não é dependente Gli2. No que diz respeito DU145 e células PC-3, a eficácia de GLI1 knockdowns duplos /Gli2 foi confirmada por uma diminuição da actividade repórter GLI, mas não houve nenhuma alteração na morfologia celular, nem houve qualquer mudança na expressão de ΔNp63 ou AR ARNm (Fig. 5D -F, Figura S4B e observações não publicadas). Nós também empregue o GANT61 GLI inibidor (30 ^ M) [36], mas este foi menos eficaz em suprimir a actividade repórter GLI que RNAi (dados não mostrados). Como tal, embora AI células cancerosas da próstata exibir a expressão do mRNA alta GLI e actividade e eGLI1 é capaz de promover um fenótipo AI em células LNCaP, supressão GLI não promove um fenótipo luminal-like e AD em células de câncer de próstata AI.

(A) A morfologia das células transformadas LNCaP-GLI1 não inverte por transfecção com GLI1 Gli2 ou ARNsi. (B) a análise qPCR de GLI1 e mRNA Gli2 em células LNCaP-GLI1 transfectadas com GLI1 ou Gli2 siRNA. (C) Análise de RT-PCR de ARNm de AR ΔNp63 e em células LNCaP-Gli1 transfectadas com GLI1 ou Gli2 siARN. (D) Análise de qPCR GLI1 e ARNm Gli2 em DU145 e células transfectadas com ARNsi GLI1 Gli2 e PC-3. actividade repórter de (E) GLI é suprimida em DU145 e células transfectadas com ARNsi GLI1 Gli2 e PC-3 (actividade repórter N.B. pode ser influenciado pela expressão Gli3 em células PC-3 [17]). (F) Análise RT-PCR de ΔNp63 e mRNA AR em DU145 e células PC-3 transfectadas com GLI1 e Gli2 siRNA.

Discussão

O papel da sinalização HH provou controversa em CaP biologia; isto inclui debate quanto a se ou não a via contribui para a formação de tumor primário bem como o modo real de sinalização (autócrina ou parácrina). Além disso, tem havido dados contraditórios quanto à existência ou não gli expressão é mediada através de vias canónicas ou não canónicas em linhas celulares de CaP (revisto em [18]). Nós não abordaram a natureza da regulação GLI mas têm demonstrado que as linhas celulares AI níveis mais elevados de ARNm de GLI do que a linha de células de cancro da próstata AD LNCaP e PNT-2, DU145 e monitor de PC-3 Isto correlaciona-se com o aumento da actividade repórter GLI (Figs . 1A e B). O fato de que a expressão GLI1 foi comparável entre 2 PNT células normais e cancerígeno DU145 e PC-3 células foi inesperado, mas em contraste com Karhadkar et al [21], também descobrimos que mRNA GLI1 foi fortemente expresso na próstata primário células epiteliais basais comerciais (PrECs), embora uma comparação fiel para as linhas celulares utilizadas neste estudo não foi possível porque PrECs são cultivadas em meio especialista que não contém soro (SKN e GWN, não publicado). Apesar destas observações, no nível de proteína GLI1 é raramente detectada na camada basal do tecido de próstata humana normal, enquanto que a expressão é mais predominante nas células basais e carcinomas hiperplásicas [20]. Como tal, de uma maneira semelhante à regulação Gli2 [37], embora a expressão de ARNm GLI1 é constante entre as células normais e tumorigénicos, a proteína pode ser estabilizada, neste último (possivelmente através Fused [38]) e isto, juntamente com a Gli2, poderia explicar o aumento na atividade de repórter GLI.

Nossos dados sugerem que GLI1 induz andrógeno-independência em células LNCaP através da sua capacidade para induzir um fenótipo basal-like que está associado com populações de células basais e que é naturalmente independente actividade de AR; isto é apoiado por expressão AR reduzida combinada com um aumento de numerosos basais marcadores /tronco-like. Chen et al [26], também descrito um papel para GLI1 na promoção do crescimento do AI em células LNCaP, mas isto não foi associada a expressão de AR reduzida e pode reflectir o facto de que a expressão eGLI1 foi menor no seu sistema, tal como determinado por um menor vezes de aumento de atividade repórter GLI1. Embora os nossos estudos foram realizados em uma população de células heterogénea, o fenótipo era uniforme e não temos sido capazes de isolar linhas clonais LNCaP-GLI1 que mantêm morfologia normal LNCaP indicando que retroviral eGLI1 promove uma resposta “tudo ou nada”, mas como o nível de GLI actividade repórter foi comparável com DU145 e PC-3 de células, isso indica que o nosso sistema tem relevância biológica. Como eGLI1 medeia a transformação de células LNCaP não foi elucidada, mas podem envolver mecanismos múltiplos: inibição eGLI1 de AR sinalização por si só é pouco provável para iniciar a mudança fenotípica mas, combinada com a sua capacidade para manter a viabilidade celular na ausência de sinalização de ar [27] , [28], esta pode agravar os efeitos do seu papel principal como um activador transcricional.

como notado acima, um aumento da actividade total de eGLI1 GLI em células LNCaP a um nível comparável com DU145 e PC-3 células.