Abstract

O FOXO3 fator de transcrição é um supressor tumoral bem estabelecidos cuja actividade, estabilidade e localização são regulados pela fosforilação e acetilação. Dados anteriores de nosso laboratório demonstraram amplificado tromboxano-A

2 de sinalização foi associada com mau prognóstico em pacientes com câncer de bexiga e superexpressão da tromboxano-A

2 receptor isoforma-β (TPβ), mas não TPα, induzida transformação maligna de células da bexiga imortalizadas

in vivo

. Aqui, descrevemos um mecanismo de TP modulação mediada da atividade FOXO3 e localização por fosforilação e desacetilação em um modelo de célula de cancro da bexiga.

In vitro

ganho e perda de estudos de função realizados em linhas celulares não transformadas, UROsta e SV-HUC, revelou knockdown de expressão FOXO3 por shRNA aumento da migração e invasão celular, enquanto exogenamente superexpressão TPβ levantou basal fosforilada (p ) níveis FOXO3-S294. Por outro lado, a superexpressão de aumentos resistente ERK, FOXO3 mutante reduzida em migração celular UMUC3 e invasão, incluindo a mediada pelo TP agonista (U46619). Além disso, a estimulação das células com UMUC3 U46619 expressão aumentada pFOXO3-S294, que pode ser atenuado por tratamento com um antagonista de TP (PTXA

2) ou inibidor de ERK (U0126). Inicialmente U46619 causou acumulação nuclear de pFOXO3-S294; No entanto, a estimulação prolongada aumentou FOXO3 localização citoplasmática. estimulação U46619 diminuição da actividade geral FOXO3 transcricional, mas foi associada com aumento da expressão de seu alvo pró-sobrevivência, superóxido dismutase de manganês. Os dados mostram também que a estimulação TP aumentou a expressão da desacetilase de histona, a SIRT1, e correspondia à diminuição acetilada-FOXO3. Colectivamente, os dados sugerem um papel para a sinalização TP na regulação da atividade FOXO3, mediada em parte através de fosforilação e desacetilação

Citation:. Sobolesky PM, Halushka PV, Garrett-Mayer E, Smith MT, Moussa O ( 2014) Regulamento do FOXO3 supressor de tumor pela tromboxano-a

2 receptores no câncer urotelial. PLoS ONE 9 (9): e107530. doi: 10.1371 /journal.pone.0107530

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de fevereiro de 2014; Aceito: 19 de agosto de 2014; Publicação: 09 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Sobolesky et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Facilidades de imagem para esta pesquisa foram apoiados, em parte, pelo Cancer Support Center Grant P30 CA138313 ao Cancer Center Hollings, MUSC. O projeto de pesquisa descrito foi em parte apoiada por doações RO1127905CA, UL1TR000062 e UL1RR029882 do National Cancer Institute, National Institutes of Health. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de bexiga é o quinto câncer mais prevalente nos Estados Unidos com carcinoma de células transicionais superficial (TCC) é a forma mais comumente diagnosticado [1]. TCC tem uma alta taxa de recorrência e necessita de dispendiosos follow-ups ao longo da vida, fazendo com que o câncer de bexiga um dos cancros mais caro para o tratamento ao longo da vida de um paciente [2]. Compreender os mecanismos de transformação oncogénica de células uroteliais é essencial para a concepção de terapias eficazes e inovadoras para o tratamento de cancro da bexiga. Nós previamente identificada uma associação inversa entre tromboxano sintase expressão e de sobrevivência de pacientes com câncer de bexiga (TXS), sugerindo um papel para tromboxano prostaglandina (TP) de sinalização na progressão do tumor urotelial [3]. TXS é uma enzima importante que catalisa a conversão da prostaglandina H

2 a tromboxano A

2 (TXA

2). O TXA

2 ligando, por sua vez, activa o receptor TP, promoção da migração celular, proliferação e invasão, que são características chave da transformação celular e a progressão da doença [3], [4], [5], [ ,,,0],6], [7]. Outros estudos indicam um papel para TXA

2 de sinalização na tumorigênese e fenótipos malignos de próstata [8] e cancros da mama [9], [10].

O gene do receptor TP humano codifica duas isoformas, TPα e TPβ [11]. Ambas as isoformas de sete trans-membranas de proteína G de receptores acoplados que diferem apenas no domínio C-terminal [12]. A variação C-terminal permite a cada isoforma de interagir com ambos os mediadores de sinalização idênticos e únicos [13]. A expressão das isoformas de receptores TP é dependente do tecido e tipo celular. Nós relatado anteriormente TPβ sobreexpressão em doentes com cancro da bexiga foi associada com uma diminuição significativa na sobrevivência [14]. Além disso, a sobre-expressão de TPβ, mas não TPα, foi suficiente para aumentar a migração, invasão e proliferação, bem como induzir a transformação maligna de um linha imortalizada não transformada urotelial células [14]. O mecanismo de transformação induzida por TPβ superexpressão permanece desconhecida.

O fator forkhead transcrição box-O3 (FOXO3) regula os processos-chave de sobrevivência celular, incluindo a resistência ao estresse oxidativo, parada do ciclo celular e apoptose através da regulação de seus genes-alvo por exemplo manganês superóxido dismutase (MnSOD), p27

KIP1, ligando Fas (FasL) e Bim [15], [16]. FOXO3 actividade transcripcional pode ser regulada através de modificações pós-traducionais (PTM), tais como a acetilação e fosforilação. A desregulação da actividade FOXO3 e localização tem sido associado com a iniciação e progressão de cancro, assim como a resistência quimioterapêutica [17], [18], [19]. A acetilação do FOXO3 pela histona acetil-transferase de p300 tem sido associada a uma diminuição da actividade FOXO3, aumentou localização citoplasmática, e a degradação do [20]. A desacetilação por desacetilase de NAD-dependente Sirtuin-1 (SIRT1) tem sido demonstrado que regulam diferencialmente alvos FOXO3 por promover a transcrição de p27

KIP1 e MnSOD, ao diminuir a transcrição do BIM e FasL [21]. quinase regulada por sinal extracelular 1 e 2 (/2 ERK1) foi mostrado para fosforilar FOXO3 em -S294, -S344 e -S425, e afetar negativamente a sua função e estabilidade através de murino duplo minuto 2 (MDM2) mediada por FOXO3 degradação [ ,,,0],22]. Enquanto a estimulação da TPβ é conhecida por induzir a fosforilação e ativação de ERK [23], [24], [25], a nosso conhecimento nenhum estudo examinou os efeitos de sinalização TP na modulação FOXO3.

Aqui, nós FOXO3 identificada como um alvo a jusante da via do receptor TP e examinaram os efeitos negativos de sinalização TP no FOXO3 localização e função na linha de células da bexiga, cancro do derivado UMUC3. Curiosamente, a actividade global FOXO3 transcrição foi reduzida após a estimulação agonista TP resultando em redução da expressão de um alvo por apoptose, ainda reforçada expressão de um alvo de resistência ao estresse. De acordo com estudos anteriores [21], a expressão diferencial de metas FOXO3 após a estimulação agonista TP foi associada com aumento da expressão SIRT1 e FOXO3 desacetilada. Tomados em conjunto, este estudo elucida um mecanismo pelo qual TP induzida modulação da actividade FOXO3 através de modificações pós-traducionais contribui para o fenótipo maligno de células uroteliais.

Materiais e Métodos

cultura celular

a linha de células UROsta, gentilmente cedido pelo Dr. Donald Sens (University of North Dakota, Grand Forks, ND) foi obtido a partir de células uroteliais humanos normais e imortalizadas com o antigénio T de SV40 [26]. UROsta células foram mantidas numa mistura 70:30 de meio DMEM (1 g /L de glucose: 4,5 g /L de glucose; Mediatech, VA, EUA), 10% de soro fetal de bovino (FBS). O uroepiteliais humana vírus símio 40 imortalizada (SV-HUC), linha de células uroteliais não transformada foi gentilmente cedido pelo Dr. Santhanam Swaminathan (University of Wisconsin, Comprehensive Cancer Center, Madison, WI) [27], [28], [29] e as células foram cultivadas em meio F12K Khaigns modificados suplementados com 10% de FBS, insulina, hidrocortisona, e transferrina. A linha celular de cancro da bexiga UMUC3 foram obtidas da American Type Recolha e células cultivadas em meio RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA) contendo 10% de FBS Cultura. Cada meios continham 1% de penicilina /estreptomicina. As linhas celulares foram cultivadas a 37 ° C em 5% de CO

2

anticorpos, reagentes e plasmídeos

Os anticorpos seguintes foram usadas de acordo com as recomendações dos fabricantes:. pFOXO3-S294 , pc-jun Ser63, c-Jun, pAKT Ser473, pMAPK Thr202 /Tyr204, Akt, ERK, p300, SIRT1, Bim, p27

KIP1 (Cell tecnologia de sinalização, Danvers, MA, EUA), FOXO3, GFP (Santa Cruz), Lamin B1 (GeneTex, Irvine, CA, EUA) MnSOD (Ciências EnzoLife, Ann Arbor, MI, EUA), α-tubulina (ABD Serotec, Raleigh, NC, EUA), GAPDH (Sigma-Aldrich, St. Louis , MO, EUA). agonista específico TP, U46619 foi comprado de Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI, EUA). ERK1 /2 U0126 inibidor foi adquirido a Sigma-Aldrich. plasmídeo FHRE-luc foi um presente de Michael Greenberg (Addgene plasmídeo # 1789, Cambridge, MA, EUA). O

3A-FOXO3 GFP (serinas-294, -344 e -425 substituída para alaninas) e controlar pEGFP-C

2 plasmídeo foram presentes de Mien-Chie Hung na Universidade do Texas M.D. Anderson Cancer Center. O plasmídeo GFP-TPβ foi um presente de Jean-Luc Pai da Universidade de Sherbrooke, no Canadá.

análise de Western blot

As células foram lavadas com PBS e colhidas em tampão RIPA (Thermo Fisher Scientific ) suplementado com completos Tablets cocktail inibidores da protease e Tablets Cocktail PhosSTOP fosfatase inibidores (Roche Applied Science). As proteínas foram desnaturadas por fervura em tampão de Laemmli (BioRad, Hercules, CA, EUA) e resolvidas por 12% SDS-PAGE. Após a transferência de proteína, a membrana de nitrocelulose foi bloqueada com 5% de leite em TBST 1 × e sondadas com o anticorpo primário em 5% de BSA em 1 × TBST durante a noite a 4 ° C. Após incubação do anticorpo primário, as membranas foram lavadas em 1 × TBST e incubadas com anticorpo secundário ligado a HRP (Cell Signaling Technology) em 1 × TBST. As membranas foram lavadas 5 × durante 5 minutos com 1 × TBST e detecção foi visualizada utilizando SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific). Western blot foram quantificados usando o Image Estúdio Lite Ver. 3.1 seguintes instruções de software e representada graficamente em GraphPad Prism 5.

Transfec�es e geração de clones estáveis ​​

Para gerar clones FOXO3 knockdown estáveis, as células SV-HUC e UROsta foram transfectadas com pRFP-C- RS plasmídeo controle, pRFP-C-mexidos ou pRFP-c-shRNA para plasmídeo FOXO3 (Hush-29; OriGene, Rockville, MD, EUA), utilizando FuGENE 6 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, EUA). Os clones individuais foram seleccionados em meio contendo 2,5 ug /ml de puromicina (Invivogen, San Diego, CA, EUA) e knockdown foi analisada por imunotransf erência usando um anticorpo específico FOXO3 (H-144; SC-11351; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA , EUA). A transfecção de GFP em células-TPβ SVHUC foi realizada com reagente de transfecção TurboFect (Thermo Fisher Scientific), utilizando uma razão de 1,5 ug de ADN de 4 ul TurboFect. células UROsta (1 × 10

6) foram electroporadas com 3,5 ug GFP-TPβ usando Nucleofector caixa de solução kit V da Linha Amaxa celular (cat #: VCA-1003, Lonza, Allendale, NJ, EUA) e 2b Nucleofector dispositivo (Lonza) com o protocolo pré-programado T-030. Quatro horas seguintes meios electroporação foi aspirado, substituído com meio completo, e incubadas a 37 ° C em 5% de CO

2. eficiência de transfecção foi verificada 24 horas após a eletroporação. Para gerar 3A estável GFP-FOXO3

UMUC3 expressar clones, as células de uma placa de 6 poços foram transfectadas utilizando 4 uL de X-tremeGENE HP ADN Transfection Reagent (Roche Applied Science) e o ADN plasmídico de 1,5 ug. clones individuais foram selecionados em meios contendo 500 ug /ml de Geneticina seletiva de antibióticos (Life Technologies, Grand Island, NY, EUA).

A migração celular ensaio

O BD Falcon celular Cultura Inserir Sistema contendo tereftalato de polietileno (PET) membranas com poros de 8 um (BD Biosciences, Rockville, MD, EUA) foram utilizados para este ensaio. As inserções foram pré-revestidas durante a noite com 5 ug /cm

2 fibronectina a 4 ° C e equilibrada com água durante 2 horas a 37 ° C antes da utilização. As células tripsinizadas foram colhidas, contadas, e 5 × 10

4 células foram ressuspensas em meio isento de soro de 250 ul. A câmara superior do inserto foi cheio com a suspensão de células, ao passo que 750 ul de meio contendo 10% de FBS foram adicionados ao fundo de cada poço. UROsta células foram deixadas migrar durante 16 horas num ambiente humidif içado a 37 ° C com 5% de CO

2. Após a migração, as células foram removidas da superfície superior da membrana, limpando-o com um cotonete húmido. A superfície inferior das membranas foram coradas utilizando o kit de coloração Hema-3 (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, EUA). Uma vez que a coloração foi terminado as membranas foram lavadas em água destilada para remoção de manchas em excesso e seco ao ar durante a noite. migração por cento ou invasão foi calculado por contagem e a média do número de células invadidas em 10 campos aleatórios de vista a uma ampliação de 40 vezes, dividida pela área do campo de visão do microscópio e depois multiplicado pela área da pastilha de Transwell. Em seguida, dividir o número previamente calculado ao número de células semeadas por último e multiplicar por 100 para obter uma percentagem. Esta experiência foi realizada de forma independente por três vezes em duplicata.

celular invasão ensaio

O Sistema Insert BD BioCoat Matrigel Invasion câmara de cultura celular contendo 8 mm PET membrana (BD Biosciences) com uma fina camada de MATRIGEL membrana basal da matriz foi utilizado para este ensaio. As células tripsinizadas foram colhidas, contadas e ressuspensas a 5 x 10

4 células /ml em meio isento de soro. A câmara superior recebeu 500 ul de suspensão de células, enquanto que 750 ul de meio RPMI com 10% de FBS foi adicionado ao poço. As células foram deixadas a invadir durante 16 horas num ambiente humidif içado a 37 ° C com 5% de CO

2 antes da remoção de células a partir da superfície superior com uma cotonete húmido. As membranas foram coradas utilizando o kit de coloração Hema-3 (Thermo Fisher Scientific) e a percentagem de invasão foi calculada tal como descrito na secção Ensaio de migração celular. Esta experiência foi realizada de forma independente três vezes em duplicado.

luciferase duplo ensaio

UMUC3 células foram semeadas em placas de 6 poços a 0,3 × 10

6 células /poço, em seguida, transfectadas transientemente dentro 24 horas usando X-tremeGENE HP DNA reagente de transfecção (Roche Applied Science) com 4 g de 3 × forkhead elemento de resposta (FHRE) construção repórter (Addgene plasmídeo # 1789) e 0,1 ug pBind Renilla vetor de controle luciferase (Promega, Madison, WI, EUA). As células transfectadas foram incubadas durante 24 horas em um ambiente humidificado a 37 ° C com 5% de CO

2. As células foram então privadas de soro durante a noite e tratadas com controlo de veículo (acetato de metilo, Sigma-Aldrich) ou 1 uM U46619 (Cayman Chemical) durante 30 ou 120 minutos. Seguindo células de tratamento foram lavadas duas vezes com PBS e colhidas em Tampão de Lise Repórter (Promega). A luminescência foi medida utilizando um luminómetro de microplacas Veritas (Turner BioSystems, Sunnyvale, CA, EUA) em 20 ul de cada amostra durante 10 segundos depois de cada injecção de 50 ul de Reagente de Ensaio de Luciferase II, em seguida, 50 ul de parada e brilho. A expressão média luciferase Firefly foi ajustada a expressão total de luciferase proteína e controle de vetores Renilla, e em seguida normalizada para o controle do veículo. Os resultados representam a actividade percentual média de três experiências independentes realizadas em duplicado, estudante

t

-Test (*) p .

Fracionamento

células UMUC3

Nuclear /celulares citoplasmática 0,05 foram privadas de soro durante a noite, em seguida, pré-tratados com indometacina 1 uM (Cayman Chemicals) durante 10 minutos para reduzir endógena

2 sinalização TXA. As células foram tratadas com veículo ou U46619 1 uM durante 5, 30 ou 120 minutos. As células foram tripsinizadas, recolhidas, e lavadas duas vezes com PBS. O fraccionamento foi realizado utilizando o Kit Pierce NE-PER nuclear e citoplasmática da extracção (Thermo Fisher Scientific) seguindo o protocolo do fabricante. Extratos foram analisados ​​por Western blot.

Immunoprecipitation

Imunoprecipitação de FOXO3 de UMUC3 células foi realizada utilizando o kit IP /Co-IP NHS-linked (Thermo Fisher Scientific) seguindo o protocolo fabricantes. Resumidamente, as células foram cultivadas UMUC3 a 80% de confluência em placas de 10 cm, e depois colocadas em meio isento de soro durante 24 horas em um ambiente humidificado a 37 ° C com 5% de CO

2. As células foram então tratadas com controlo de veículo (acetato de metilo, Sigma-Aldrich) ou 1 uM U46619 (Cayman Chemical) durante 30, 60, ou 120 minutos. Seguintes células de tratamento foram lavadas uma vez com PBS (-Ca, Mg) e colhidas em tampão gelado IP lise /lavagem suplementado com inibidor de protease cocktail livre de EDTA e cocktail inibidor PhosSTOP (Roche). lisado recolhida, então centrifugada para remover os detritos celulares e determinada a concentração de proteína utilizando o kit de ensaio de proteína BCA (Thermo Fisher Scientific). As esferas magnéticas activada por NHS, foram agitadas e 25 ul de suspensão foi transferido para tubos de 1,5 mL por reacção de IP. Os tubos foram colocados no íman e solução de armazenamento foi descartado, e, em seguida, lavou-se com HCl mM gelado 1 e suavemente agitada em vórtex durante 5 segundos. As esferas foram recolhidas no suporte magnético e o sobrenadante descartado.

A solução de anticorpo foi preparada por diluição de duas FOXO3 ug (Santa Cruz Biotechnology) e a fracção de imunoglobulina de coelho de controlo negativo (em fase sólida absorvida) (Dako, Carpinteria, CA , EUA) a uma concentração final de anticorpo ug 2 em 100 uL de tampão de borato de 0.067M. Adicionaram-se 100 ul de solução de anticorpo preparada para as esferas activadas, suavemente agitada em vórtice, e incubou-se em uma plataforma rotativa durante 60 minutos à temperatura ambiente. As reacções foram agitadas a cada 10 minutos durante a incubação a assegurar as esferas permaneceram em suspensão. As esferas foram recolhidas e o sobrenadante foi descartado. esferas lavadas duas vezes com tampão de eluição, vórtex os tubos de cada lavagem para remover o anticorpo não ligado covalentemente. tampão de têmpera foi adicionado aos grânulos e incubados numa plataforma rotativa durante 60 minutos à temperatura ambiente. As esferas foram recolhidas em suporte magnético e descartado o sobrenadante. Preparado e adicionou-se 0,5 mL de tampão de borato modificado para cada IP e misturou-se suavemente por vórtice, em seguida, os grânulos foram recolhidos em suporte magnético e o sobrenadante descartado. As reacções foram lavadas duas vezes com tampão de lise /lavagem de IP, em seguida, incubou-se cada reacção de IP com 100 ug de lisado em volume final de tampão de lise de 500 /ul de lavagem IP suplementado com inibidores de protease e fosfatase cocktail durante a noite (entre 14-18 horas a 4 ° C sobre um rotor. as contas foram agitadas a cada 15 minutos a primeira hora, para assegurar os grânulos ficado em suspensão. Após a incubação de antigénio as esferas foram recolhidas, lavadas duas vezes com tampão de lise IP /lavagem e, em seguida, transferido para um novo tubo de 1,5 mL. esferas lavadas com água ultrapura (pH 7,0), em seguida, colocado no suporte magnético e rejeitado o sobrenadante. as proteínas foram eluídas a partir das pérolas com tampão de eluição de pH baixo (pH 2,0) duas vezes e neutralizou-se com Tris-HCl a pH 8,5. proteínas eluídas foram então analisados ​​por transferência de Western .

a análise estatística

resultados contínuas foram comparados entre condições usando um estudante de duas amostras de dois lados

t

-teste. Experiências que contenham mais de duas variáveis ​​foram comparadas usando um one-way ANOVA seguido de um teste post-hoc de Tukey. Um valor de P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Knockdown de FOXO3 Aumenta urotelial migração e invasão

Nós relatado anteriormente um papel para o receptor TPβ em urotelial. migração, invasão e transformação maligna [3], [14]. FOXO3 expressão reduzida em pacientes que também tem sido associada com a capacidade de invasão do cancro urotelial [30]. Para determinar se FOXO3 inactivação seria suficiente para induzir um fenótipo maligno independente de TPβ, TPβ endógena baixo linhas celulares que expressam UROsta e SVHUC (previamente determinada [14]) foram estavelmente transfectadas com FOXO3 específica shRNA (Figura 1A). células transfectadas FOXO3-shRNA reduzidas a expressão da proteína FOXO3 sobre uma metade em comparação com mexidos (SCR) -shRNA observados por Western blot e validados por análise do alvo a jusante de MnSOD (Figura 1A). Em comparação com células SCR-shRNA knockdown de expressão FOXO3 resultou em um aumento de 39% e 114% na migração, bem como um aumento de 63% e 18% na invasão de células de SV-HUC e UROsta, respectivamente, (P 0,05, figura 1B-C). Uma vez que a ausência de FOXO3 foi suficiente para induzir um fenótipo maligno de células uroteliais não transformadas imortalizadas, examinámos o efeito de sobre-expressão em TPβ inactivação FOXO3. células SV-HUC e UROsta transfectadas com TPβ apresentado um aumento de 0,5 vezes na expressão basal da proteína pFOXO3-S294 inactiva (Figura 1D-E).

(A) transferência de Western de lisados ​​de células inteiras a partir de SV células -HUC e UROsta estavelmente transfectadas com FOXO3-shRNA ou controlo mexidos (scr-) shRNA imunologicamente para FOXO3 total e seu alvo a jusante conhecido MnSOD. a-tubulina foi aplicado como controlo de carga. Blots apresentados são representativos de três experiências individuais e números representam as proporções médias de FOXO3 para ácido a-tubulina. Rácios quantificadas utilizando Imagem Estúdio Lite Ver.3.1. knockdown e de controlo clones SV-HUC e UROsta FOXO3 foram semeadas em inserções revestidas com fibronectina ou Matrigel e deixadas migrar (B) ou invadir (C) durante 16 horas. Knockdown de FOXO3 aumento SV-HUC e migração de células UROsta (39% e 114%) e invasão (63% e 18%, respectivamente) em comparação com SCR-shRNA. Os dados representam três ensaios independentes realizados em duplicado e expressa como a média ± SEM. A significância foi determinada com um dois-amostra de dois lados

t

-teste, (* = P 0,05, n = 3) em relação ao controle scr-. (D) A sobre-expressão de GFP em células etiquetadas TPβ UROsta SVHUC e aumenta a expressão basal pFOXO3-S294 (E) em comparação com controlo de vector (n = 3). Os números representam as proporções médias de pFOXO3-S294 para FOXO3. Rácios quantificadas utilizando Imagem Estúdio Lite Ver.3.1. [UA] = unidades arbitrárias.

Efeitos do TP Agonist Estimulação em FOXO3 fosforilação, Localização, e transcricional Atividade

Para demonstrar TXA

2 de sinalização está envolvido na regulação FOXO3, o estado de fosforilação de FOXO3 e o seu regulador conhecida ERK foram examinados em UMUC3 células após estimulação agonista U46619 TP (Figura 2A). O agonista TP fosforilação mediada por ERK em T202 /Y204 foi significativamente aumentada (~ 1 vezes) 15 e 30 minutos após a estimulação (Figura 2A e C). De modo correspondente, um aumento significativo na pFOXO3-S294 foi observada 15 (cinco vezes), 30 (7 vezes), e 60 (3,5 vezes) minutos após a estimulação agonista TP (Figura 2A-B). Tratamento de UMUC3 células com o pinano antagonista TP (PTXA

2) ou inibidor de ERK (U0126) atenuou a U46619 efeitos da ERK ativado e pFOXO3-S294 (Figura 2D-I) mediada.

(A) UMUC3 células foram tratadas com 1 uM U46619 durante os tempos indicados. Os lisados ​​celulares foram analisados ​​por imunotransferência por ERK tanto total e fosforilada e FOXO3. GAPDH serviu como controle de carga. As manchas foram quantificadas e proporções para (B) pFOXO3-S294 para FOXO3 e (C) pERKT202 /Y204 para ERK1 /2 foram representadas graficamente utilizando o GraphPad Prism 5. UMUC3 células pré-tratadas durante 15 minutos com (D) antagonista de TP 2 uM pinano (PTXA

2) ou (L) de 10 uM de inibidor de ERK (U0126) atenuou a activação da ERK e a fosforilação de FOXO3 após o tratamento com 1 U46619 uM durante 30 minutos. Os lisados ​​celulares foram imunotransferidas tanto para ERK total e fosforilada e FOXO3. ácido a-tubulina serviu como controlo de carga. Os gráficos representam razões para (E e I) quantificada pFOXO3-S294 para FOXO3 e (F e G) pERKT202 /Y204 para ERK1 /2 foram representados graficamente. A significância foi determinado para todos os borrões quantificados, usando uma medida repetida One-way ANOVA com o teste post-hoc de Tukey. P . 0,05

Os efeitos da estimulação agonista TP sobre a atividade transcricional FOXO3 foram examinadas por um ensaio de luciferase duplo. UMUC3 células foram transfectadas transientemente com o elemento de resposta forkhead (FHRE) construção repórter de luciferase de pirilampo e Renilla vector de controlo, antes do tratamento com veículo ou agonista TP. actividade transcricional FOXO3 diminuiu significativamente em 36% e 44% aos 30 e 120 minutos, respectivamente, após a estimulação agonista de TP em relação ao veículo de controlo (Figura 3A).

células UMUC3 (A) transfectadas transitoriamente com 3 × forkhead elemento de resposta (FHRE) construção repórter e Renilla vetor de controle luciferase foram tratados com U46619 1 uM para 30 ou 120 minutos e resultou em diminuição da atividade transcricional FOXO3. A expressão média luciferase Firefly foi ajustada a expressão total de luciferase proteína e controle de vetores Renilla antes da normalização para o controle do veículo. Os resultados representam a atividade média cento luciferase de três experiências independentes realizadas em duplicado. * P 0,05, ANOVA com o teste post-hoc de Tukey. (B) As células foram privadas de soro UMUC3 dia para o outro e pré-tratado durante 15 min. com 1 jiM indometacina antes do tratamento com veículo ou um U46619 | iM durante 5, 30 ou 120 minutos. As células foram submetidas a fraccionamento nuclear e citoplasmática e as proteínas foram analisadas por transferência de Western. α-tubulina e Lamin-B1 serviram como controle de carga para as frações citoplasmáticos e nucleares, respectivamente. (C) Densitometria de borrões mostrando estimulação agonista prolongado aumento da proteína FOXO3 citoplasmático e aumento de proteínas pFOXO3 nuclear em comparação com controlos de veículo. A significância foi determinado para todos os borrões quantificados, usando uma medida repetida One-way ANOVA com o teste post-hoc de Tukey. P . 0,05

Com base na cinética de fosforilação de FOXO3, foi examinada a distribuição celular da FOXO3 UMUC3 em células tratadas com veículo ou agonista TP para 5, 30, ou 120 minutos. fracções de proteína nuclear e citoplasmática foram analisados ​​por Western blot (Figura 3B) e as densidades da banda foram quantificados usando o Image Estúdio Lite Ver 3.1 (Figura 3C). UMUC3 células estimuladas com agonista TP apresentou um aumento inicial na FOXO3 nuclear que também foi associada com um aumento em nuclear pFOXO3-Ser294 (Figura 3C). estimulação prolongada resultou num aumento significativo na FOXO3 total no citoplasma (Figura 3C).

estimulação TP aumenta a expressão SIRT1, desacetilação de FOXO3, e afecta as expressões alvo FOXO3

O efeito de estimulação U46619 sobre os níveis de p27 bem caracterizado alvos FOXO3 expressão

KIP1, MnSOD, e Bim foram analisados ​​por Western blot (Figura 4A). células UMUC3 estimulados com U46619 para 30, 120 e 240 minutos observadas diminuiu p27

proteínas KIP1 e Bim e aumento da expressão da proteína MnSOD (Figura 4A). Uma vez que o padrão de expressão alvos FOXO3 se assemelhava ao padrão observado após a sobre-expressão da histona deacetyltransferase SIRT1 [21], foi investigado o efeito da estimulação U46619 sobre a expressão SIRT1. UMUC3 células estimuladas com agonista TP mostraram aumento da expressão de SIRT1 e a diminuição da expressão de p300 em comparação com controlo de veículo (Figura 4B-C). Para determinar se a expressão aumentada em SIRT1 UMUC3 células estimuladas com agonista TP estado afectada FOXO3 acetilação, FOXO3 foi imunoprecipitada a partir de células UMUC3 tratados com veículo ou U46619, e imunotransferidas para os resíduos de lisina acetilada. A estimulação de células UMUC3 com U46619 para 120 e 240 minutos, mostrou uma redução de 48% e 70% em FOXO3 acetilado, respectivamente (Figura 4D-E).

células (A) UMUC3 tratados com veículo ou U46619 1 uM durante 30, 120, e 240 minutos. lisados ​​celulares foram recolhidos e analisados ​​por Western blot para expressão FOXO3 total e jusante metas p27

KIP1, MnSOD e Bim. (B) A expressão da proteína de p300 e SIRT1 em lisados ​​celulares mesmos. α-tubulina serviu como controlo de carga. valores (C) quantificados de borrões de três experimentos independentes são representados graficamente. (*) Indica p 0,05, ANOVA one-way, em comparação com o tempo 0 para cada relação Target. (D) O aumento da expressão de SIRT1 mediado por U46619 em UMUC3 células correspondeu à diminuição FOXO3 acetilada. FOXO3 total foi imunoprecipitada a partir de células UMUC3 carência de soro tratados com veículo ou U46619 1 uM durante 30, 120, ou 240 minutos. proteínas eluídas foram analisadas por Western blot com anticorpos contra resíduos de lisina acetilados e FOXO3. Blots são representativos de três experiências independentes. As manchas foram quantificadas e proporções para (E), lisina acetilada (acetil-K) foram representadas graficamente para FOXO3. A significância foi determinada utilizando medidas repetidas ANOVA com o teste post-hoc de Tukey. P . 0,05

ERK mutantes resistentes FOXO3

3A Redução agonista TP Mediated migração e invasão

células UMUC3 foram estavelmente transfectadas com um GFP-vector ou mutante GFP-FOXO3

3A construto no qual todos os três resíduos de fosforilação de ERK foram substituídos por resíduos de alanina para imitar um estado não fosforilado ou activa (Figura 5A). Para determinar se U46619 fosforilação mediada por ERK de FOXO3 afecta a migração celular e invasão, as células transfectadas de forma estável foram deixadas migrar e invadem a seguir à estimulação com veículo ou U46619. As células GFP-vector de controlo, resultou num aumento de 2 vezes na migração celular e invasão com estimulação U46619 em comparação com controlo de veículo, enquanto que a expressão da GFP-FOXO3

proteína 3A reduzida U46619 migração mediada e invasão (Figura 5B-C) .

(a) GFP-FOXO3

3A ou EGFP-C

2 (Vector) foi estavelmente transfectado em células UMUC3 e expressão FOXO3 mutante foi confirmada por immunoblotting para GFP. α-tubulina serviu como controlo de carga. As células foram semeadas em inserções revestidas com fibronectina para a migração ou Matrigel para invasão em meio isento de soro contendo 1 uM U46619 e colocados em cavidades que continham meio completo com U46619 1 uM. As células foram deixadas migrar (B) durante 8 horas ou invadir (C) durante 16 horas. A significância foi determinada com um dois-amostra de dois lados

t

-teste, (* = P 0,05, n = 3) em relação ao controle GFP-vector. (D) As células foram pré-tratadas com UMUC3 10 uM U0126 durante 15 minutos antes da estimulação com U46619 1 uM e deixadas migrar durante 16 horas. Os dados representam três ensaios independentes realizados em duplicado e expressa como a média ± SEM. A significância foi determinada com um One-way ANOVA com o teste post-hoc de Tukey. P . 0,05

Para demonstrar ainda mais a importância da sinalização de ERK em TXA

2 mobilidade celular mediada, nós pré-tratados com o inibidor de ERK U0126 (10 uM) durante 10 minutos antes da medição da efeito sobre a migração mediada por U46619.