Abstract
O foco deste estudo é os efeitos anti-câncer de
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haste (CTS) extrair em células de câncer do colo do útero. O efeito de CTS sobre a viabilidade celular foi investigada em células de cancro cervical positivo de HPV-e queratinócitos normais humanos HaCaT. CTS mostrou efeitos citotóxicos significativos dependentes da dose em células de cancro cervical. No entanto, não houve qualquer efeito citotóxico de CTS em queratinócitos HaCaT em concentrações de 0,125-0,5 mg /ml. Com base neste efeito citotóxico, foi demonstrado que a apoptose induzida por CTS-se regulando os oncogenes E6 e E7 virais. A apoptose foi detectada por coloração com DAPI, anexina V-FITC coloração /PI, análise do ciclo celular, Western blotting, RT-PCR, e JC-1 coloração em células de cancro do colo do útero SiHa. Os níveis de moléculas via extrínseca, tais como Fas, receptor de morte 5 (DR5) e relacionado com TNF-ligando indutor de apoptose (TRAIL) Expressão de ARNm foram aumentadas por CTS. Além disso, o tratamento CTS activado /caspase-8 e a clivagem de poli (ADP-ribose) polimerase de caspase-3 (PARP). No entanto, o potencial de membrana mitocondrial e expressão níveis de moléculas via intrínseca, tais como Bcl-2, Bcl-xL, Bax, e citocromo C não foram modulados por CTS. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a apoptose induzida CTS através da activação da via extrínseca, mas não a via intrínseca, em células de cancro do colo do útero SiHa. Estes resultados sugerem que CTS pode ser usado como um agente de modulação no cancro do colo do útero
citação:. Kwon S-B, Kim H-J, Yang JM, Lee H-P, Hong JT, Jeong H-S, et al. (2016)
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Stem Extract induz apoptose via extrínseca via em células SiHa câncer cervical. PLoS ONE 11 (3): e0150235. doi: 10.1371 /journal.pone.0150235
editor: Yi-Hsien Hsieh, do Instituto de Bioquímica e Biotecnologia, TAIWAN
Recebido: 24 de novembro de 2015; Aceito: 10 de fevereiro de 2016; Publicação: 09 de março de 2016
Direitos de autor: © 2016 Kwon et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada pelo programa básico (2015R1A2A2A09001137), da Fundação Nacional de pesquisa da Coreia (NRF), https://www.nrf.re .kr /nrf_eng_cms. D. Y. Yoon foi apoiado parcialmente pelo Programa Centros de Pesquisa (2012-0006686) Prioridade. Os autores são gratos a Pharma Teksol e Chungcheongbukdo Bio CS por seu apoio intelectual e financeiro deste projecto. Não houve financiamento externo adicional recebida para este estudo
Conflito de interesses:. Autor Eun Suk Kim é empregado por uma empresa comercial, Chungcheongbukdo Bio CS, ea empresa fornece apoio na forma de salário para ela. No entanto, a empresa não tem qualquer papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. O papel específico deste autor é articulada na seção “autor contribuições ‘
Abreviaturas:. HPV, vírus do papiloma humano; CTS,
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-tronco; DR, receptor de morte; TRAIL, ligando indutor de apoptose relacionado com TNF; PARP, poli (ADP-ribose) polimerase
Introdução
O câncer cervical é uma das doenças mais comuns que afetam as mulheres em todo o mundo e continua a ser uma alta causa de mortalidade entre as mulheres nos países em desenvolvimento [1-2 ]. Os dados epidemiológicos e clínicos sugerem que a infecção com alto risco tipos de vírus do papiloma humano (HPV), tais como os tipos 16 e 18, desempenha um papel importante na etiologia multifactorial de cancro [3] cervical. oncoproteínas de HPV de alto risco E6 e E7 desempenham papéis importantes na manutenção do crescimento de células de cancro do colo do útero. Oncoproteínas E6 e E7 inactivar proteínas supressoras de tumor p53 e pRb, respectivamente [4]. HPV de alto risco oncoproteína E6 associa e degrada a p53, enquanto a proteína HPV E7 concorre com E2F para a proteína do retinoblastoma (pRb) sítios de ligação [5].
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é uma árvore de folha caduca que pertence à família
Moraceae
que é distribuído principalmente na Coreia, China e Japão. Toda a
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planta tem sido explorada como um importante remédio popular para o cancro na Coreia durante as últimas décadas, ao mesmo tempo que também foi usado como um medicamento tradicional para a cura de neurite e inflamação em outras partes da Ásia [6]. Além disso, vários efeitos de
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extracto foram relatados, incluindo a actividade antioxidante [7] e efeitos inibitórios sobre óxido nítrico sintase [8]. No entanto, os efeitos anti-câncer do extrato do caule de
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em células de câncer do colo do útero não foram investigados.
Assim, os objetivos deste estudo foram investigar a atividade anti-câncer do
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haste (CTS) extrair em células de câncer cervical HPV-positivos e investigar os mecanismos apoptóticos de CTS. Aqui, nós relatamos que o tratamento CTS causa apoptose através da via extrínseca, bem como através da repressão de HPV-16 oncoproteínas E6 e E7 e alteração dos níveis de proteína de p53 e p-pRb.
Materiais e Métodos
Reagentes e anticorpos
CellTiter 96 AQ
ueous Uma solução de células Ensaio de Proliferação de Reagente [MTS, 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio] foi adquirido a Promega (Madison, WI, EUA). iodeto de propídio (PI) e 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) mancha foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). NE-PER nuclear e citoplasmática Extracção Os reagentes foram adquiridos a partir de Pierce (Rockford, IL, EUA). Os anticorpos específicos para a PARP, da caspase-3, caspase-8, a p53, Bcl-2, Bcl-xL, Bax, Bid, pRb, p-pRb, e citocromo C foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EUA). O IgG anti-coelho de peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpo secundário e o anticorpo secundário IgG conjugado com HRP anti-rato foram adquiridos a Millipore (Billerica, MA, EUA). Os anticorpos específicos para p27, p21, e gliceraldeído-3-desidrogenase phospahte (GAPDH) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). JC-1 (5,5 ‘, 6,6′-tetracloro-1,1′, 3,3’-tetraetil cloreto benzimidazolycarbocyanine) foi adquirido a partir de Enzo (Farmingdale, Nova Iorque, EUA). Geral inibidor da caspase-Z-VAD-fmk e caspase-8 IETD-inibidor Z-fmk foram adquiridos a partir de R D systems (Minneapolis, MN, EUA). O Kit FITC-anexina V Detecção de apoptose I foi comprado de BD Biosciences (San Jose, CA, EUA).
métodos da extração
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haste (CTS) extrato foi comprado de Coreia do extrato vegetal banco (KPEB), Coreia do Instituto de Pesquisa de Biociências e Biotecnologia (KRIBB) (Ochang, Chungbuk, Coreia). Em resumo, a haste seca de
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foi lavado com água estéril e sujeita a extracção com metanol (MeOH) a 30 ° C durante 3 dias. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida para se obter um extracto em bruto, tal como descrito em um relatório anterior [9].
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)
O extracto foi dissolvido em metanol ( grau HPLC) e filtrada através de um filtro de seringa de 0,45 um (Millipore, Billerica, MA, EUA) antes de HPLC (sistema de ACME 9000, Younglin, Anyang, Coreia) análise. As fases móveis foram de 0,1% (v /v) de ácido acético em água (A) e 0,1% (v /v) de acetonitrilo em ácido acético (B). O sistema de gradiente de solvente foi como se segue: 92: 8 (%, v /v) A: B durante 2 minutos, 90:10 (%, v /v) A: B durante 27 min, 70:30 (%, v /v) a: B durante 50 minutos, reduziu-se para 10% de a em 51 minutos, 0: 100 (%, v /v) a: B durante 60 min, e, finalmente, 92: 8 (%, v /v) a: B a 70 min. A taxa de fluxo foi de 1 mL /min. O volume de injecção foi de 20 ul. O detector de UV foi operado a 280 nm. A separação foi realizada numa coluna ODS (5 um, 4,6 x 250 mm, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA).
cultura celular
HPV-16 positivo SiHa e CaSki células de cancro cervical foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EUA). As células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Hyclone Laboratories, Logan, UT, E.U.A.) contendo 10% (v /v) de soro inactivado pelo calor fetal de bovino (FBS; Hyclone Laboratories). As células foram incubadas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO
2/95% de ar com humidade saturada.
ensaios de viabilidade celular
A viabilidade celular foi avaliada através da redução do corante MTS ensaio, que mede a função respiratória mitocondrial. células de cancro cervical foram semeadas (12 × 10
4 células /mL) em 100 uL de meio /poço em placas de 96 poços, incubadas durante a noite, e tratados com várias concentrações de CTS, como indicado nas legendas das figuras, durante 24 h . A viabilidade celular foi calculado avaliando o metabolismo MTS como descrito anteriormente [10]. Em resumo, amostras de meio (100 uL) foram removidos e incubados com 100 ul de solução de mistura MTS-PMS durante 1 h a 37 ° C. absorção óptica foi medida a 492 nm utilizando um leitor de ELISA (Apollo LB 9110, Berthold Technologies GmbH Co. KG, Bad Wilbad, Alemanha).
foi observado DAPI coloração
morfologia nuclear
apoptose utilizando a coloração DAPI. células SiHa foram semeadas em lâminas de 2-poços e tratadas com as concentrações especificadas de CTS durante 24 h, após o qual as lâminas 2-cavidades foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em seguida, as células SiHa foram fixadas com paraformaldeído a 4% e coradas com solução de coloração DAPI. As lâminas 2 poços foram lavados com PBS e montadas em lâminas de microscópio com solução de montagem. As células coradas foram observadas utilizando microscopia de fluorescência (Olympus, Tóquio, Japão).
anexina V e iodeto de propídio coloração
células cancerosas do colo do útero (2,5 × 10
5 células /mL) foram semeadas em placas de cultura de 60 mm e incubadas durante a noite. As células foram tratadas com CTS durante 24 horas, recolhidas utilizando tripsina-EDTA, e lavou-se com PBS. Anexina V e coloração de PI foram realizadas utilizando o FITC-anexina V Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Os dados foram analisados por citometria de fluxo utilizando um instrumento FACSCalibur e o software CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA).
análises do ciclo celular por citometria de fluxo
O ciclo celular foi analisada por propídio iodeto de (PI) e coloração de citometria de fluxo. células SiHa (2,5 × 10
5 células /poço) foram semeadas em placas de cultura de 60 mm e tratadas com várias concentrações de CTS durante 24 h. As células foram colhidas com tripsina-EDTA e fixadas com 80% de etanol. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS frio e centrifugou-se, após o que os sobrenadantes resultantes foram descartados. O sedimento foi ressuspenso e coradas com PBS contendo 50 ug /ml de PI e 100 ug /ml de RNase A durante 20 min no escuro. teor de ADN foi analisada por citometria de fluxo utilizando um instrumento FACSCalibur e o software CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA).
quantitativa em tempo real da reacção em cadeia da polimerase
As células tratadas com CTS eram colhida. O ARN foi extraído utilizando um fácil-BLUE
TM Kit RNA total de extracção (Intron Biotecnologia, Sungnam, Coreia) de acordo com as instruções do fabricante, tal como relatado anteriormente [10]. produtos de ADNc foram obtidos utilizando M-MuLV da transcriptase reversa (New England Biolabs, Beverly, MA, EUA). PCR quantitativo em tempo real foi realizada com um protocolo de quantificação relativa usando Roter-Gene software série 6000 1,7 (Qiagen, Venlo, Holanda) e o SensiFAST
TM SYBR NO-ROX Kit (BIOLINE, Londres, Reino Unido). Os níveis de todos os genes alvo de expressão foram normalizados ao do gene GAPDH de limpeza. Cada amostra foi executado com os seguintes conjuntos de iniciadores: E6, 5′-GCA GCC CTT GAA TTA CCC AT-3 ‘(para a frente), 5′-CAG AGG TTG GAC AGG GAA GAA-3′ (reverso); E7, 5’-TGA AGG ACA TGG CTT AGT AGA G-3 ‘(para a frente), 5′-GGT GCA AGG GTC ACA GTG TT-3′ (inverso); TRAIL, 5’-AAG TTT GTC GTC GTC GGG GT-3 ‘(para a frente), 5′-TGG TGC AGG GAC TTC TCT CT-3′ (reverso); Fas, 5’-TGA AGG ACA TGG CTT AGA AGT- 3 ‘(para a frente), 5′-GGT GCA AGG GTC ACA GTG TT-3′ (reverso); DR5, 5’-CAG AGG GAT GGT CAA GGT CG 3 ‘, 5′-TGA TGA TGC CTG ATT CTT TGT GG-3′; e GAPDH, 5’-TGG GCT ACA CTG AGC ACC AG-3 ‘(para a frente), 5′-GGG TGT CGT TGT TGA AGT CA-3’ (reverso).
análise de Western blot
as células foram tratadas com as concentrações especificadas de CTS durante 24 horas, colhidas, lavadas com PBS, e centrifugado (1890 ×
g
, 5 min, 4 ° C). Os sedimentos celulares resultantes foram ressuspensos em tampão de lise contendo Tris 50 mM (pH 7,4), cloreto de 1,5 M de sódio, 1 mM de EDTA, 1% de NP-40, 0,25% de desoxicolato de sódio, 0,1% de dodecilsulfato de sódio (SDS), e uma protease cocktail inibidor. Os lisados celulares foram incubados em gelo durante 1 h e clarificado por centrifugação a 17010 ×
g
durante 30 min a 4 ° C. O teor de proteína foi quantificado utilizando um ensaio de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) e um espectrofotómetro de UV. Os lisados celulares foram separados por electroforese em gel de 10-12% de poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE). As proteínas foram transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF; Millipore, Billerica, MA, EUA), os quais foram bloqueados em 5% de leite seco não gordo dissolvido em tampão salino Tris contendo Tween-20 (2,7 M de NaCl, KCl 53,65 mM, 1 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,1% de Tween-20) durante 1 h à temperatura ambiente. As membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários específicos. Após a lavagem, as membranas foram incubadas com os anticorpos secundários (HRP anti-coelho, conjugado ou IgG anti-ratinho) durante 1 h à temperatura ambiente. Após a lavagem, as manchas foram analisadas usando-Oeste Zol Plus e um sistema de detecção de western blot (Intron Biotecnologia, Sungnam, Coreia do Sul).
nuclear e citoplasmática fraccionamento
As células tratadas foram CTS coletado, e fracionado NE-PER nuclear e citoplasmática de extracção Reagentes (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante.
Análise do potencial de membrana mitocondrial (MMP)
MMP (Δψ
m) foi avaliada por coloração de JC-1 e citometria de fluxo. células SiHa foram semeadas em placas de cultura de 60 mm (2,5 x 10
5 células /poço) e tratou-se com várias concentrações de CTS. As células foram colhidas com tripsina-EDTA e transferidas para tubos de 1,5 mL. JC-1 (5 ug /ml) foi adicionado às células e mistura-se até estar completamente dissolvido, após o que as células foram incubadas no escuro durante 10 min a 37 ° C em uma incubadora. As células foram centrifugadas (300 ×
g
, 5 min, 4 ° C), lavadas duas vezes com PBS e ressuspensas em 200 ul de PBS. As soluções foram divididas usando um instrumento FACSCalibur e analisados pelo programa CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). Todo o protocolo foi realizado à luz mínima.
silenciamento de expressões HPV16 E6 e E7 endógenas por siRNAs
O siRNAs de E6 e E7 e mexidos siRNA foram adquiridos de Dharmacon (Dharmacon, Lafayette, CO ). A sequência de ARNsi de E6 e E7 da sequência de siRNA foram usados como descrito no relatado anteriormente [11]. Para suprimir a transcrição dos genes endógenos de HPV16 E6 e E7, células SiHa foram transientemente co-transfectadas com os siRNAs sintéticos para HPV16 E6 e E7 ou um ARNsi nontargeting utilizando o reagente Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.
análise estatística
os dados são apresentados como a média ± SEM de pelo menos três experiências independentes. A significância estatística foi avaliada com o teste t de Student. *
p Art 0,05 ou **
p Art 0,005 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados
Identificação de compostos fenólicos em CTS
Foram identificados os componentes medicinais potenciais (Fig 1, Tabela 1) e um grande número de ácidos clorogênicos (Tabela 2) no extracto CTS usando HPLC. A Tabela 2 lista os componentes do extracto de CTS, que incluíam ácido clorogénico, (+) – catequina, ácido cafeico, ácido phloretic, ácido veratric, hesperidina, quercetina, e naringenina. O extrato CTS continha diversos ácidos fenólicos e eram ricas em ácido clorogênico (64,42 mg /g). O ácido clorogénico foi reportado ter anticancro e propriedades antioxidantes [12-15]. Quercetina, hesperidina, e outros ácidos fenólicos tais como o ácido cafeico, também foram relatadas exibem efeitos anti-cancro em vários tipos de cancro [16-18]. No entanto, estes compostos estavam presentes em baixas concentrações no extracto CTS.
Os dezassete tipos de composição o ácido fenólico da amostra foram analisados por comparação do espectro dos componentes da amostra e padrões combinados para criar uma curva padrão a partir de área do pico por componente para quantificar a quantidade de mudança. (A) Os dezassete tipos de compostos de ácido fenólico de referência. (B)
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haste (CTS) extrato. A análise por HPLC mostrou a presença de compostos que corresponde a oito 8 entre os 17 compostos padrão. A 5, 7, 11 picos representados ácido clorogênico, ácido caféico e ácido veratric, respectivamente.
CTS induz efeitos citotóxicos em células de câncer cervical e queratinócitos normais
os efeitos citotóxicos de STC foram avaliados em várias linhas de células, utilizando o ensaio MTS. linhas celulares de cancro do colo do útero e queratinócitos normais HaCaT foram tratados com várias concentrações e períodos de tempo (Figura 2). Como mostrado na Fig 2B, a viabilidade das células de cancro do colo do útero foi diminuída em uma dose e modo dependente do tempo por extracto CTS. A viabilidade das células CaSki HPV16-positivas foi reduzida em um tempo e dose-dependente pela maneira extracto CTS, mas a um grau menor do que a observada nas células SiHa HPV16-positivos. Além disso, CTS não teve nenhum efeito citotóxico em concentrações de queratinócitos HaCaT humanos normais de 0,125-0,5 mg /ml (Figura 2A). Por isso, decidimos realizar um estudo sobre a apoptose subjacente mecanismo induzida pelo extrato de CTS em células de câncer cervical SiHa.
(A) HaCaT, as células SiHa e CaSki (B) foram tratados durante 24-48 h com várias concentrações de extracto de CTS, após a qual a viabilidade celular foi investigada utilizando o ensaio de MTS. Resultados de * P 0,05 e ** P 0.005 foram considerados estatisticamente significativos. As células tratadas com CTS foram comparadas com as células de controlo.
CTS induz alterações morfológicas e apoptose em células SiHa
microscopia de contraste de fase revelou que a morte celular induzida CTS e alterações morfológicas células SiHa de uma forma dependente da dose, após um tratamento de 24 h (Figura 3A). a coloração DAPI foi usado para observar a condensação nuclear, um marcador de apoptose. condensação nuclear foi significativa e dependente da dose, aumentou nas células tratadas com CTS em comparação com a das células de controlo (Fig 3B e 3C). Anexina V-FITC /PI coloração é geralmente usado para detectar a apoptose e necrose. A apoptose foi ainda confirmada por anexina V-FITC e PI-coloração depois de um tratamento de 24 h com STC. As células SiHa tratados com CTS em concentrações de 0,125-0,5 mg /ml, durante 24 horas mostraram um aumento significativo da proporção de células em apoptose em comparação com a das células de controlo, indicando que a apoptose induzida por CTS. No entanto, não houve alterações no CTS tratados células HaCaT (Fig 3D).
(A) As imagens microscópicas de células SiHa tratados com CTS para 24 h. As fotografias foram tiradas por microscopia de contraste de fase a 100 × ampliação. (B) Fluorescência imagens microscópicas de células SiHa tratados com CTS durante 24 h. foram observadas a condensação nuclear e a contracção da cromatina. (C) Os dados sobre os núcleos apoptóticos de células DAPI manchadas inteiras foram resumidas como gráficos de barras. Resultados de *
p Art 0,05 e **
p Art 0.005 foram considerados estatisticamente significativos. (D) Após o tratamento com a concentração indicada de CTS durante 24 h, as células SiHa e HaCaT foram coradas com anexina V-FITC /PI.
CTS inibe a expressão E6 /E7 e regula a expressão de E6 /E7 de direccionamento factores anti-tumorais
oncoproteínas
E6 e E7 são conhecidos por causarem a degradação de p53 e pRb, respectivamente. Portanto, seria de esperar que a sub-regulação de oncogenes E6 e E7 para resultar na restauração de níveis de p53 e pRb [19-20]. Os níveis de expressão de HPV-16 de E6 e mRNA de E7 foi investigada por RT-PCR quantitativo. a expressão de ARNm de E6 foi diminuída em CTS tratada células SiHa em comparação com a das células de controlo não-tratados. Além disso, a expressão do mRNA de E7 foi também diminuída (figura 4A). O nível de expressão de p-pRb foi regulada para baixo, mas a expressão de pRb foi inalterada em células SiHa-tratados CTS (Figura 4B). CTS aumento dose-dependente do nível de expressão de p53, o que resulta em modulação de factores a jusante de p21 e p27. Como mostrado na Fig 4B, os níveis de expressão de p21 e p27 foram aumentadas de um modo dependente da dose por tratamento CTS como esperado.
os níveis de (A) de ARNm de E6 e E7 oncoproteínas como detectado por qRT-PCR. (B) as análises Western blot de pRb, p-pRb, p53, p21, e p27. células SiHa foram tratados com a concentração indicada de CTS para 24 h.
CTS inibe a progressão do ciclo celular e modula a factores relacionados com o ciclo celular
Para avaliar o efeito da CTS no ciclo celular progressão, examinámos estado do ciclo celular por citometria de fluxo. Nas experiências anteriores, os níveis de p53 e os genes a jusante de p21 e p27 de expressão foi aumentado após o tratamento com CTS (Figura 4B). Em comparação com as células de controlo não tratadas, células tratadas com CTS mostrou acumulação significativa e dependente da dose no sub-G1-fase (Figura 5B). No entanto, não houve mudanças significativas para as populações de células em G0 /G1, S e G2 /M fases seguintes do tratamento com CTS (Fig 5A).
(A) perfis de ciclo celular de CTS tratada SiHa células. (B) A percentagem de células na fase sub-G1. Resultados de **
p Art 0.005 foram considerados estatisticamente significativos. células tratadas com CTS foram comparadas com células não tratadas.
Os efeitos de CTS são independentes da via intrínseca
disfunção mitocondrial é o factor mais importante na via de apoptose intrínseca. Quando as mitocôndrias potencial de membrana entra em colapso, citocromo C é libertada para o citosol, após o que se forma o apoptossomo com Apaf-1 e caspase-9 [21]. Para medir mitocondrial membrana potencial colapso após o tratamento CTS, foi realizada JC-1 coloração e análise FACS. Como mostrado na Fig S1A, o pico de JC-1 não foi deslocada após o tratamento CTS. Além disso, as análises de Western blot mostrou que o tratamento CTS não alterou os níveis de expressão do factor pró-apoptótica Bax ou aqueles de factores anti-apoptóticos Bcl-2 e Bcl-XL. Além disso, o citocromo C não foi liberado para o citosol (Fig S1B). Assim, conclui-se que a amplificação do sinal apoptótico após o tratamento CTS é independente da sinalização através da via intrínseca da apoptose.
apoptose induzida por CTS é mediada através do receptor de morte sinalização
Como foi demonstrado que o via de apoptose intrínseca não estava envolvido na apoptose induzida por CTS, nós próxima focado na via de apoptose extrínseca. A via de apoptose extrínseca recebe sinais por meio da ligação das proteínas de ligandos extracelulares morte para receptores de morte pró-apoptóticos (DRS) [22]. A via extrínseca transmite sinais de ligandos extracelulares através de DRs pró-apoptóticas caspase para a maquinaria apoptótica [23]. Além disso, a poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) está envolvido na apoptose, bem como uma série de outros processos celulares. Nós investigamos os níveis de factores relacionados com a via extrínseca Trail, DR5, e Fas em células SiHa após o tratamento CTS (Fig 6A) de expressão. Nossos resultados mostraram que o tratamento CTS regula positivamente os níveis de mRNA de TRAIL, DR5, e Fas. os níveis de caspase-3 a expressão da proteína, da caspase-8, PARP, e Bid, foram clivados de uma forma dependente da dose por CTS (Figura 6B). Além disso, foram identificadas as caspases específicos envolvidos no mecanismo pró-apoptótica de CTS. células SiHa foram pré-tratados com inibidores de caspases, incluindo um inibidor da caspase geral e de um inibidor da caspase-8. Como mostrado na Fig 6C, o pré-tratamento com o inibidor de caspase geral Z-VAD-FMK antes CTS tratamento bloqueou significativamente a apoptose induzida por CTS. Um efeito inibitório semelhante na apoptose induzida por CTS foi produzido por caspase-8 IETD-inibidor Z-FMK. Estes resultados mostram que a caspase-3, caspase-8, e PARP são activados através da sinalização mediada por DR durante a apoptose induzida por CTS.
os níveis de (A) de ARNm de TRAIL, DR5 e Fas como detectado por qRT-PCR . (B) Análise de Western blot de factores relacionados com a via extrínseca. células SiHa foram tratados com a concentração indicada de CTS durante 24 h. (C) Análise de Western blot dos efeitos da CTS seguintes pré-tratamento com inibidor da caspase geral Z-VAD-FMK ou caspase-8 inibidor Z-IETD-FMK em células SiHa.
Down-regulação da E6 e genes E7 reforçada CTS apoptose induzida
Para investigar se a apoptose induzida por CTS seria afectada por níveis de E6 /E7, E6 /E7 siRNA foi transfectado e tratada com CTS. Apoptose proteínas de activação tal como caspase-3, caspase-8, e PARP foram clivados sob mais de E6 /E7 de siRNA a transfecção e tratamento de CTS (Figura 7). nível de expressão de p-pRb foi diminuída em E6 /E7 siARN transfectadas células SiHa em comparação com células de controlo transfectadas siRNA. No entanto, o nível de expressão de p53 não foi alterada (figura 7). Estes resultados mostram que CTS pode apoiar indução de apoptose através da regulação negativa de expressões E6 /E7 de RNAm.
A análise Western blot de factores relacionados com a apoptose após a transfecção de siRNA controle ou E6 /E7 alvo siRNA.
Discussão
o principal objetivo do nosso estudo foi confirmar a eficácia anti-câncer e mecanismos associados de CTS em células cancerosas cervicais humanos. CTS extrato inibiu a proliferação de células de câncer cervical em células SiHa e CaSki HPV-positivos. A eficácia citotóxica de CTS em células SiHa HPV-16 positivo foi ligeiramente melhor do que a sua eficácia em células CaSki (Figura 2). Este efeito pode ser devido ao facto de o número de cópias do genoma de HPV em células CaSki é maior do que a de células SiHa [24]. Esta constatação sugere que o número total de cópias de HPV nas células pode ter influenciado a sua susceptibilidade aos efeitos pró-apoptóticos de CTS [24]. Além disso, foi demonstrado que os níveis de expressão CTS regulada negativamente de oncogenes E6 e E7 em linhas celulares HPV-16 positivo. Como esperado com base no nível de expressão de E6 diminuiu, confirmou-se que a expressão de p53 foi aumentada de uma maneira dependente da dose. Curiosamente, a diminuição da expressão de E7 não estava associado com a expressão de pRb alterada; No entanto, p-pRb foi diminuída de um modo dependente da dose por CTS (Figura 4B). Este resultado lembrado relatórios anteriores que demonstram que a inibição de E7 resultou na fosforilação de pRb reduzida sem alterar a expressão da proteína pRb geral [20].
CTS extracto contém vários compostos fenólicos (Fig 1). O ácido clorogénico está presente na concentração mais elevada entre eles. O ácido clorogénico foi reportado ter anticancerígeno, antioxidante, e efeitos antidiabéticos [14, 25-26]. Além disso, o ácido clorogénico é o segundo componente bioactivo importante no café após cafeína [25]. ácido clorogênico estimula o transporte de glicose no músculo esquelético L6 via ativação da AMPK, o que contribui para os efeitos benéficos para a diabetes [25]. Além disso, o ácido clorogénico é um antioxidante que pode retardar a libertação de glicose no sangue após uma refeição [26]. Além disso, o ácido clorogénico pode induzir danos no ADN celular e apoptose em células de cancro de pulmão, sem afectar os fibroblastos pulmonares normais [14]. No entanto, os efeitos anti-cancro de ácido clorogénico em células de cancro do colo do útero não têm sido exaustivamente investigadas. ácidos cafeico são encontradas em muitas plantas naturais [27] e foram mostrados para suprimir o crescimento do tumor por inibição da proliferação de células tumorais e aumento da actividade antioxidante [28]. Um estudo anterior mostrou que os ácidos cafeico proliferação, adesão e migração inibida pela A549 células de câncer de pulmão humanos e HT29-D4 células cancerígenas do cólon [29]. Além disso, a hesperidina, naringenina e quercetina foram relatadas exibem efeitos anti-cancro em vários tipos de células de cancro [16-17, 30-31].
A apoptose é mediada pelas vias intrínseca e extrínseca. A via intrínseca é mediada por permeabilização da membrana mitocondrial externa (MOMP), e a libertação de citocromo c das mitocôndrias para o citoplasma [32-33]. No citosol, o citocromo c induz a montagem do apoptossomo, que contém a proteína adaptadora Apaf-1 e iniciador de apoptose caspase-9 protease. Apoptossomo formação ativa a caspase-9, que ativa caspases efetoras [34]. A via extrínseca recebe sinais por meio da ligação de ligandos extracelulares de proteínas de DRs pró-apoptóticos localizados na superfície da célula [23]. Embora vários DRs foram descritos, que incidiu sobre Fas (CD95) e DR5 e os seus respectivos ligandos, tais como o ligando Fas (Fas L), e TRAIL [35]. DRs têm um domínio de morte intracelular que recruta proteínas adaptadoras e caspase-8 [36]. A ligação do ligando para a morte do DR resulta na formação de a-morte induzir sinalização complexo (DISCO), composto por o receptor de morte, a FADD e caspase-8 [37]. O DISC activa uma cascata de sinalização a jusante, resultando em apoptose [38-40]. Nós investigamos as vias metabólicas que estão envolvidos na apoptose induzida por CTS em células de câncer cervical SiHa. Apesar de factores relacionados com a via intrínseca não foram afetados pelo tratamento CTS (S1 Fig), os níveis de factores relacionados com a via extrínseca, como Fas, DR5, TRAIL, e caspase-8 expressão, foram afetados pelo tratamento CTS (Fig 6).
Os nossos resultados mostram que o CTS tem um efeito anti-câncer profunda contra as células cancerosas do colo do útero. Esta é a primeira demonstração da capacidade de CTS para inibir a expressão de HPV-16 E6 e E7 oncogenes, e para induzir a apoptose mediada pela via extrínseca em células de cancro do colo do útero. No entanto, novos estudos devem identificar os compostos específicos em CTS responsáveis por seus efeitos anticancerígenos.
Informações de Apoio
S1 Fig. Efeitos de CTS no potencial de membrana mitocondrial e a libertação do citocromo C em células de cancro do colo do útero.
SiHa (A) A diferença de cores JC-1 foi analisada por citometria de fluxo. JC-1 agregados (laranja) são uma característica das células saudáveis, enquanto JC-1 monómeros (verde) são uma característica de células em apoptose. (B) Análise de transferência de Western de factores anti-apoptóticos Bcl-2 e Bcl-xL, o factor pró-apoptótica Bax e citocromo C em células do cancro do colo do útero SiHa. células SiHa foram tratados com a concentração indicada de CTS para 24 h
doi:. 10.1371 /journal.pone.0150235.s001
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Reconhecimentos
Esta pesquisa foi apoiado pelo programa básico (2015R1A2A2A09001137), da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF). (https://www.nrf.re.kr/nrf_eng_cms). D. Y. Yoon foi apoiado parcialmente pela Prioridade Centros de Investigação Programa (2012-0.006.686).